I
DOKTORA TEZİ
Selçuk ULUSOY
ADANA İLİ PAMUK EKİM ALANLARINDA Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) POPULASYONLARININ NEONİKOTİNOİD GRUBU İNSEKTİSİTLERE KARŞI DİRENÇ DURUMUNUN BELİRLENMESİ
BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI
ADANA-2018
II
ADANA İLİ PAMUK EKİM ALANLARINDA Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) POPULASYONLARININ NEONİKOTİNOİD
GRUBU İNSEKTİSİTLERE KARŞI DİRENÇ DURUMUNUN BELİRLENMESİ
Selçuk ULUSOY
DOKTORA TEZİ
BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI
Bu Tez, .../…/2018 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği / Oy çokluğu ile Kabul Edilmiştir.
……… ……… ………..
Prof. Dr. Sadık DİNÇER Prof. Dr. Fatih MATYAR Prof. Dr. Gökhan CORAL
DANIŞMAN ÜYE ÜYE
……… ...………
Prof. Dr. Sevil TOROĞLU Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ
ÜYE ÜYE
Bu Tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında Hazırlanmıştır Kod No:
Prof. Dr. Mustafa GÖK Enstitü Müdürü
Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir.
Proje No: BAP-FDK-2016-5561
Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynakta yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
DOKTORA TEZİ
ADANA İLİ PAMUK EKİM ALANLARINDA Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) POPULASYONLARININ NEONİKOTİNOİD
GRUBU İNSEKTİSİTLERE KARŞI DİRENÇ DURUMUNUN BELİRLENMESİ
Selçuk ULUSOY
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI
Danışman : Prof. Dr. Sadık DİNÇER 2.Danışman : Prof. Dr. EKREM ATAKAN
Yıl: 2018, Sayfa: 117 Jüri : Prof. Dr. Sadık DİNÇER
: Prof. Dr. Fatih MATYAR : Prof. Dr. Gökhan CORAL : Prof. Dr. Sevil TOROĞLU
: Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ
Çukurova pamuk alanlarında yaygın bir şekilde bulunan ve toplanan Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) populasyonlarında neonicotinoid grubu insektisitlere (acetamiprid, imidacloprid, clothianidin, thiamethoxam) dayanıklılığının nedeni biyoanaliz, biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılarak ortaya çıkarılmaya çalışılmıştır. Denemede pamuk alanlarından toplanan yedi populasyon ve kontrol populasyonların biyoanaliz denemelerine göre probit analizi sonucunda en hassas ve dayanıklı populasyonlar sırasıyla Acetamiprid için Bahçe (RF (Direnç faktörü):1.54), Kürkçüler (RF:10.89); Imidaclorpid için Bebeli (RF:54.62), Kürkçüler (RF:206.55);
Thiametoxam için Yumurtalık (RF:5.78), Körkuyu (RF:65.72); Clothianidin için Körkuyu (RF:1.14), Bahçe (RF:38.35) olarak bulunmuştur. Enzim analizi istatistiki anlamda yüksek metabolik direnci ortaya cıkarmıştır. İnsektisitler içinde en yüksek enzim akitviteleri, karboksil esteraz enzimi Korkuyu populasyonunda 17,8 nM/dk/mg protein, glutatyon S-transferaz (GSTs) enzimi Bahce populasyonunda 142,3 nM/dk/mg protein ve Korkuyu populasyonunda 3,8 nM/dk/mg protein ile en yuksek monooksigenaz P450 enzim aktivitesi bulunmuştur. Moleküler çalışmalarda nikotinik asetilkolin reseptör (nAChR) β1 alt ünitesi RFLP enzim kesimlerinde mutasyona rastlanmamıştır. Bu çalışma, Türkiye’de neonicotinoidlere karşı A. gosyypii’de direnc gelişmesini ve bu direncin kırılması icin yeni yonetim stratejilerine ihtiyac olduğunu ortaya koymuştur.
Anahtar Kelimeler: Aphis gossypii, Neonicotinoid direnci, Pamuk, monooksigenaz
PhD THESIS
DETERMINATION OF NEONICOTINOID GROUP INSECTICIDE RESISTANCE OF Aphis gossypii glover (Hemiptera: Aphididae)
from COTTON grown AREAS in ADANA
Selçuk ULUSOY
ÇUKUROVA UNIVERSITY
INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPAERTMENT OF BIOTECHNOLOGY
Supervisor : Prof. Dr. Sadık DİNÇER 2 Supervisor : Prof. Dr. EKREM ATAKAN
Yıl: 2018, Sayfa: 117 Jury : Prof. Dr. Sadık DİNÇER
: Prof. Dr. Fatih MATYAR : Prof. Dr. Gökhan CORAL : Prof. Dr. Sevil TOROĞLU
: Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Biochemical and molecular methods was used to determine the resistance of the neonicotinoid group insecticides (acetamiprid, imidacloprid, clothianidin, thiamethoxam) in Aphis gossypii glover (Hemiptera: Aphididae) populations colected from Cukurova cotton fields. The lowest and highest resistance were determined at Bahçe (RF (Ressistant factor):1.54) and Kürkçüler (RF:10.89) for acetamiprid;at Bebeli (RF:54.62), Kürkçüler (RF:206.55) for Imidaclorpid; at Yumurtalık (RF:5.78), Körkuyu (RF:65.72) for Thiametoxam; at Körkuyu (RF:1.14), Bahçe (RF:38.35) for Clothianidin according to probit analysis of bioassay studies, respectively. While Kürkçüler and Körkuyu were most resistance, Bahçe and Yumurtalık were most susceptible populations. Enzyme analysis revealed statistically higher metabolic resistance. Maximum enzyme activities were 17.8, 142.3 and 3.8 nM/min/mg protein for carboxylesterase for in Korkuyu, for glutathione S-transferase in Bahce and for cytochrome P450 monooxygenase in Korkuyu, respectively. It wasn’t found mutation according to RFLP analysis of (nAChR) β1 subunit. This study revealed the development of resistance in A.gossypii to neonicotinoid insecticides in Turkey and the need for new management strategies to break this resistance.
Key words: Aphis gossypii, Neonicotinoid resistance, Cotton field, monooxigenase
Dünya nüfusunun hızlı artışı önemli bir problemdir. Dünya gıda ve tarım örgütü (FAO) raporlarına göre her yıl insanlara 15-20 milyon ton/yıl gıda maddesi gerekmektedir. Dünyanın yüzölçümü sınırlı olduğundan bu ihtiyacı karşılayacak üretim için yeni alanların tarıma açılması mümkün değildir. Mevcut alanlardan daha fazla üretim yapılabilmesi için tarım ilaçları bugün bütün dünyada kullanılmasından vazgeçilemeyecek maddeler olarak kabul edilmektedir.
Ülkemizde 12.198.917 kg (L/yıl) pestisid kullanılmış ve bunun 2.250.898 kg (L/yıl)’ ı insektisitlerdir. En çok kullanılan insektisidler Metamidophos, chlorphyrifos ethyl, parathion-methyl, dichlorvos, endosülfan, carbaryl ve azinphos- methyl dir (Delen ve ark, 2005). Herbisitler tarım ilaçları içinde % 47,5 'lik bir payla birinci sırayı almaktadır. Bunu % 29 ile insektisitler izlemekte, fungisitlerin ise % 17'lik bir payı bulunmaktadır. Herbisitler ve insektisitler kullanılan pestisitlerin % 70'inden daha fazla bir bölümünü kapsamaktadır (Ulusoy ve ark., 2017). Türkiye'de ilaç kullanımı daha çok polikültür tarımın yapıldığı Akdeniz ve Ege bölgelerinde yoğunlaşmaktadır (Anonymous, 2002). Bu kadar büyük bir oranda kullanım da beraberinde yıkıcı çevresel etkileri doğurmaktadır.
Zaman içerisinde kullanılan ilaç dozlarının etkisiz olması, ilaç doz ve uygulama sayılarının artmasına neden olmakta, bu durum çevre ve insan sağlığına olumsuz etkileri yanında hedef olmayan organizmaları da etkilemektedir. Pestisitlerin yaygın ve bilinçsiz kullanımından dolayı zararlılarda özel, davranışsal, yapısal, fizyolojik ve çapraz direnç gelişir. Bu dirence genetik yapıda meydana gelen mutasyonlar [Hedef Bölge (Target-Site)] ya da Esteras, Glutathion-S Transferaz, Monooxigenaz ve hidrolaz gibi detoksifikasyon enzimleri neden olur (Çakır ve Yamanel, 2005).
Çukurova Bölgesi’nin iklim koşulları çok sayıda kültür bitkisi çeşidinin üretimine imkan sağlamaktadır. Bu bitkiler üzerinde pekçok zararlı önemli kayıplara neden olmaktadırlar. Yaprakbitleri tarım sektöründe büyük bir sorundur.
neden olabilmektedir.
Pamuk yaprakbiti, Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) de yaprakbitleri içerisinde etkin zararlılardan birisidir. A. gossypii polifag bir tür olup çok geniş ve değişik konukçusu bulunmaktadır. Aphis gossypii üzerinde etkin pek çok doğal düşman olmasına rağmen en çok kullanılan mücadele yöntemi kimyasal mücadeledir. Aphis gossypii Glover önemli bir pamuk zararlısı olup mücadele edilmezse ürün zararını ciddi bir şekilde arttırmaktadır (Godfrey ve ark., 1997).
Güncel olarak afidlerin kontrolünde karbamatlı, organofosfatlı, neonikotinoid, pymetrozin diafenthiuron ve parafin yağlar kullanılmaktadır (InfoPest, 2008).
Avustralyada pamuk alanlarında bitkilerin büyüme periyotlarında A.gossypii’nin organofosfat (dimethoate ve omethoate) ve karbamat (primicarb) insektisitlerine direnci önemli oranda artığı gözlemlenmiştir (Herron ve ark., 2001). Bununla birlikte Avustralya gibi büyük pamuk üretici ülkelerde yaprakbitinin kontrolünde neonikotinoidler yaygın olarak kullanılmaktadır. Neonikotinoidlerin (1991’de keşfedildi) kullanıma başlamasıyla çeşitli türlere göre ciddi direnç artışı gözlenmiştir. Bemisia tabaci type B de 1000 kat bir artış söz konusudur (Nauen ve Denholm, 2005). Ülkemizde Akdeniz bölgesi pamuk agroekosistemi, tarım ilacı kullanımının en yoğun olduğu bölgemizdir. Bu durum agroekosistemde varolan dengeleri tamamıyla bozmuş, dolayısıyla ilaçlamalardan beklenen fayda sağlanamamaya başlamıştır. Ülkemizde özellikle pamuk agroekosistemi, diğer bütün ülkelerde olduğu gibi insektisit direnci problemi ile karşı karşıyadır.
Çukurova’da A.gossypii mücadelesinde sık kullanılan gruplardan biri neonicotinoidlerdir. Ülkemizde yoğun bir şekilde kullanılan kimyasalların beraberinde getirdiği direnç problemi ile ilgi son yıllarda pek çok çalışma yapılmaktadır. Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae)’ nin Adana ve Antalya popülasyonlarında pirimicarb ve demeton-S-methyle değişen düzeylerde duyarlılık belirlenmiştir (Velioğlu ve ark., 2008). Akdeniz bölgesi pamuk alanlarında Spodoptera littoralis’ in sentetik pyretroitlere Glutathion S trensferaz
yüksek saptanmıştır (Hadim ve Gürkan, 2007). Tetranychus urticae hassas ve dayanıklı bireyler arasında yapılan çapraz çalışmalar sonucu bifenthrin’e dirençta azalma belirlenmiştir. Monoxygenaz (P450) enzim aktivitesi ise dayanıklı ırkta yüksek belirlenmiştir (Ay ve Yorulmaz, 2009). Yapılan çalışmalara bakıldığında neonicotinoidlerle ilgili çalışmaların sınırlı olduğu görülmüştür.
Bu çalışmada Çukurova’da yaygın bir şekilde bulunan Aphis gossypii üzerine neonikotinoidlerin dayanıklılığının belirlenmesiyle ilgili bir çalışma yürütülmüştür. Çalışmada afidlerle mücadelede sık kullanılan neonicotinoid grubu insektisitlerin açık alanlarda direnç durumu biyoanaliz, biyokimyasal ve moleküler yöntemlerle araştırılmıştır. Denemelerde neonicotinoid grubundan acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thimetoxam, kullanılmış olup, LC50 değerleri belirlenmiştir. Bunun yanı sıra Acetylcolinesteras (EST), Gulutathion S-Transferas (GST) ve Sitokrom P450 monooxigenas aktiviteleri belirlenmiştir. Çalışmanın diğer bir hedefi de moleküler yöntemler kullanılarak neonicotinoidlere dayanıklılığın nicotinic acetylcholine receptörlerinin (nAChR) β1 alt ünitesi üzerinde RFLP enzim kesimleri yapılarak olası mutasyonların varlığına bakılmıştır.
Böylece Aphis gossypii’nin bölgedeki neonikotinoidlere direnç durumu belirlenmeye çalışılmıştır.
Yaprak daldırma metodunun kullanıldığı biyoanaliz çalışmalarında Kürkçüler, Körkuyu ve Durhasandede popülasyonlarının neonicotinoid insektisitlere karşı (Acetamiprid, Imidacloprid, Clothianidin, Thiamethoxam) diğer popülasyonlara göre LC50 ve LC90 değerlerinin en yüksek düzeyde seyrettiği, en hassas popülasyonların ise her etken maddede değiştiği görülmüştür.
Denemeye alınan etken maddeler karşılaştırıldığında; tüm insektisitler arasında popülasyonlara göre değişmekle birlikte beraber çapraz dayanıklılığın olduğu gözlemlenmiştir. Acetamiprid ve imidaclorpid uygulandığı Kürkçü ve Körkuyu popülasyonlarında maksimum LC50 değerleri elde edilmiştir. Bu iki popülasyonda bu ilaçlara yüksek çapraz direnç belirlenmiştir. Denemenin
ve AChE aktivitesi gösterirken, diğer popülasyonlar değişen oranlarda aktivite göstermiştir. Bu bakımdan popülasyonların toplandığı alanlarda daha önce ve hala organik fosforlu, klorlandırılmış hidrokarbon grubu insektisit ilaçların kullanıldığı ve afidlerin bu ilaçlar nedeniyle direnç geliştirdiği söylenebilir. Sitokrom p450 enzim aktivitesinin belirlendiği çalışmada enzim aktivitesi bakımından popülasyonlar arasında istatistiki olarak fark önemli bulunmuştur(p<0.05).
Körkuyu popülasyonu hassasa oranla daha fazla protein miktarıyla en yüksek aktiviteyi göstermiştir. Popülasyonlar arasında hassas haricinde en az esteraz aktivitesini Bebeli popülasyonu göstermiştir. Neonikotinoidli ilaçlara dirençlilik açısından P450 aktiviteleri biyoanaliz aktivitelerine paralellik göstermektedir. Yani en dirençli popülasyonlardan p450 aktiviteleri de hassasa oranla yüksek düzeyde bulunmuştur. Bu bakımdan popülasyonların toplandığı alanlarda neonikotinoidli ilaçların kullanıldığı ve afidlerin bu ilaçlara karşı direnç geliştirdiği görülmüştür.
Moleküler çalışmalarda nikotinik asit reseptörü geninde rastlanabilinen R81T mutasyonu RFLP metoduyla tanımlanmıştır. Sonuç olarak RFLP kesim sonucunda hassas ve toplanan populasyonlar arasında reseptör (nAChR) β1 alt ünitesinde yer alan D loop bölgesindeki R81T genine ait bir mutasyona rastlanmamıştır.
Başından beri desteğini esirgemeyen, yönlendirici fikirleri ile daima yol gösteren, sabrı ve anlayışıyla bana her zaman örnek olup yardımlarını esirgemeyen danışman hocalarım Sayın Prof. Dr. Sadık DİNÇER ve Prof. Dr.
Ekrem ATAKAN’a teşekkür ederim.
Çalışmamın deney aşamasında yaptıkları yardımlardan dolayı sayın, Arş.
Gör. Ali TOPRAK’a, Uzman Biyolog Esra Sündüz YİĞİTTEKİN’e Moleküler Biyoloji ve Genel Biyoloji Anabilim Dalı’nda yüksek lisans ve doktora yapan arkadaşlarıma teşekkür ederim.
Çalışmamın malzeme, deney ve arazi çalışmalarında beni destekleyen Biyolojik Mücadele Araştırma Enstitüsü Müdürlüğüne Müdürümüz Yüksek Ziraat Mühendisi Dr. Naim ÖZTÜRK’e ve emeği geçen tüm kurum personeli arkadaşlarıma teşekkür ederim. Ayrıca bölüm olanaklarından yararlanmamı sağlayan Biyoloji Bölüm Başkanlığı’na ve maddi desteklerinden dolayı TC. Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Tarımsal Araştırmalar ve Politikalar Genel Müdürlüğü’ne, Ç.Ü. Araştırma Fonu’na teşekkür ederim.
Hayatımın her aşamasında yanımda olan maddi ve manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen canım aileme, sonsuz sevgisiyle yanımda olan kız kardeşlerime ve her zaman sevgilerini kalbimde hissettiğim annem ve babama sonsuz teşekkür ederim.
Hayatım boyunca sevgisini ve manevi desteğini hep içimde hissedeceğim eşim Dilek ULUSOY’a ve varlıklarıyla neşe kaynağım olan kızım Beren ULUSOY ve oğlum Kerem ULUSOY’a çok teşekkür ederim.
ÖZ ... I ABSTRACT ... II GENİŞLETİLMİŞ ÖZET ... III TEŞEKKÜR ... VII İÇİNDEKİLER ... VIII ÇİZELGELER DİZİNİ ... XII ŞEKİLLER DİZİNİ ... XIV SİMGELER VE KISALTMALAR ... XVI
1. GİRİŞ ... 1
1.1. Pamuk Yaprakbiti Aphis gossypii ... 5
1.1.1. Aphis gossypii Yaşam Döngüsü ... 6
1.1.2. Aphis gossypii Tarafından Meydana Gelen Ekonomik Kayıplar ... 9
1.1.3. Aphis gossypii Mücadelesi ... 10
1.1.3.1. Kültürel ve Biyolojik Mücadele ... 10
1.1.3.2. Kimyasal Mücadele ... 11
1.1.4. Aphis gossypii İnsektisit Direnç Gelişimi Tarihçesi ... 13
1.2. Neonikotinoidler ... 15
1.2.1. Gelişim ve Yapı ... 15
1.2.2. Tarımsal ve Ekonomik Önem ... 17
1.2.3. Hedef Bölge ... 19
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ... 23
3. MATERYAL VE METOD ... 35
3.1. Materyal ... 35
3.2. Metot ... 35
3.2.1. Üretim Çalışmaları ... 35
3.2.1.1. Bitki üretimi ... 35
3.2.1.2. Aphis gossypii Populasyonlarının Toplanması ... 36
Populasyonlarının Kültüre Alınması ... 40
3.2.2. Biyoanaliz Çalışmaları ... 41
3.2.2.1. Denemede Kullanılacak İnsektisitlerin Temini ve Hazırlanması ... 41
3.2.2.2. Laboratuarda İnsektisitlerin Uygulanışı ... 43
3.2.2.2.(1). Daldırma metodu ... 43
3.2.3. Aphis gossypii Popülasyonlarında Neonicotinoid Dirençliliğin Biyokimyasal Analizlerle Saptanması ... 47
3.2.3.1. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının Toplam Esteraz (EST) enzim aktivitelerinin belirlenmesi ... 48
3.2.3.1.(1). α-naftol standart eğrisinin hazırlanması ... 50
3.2.3.2. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının glutathion S-transferaz (GST) enzim aktivitelerinin belirlenmesi ... 50
3.2.3.3. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının asetilkolinesteraz (AChE) enziminin kinetik olarak incelenmesi ... 52
3.2.3.4. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının Monooksigenaz (P450) aktivitesinin belirlenmesi ... 53
3.2.3.5. Toplam protein miktarlarının belirlenmesi ... 54
3.2.3.6. Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ile esteraz aktivitelerinin gösterilmesi ... 55
3.2.4. Genetik Çalışmalar ... 56
3.2.4.1. Total RNA izolasyonu ... 56
3.2.4.2. cDNA Sentezi ... 57
3.2.4.3. PCR Ürünlerinin Jelde Görüntülenmesi ... 58
3.2.4.4. PCR-RFLP Yöntemiyle Mutasyonların Saptanması ... 58
4. BULGULAR VE TARTIŞMA ... 61
4.1. Adana ilinden toplanmış ve kültüre alınmış Aphis gossypii Popülasyonları 61 4.2. Biyoanaliz Yöntemi ... 61
Enzimlerle İlişkisinin Saptanması... 75
4.3.2. Poliakrilamid Jel Elektroforez (PAGE) İle Esterazın İncelenmesi: ... 77
4.3.3. Farklı Aphis gosyypii Popülasyonlarında Glutathion S-transferaz (GST) Aktivitelerinin Belirlenmesi ... 78
4.3.4. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarında asetilkolinesteraz (AChE) enzim aktivitelerinin belirlenmesi ... 80
4.3.5. Farklı Aphis gosyypii Popülasyonlarında Sitokrom P450 Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi ... 82
4.4. Moleküler Çalışmalar ... 84
4.4.1. nAChR β1 Alt Ünitesi PCR İle Çoğaltılması ... 84
4.4.2. PCR-RFLP Yöntemiyle Mutasyonların Saptanması ... 85
5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER ... 89
KAYNAKLAR ... 95
ÖZGEÇMİŞ ... 117
Çizelge 1.1. Aphis gossypii mücadelesinde yaygın kullanılan insektisit
grupları ((MoA sınıfları) CottonInfo 2015, IRAC 2016) ... 12
Çizelge 1.2. Dünyada laboratuvar şartlarında Aphis gossypii’ye karşı denenen ve direnç gelişimi gözlenen insektisit grupları (Whalon ve ark., 2008). ... 14
Çizelge 1.3. Türkiyede pamuk alanlarında yaygın kullanılan neonicotinoid insektisitler (Anonymous, 2018) ... 19
Çizelge 3.1. Adana ilinde Aphis gossypi’nin toplandığı yerler vde toplanma zamanları ... 37
Çizelge 3.2. Biyoanaliz çalışmalarında kullanılan ilaçların (neonikotinoid grubu) etken maddeleri, ticari isimleri ve dozları ... 42
Çizelge 3.3. İlaç stok solüsyonları hazırlanışı ... 42
Çizelge 3.4. Son konsantrasyon seyreltme tablosu ... 43
Çizelge 3.5. cDNA sentezi için PCR reaksiyonu hazırlama çizelgesi ... 57
Çizelge 3.6. cDNA sentezi için PCR reaksiyonu hazırlama çizelgesi ... 57
Çizelge 3.7. PCR koşulları ... 58
Çizelge 4.1. Laboratuvarda kültüre alınan ve yaşamını devam ettiren popülasyonlar ... 61
Çizelge 4.2. Yaprak daldırma yöntemiyle Acetamiprid uygulanan farklı Aphis gossypii popülasyonlarının LC50, LC90, LC95, ꭓ2, eğim ve RF50 değerleri ... 63
Çizelge 4.3. Yaprak daldırma yöntemiyle İmidaclorpid uygulanan farklı Aphis gossypii popülasyonlarının LC50, LC90, LC95, ꭓ2, eğim ve RF50 değerleri ... 65
Aphis gossypii popülasyonlarının LC50, LC90, LC95, ꭓ, eğim ve RF50 değerleri ... 68 Çizelge 4.5. Yaprak daldırma yöntemiyle clothianidin uygulanan farklı
Aphis gossypii popülasyonlarının LC50, LC90, LC95, ꭓ2, eğim ve ... 71 Çizelge 4.6. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının Esteraz aktiviteleri
(nmol/dk/mg protein) ... 76 Çizelge 4.7. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının glutathion S-
transferaz (GST) aktiviteleri (nmol/dk mg protein) ... 79 Çizelge 4.8. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının asetilkolinesteraz
(AChE) aktiviteleri (nmol/dk mg protein) ... 81 Çizelge 4.9. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının sitokrom P450 enzim
aktiviteleri (nmol/dk/mg protein) ... 84
Şekil 1.1. Ergin Aphis gossypii renk değişimi. A: cüce sarı kanatsız, B:
açık yeşil apterae, C: koyu yeşil kanatsız, D: kanatlı ergin birey
(Blackman ve Eastop, 2000) ... 5
Şekil 1.2. Yaprakbiti hayat döngüsü (Shingleton ve ark., 2003)... 7
Şekil 1.3. Sentetik insektisit imidaclorpidin kimyasal yapısı ve diğer türevleri (Matsuda ve ark., 2009). ... 16
Şekil 1.4. Heteromeril acetylcholine reseptörünün şematize edilmesi (Jones ve Sattelle, 2010). ... 20
Şekil 3.1. Pamuk bitkisi üretiminden görünüm ... 36
Şekil 3.2. Adana ili toplanan Aphis gossypii populasyonları ... 38
Şekil 3.3. Aphis gossypii ile bulaşık pamuk yapraklarından görünümler ... 39
Şekil 3.4. Adana ili pamuk alanlarından yaprakbiti örneklerinin toplanması ... 40
Şekil 3.5. İklim odasında kültüre alınmış farklı yaprakbiti popülasyonları ... 41
Şekil 3.6. Yaprak daldırma yönteminde kullanılan petri düzeneği (a) ve daldırma işlemi sonrası kurutma (b) ... 44
Şekil 3.7. Aphis gossypii bireylerinin fırçayla bitkiden taşınması (a) ve petri kaplarına inokülasyonu (b) ... 46
Şekil 3.8. Deneme ünitelerinin iklim odasına yerleştirilmesi ... 47
Şekil 3.9. Microplate okuma cihazı (a) ve analizlerde kullanılan şeffaf plate(b) ... 48
Şekil 3.10. SDS Page ile elektroforez ... 56
Şekil 3.11. Jel görüntüleme cihazından görünüm ... 59
Şekil 4.1. Acetamiprid uygulanan Aphis gosypii popülasyonlarının logaritmik doz probit doğruları ... 64
Şekil 4.2. Imidacloprid uygulanan Aphis gosypii popülasyonlarının logaritmik doz probit doğruları ... 66
logaritmik doz probit doğruları ... 69 Şekil 4.4. Clothianidin uygulanan A. gossypii popülasyonlarının
logaritmik doz probit doğruları ... 72 Şekil 4.5. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının Esteraz aktivite
grafikleri ... 76 Şekil 4.6. α-naftol 450 nm standart eğri grafiği ... 77 Şekil 4.7. (a) Total esteraz protein aktivitesi, 1:Durhasandede, 2:Bebeli
3:Kürkçüler, 4:Çukurova üniversitesi, 5:Körkuyu, 6:Bahçe, 7:
yumurtalık, 8:Hassas, (b) Protein büyüklüğü PAGE, M:marker(Broad Range Markers: sc-2361) 1:Hassas, 2:Durhasandede, 3:Bebeli 4:Kürkçüler, 5:Çukurova üniversitesi, 6:Körkuyu, 7:Bahçe, 8: yumurtalık, yaklaşk bant büyüklükleri 14 kDa. ... 78 Şekil 4.8. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının GST aktivite grafikleri ... 80 Şekil 4.9. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının AChE aktivite
grafikleri ... 81 Şekil 4.10. nAChR β1alt ünitesi PCR agaroz jel bant fotoğrafları,
1:Durhasandede, 2:Bebeli 3:Kürkçüler, 4:Çukurova Üniversitesi, 5:Körkuyu, 6:Bahçe, 7: yumurtalık, 8:Hassas, M:marker(Thermo 1kb) yaklaşık bant büyüklükleri 690 bp ... 85 Şekil 4.11. nAChR β1alt ünitesi BcdoI kesim ürünleri 1:Durhasandede,
2:Bebeli 3:Kürkçüler, 4:Çukurova Üniversitesi, 5:Körkuyu, 6:Bahçe, 7: Yumurtalık, 8:Hassas, M:marker(Thermo 1kb) ... 86 Şekil 4.12. nAChR β1alt ünitesi HindIII kesim ürünleri agaroz jel bant
fotoğrafları, 1:Durhasandede, 2:Bebeli 3:Kürkçüler, 4:Çukurova üniversitesi, 5:Körkuyu, 6:Bahçe, 7: yumurtalık, 8:Hassas, M:marker(Thermo 1kb) ... 87 Şekil 4.13. . BSA standart eğrisi çizimi ... 87
α : Alfa
β : Beta
oC : Santigrat derece μM : Mikromolar μmol : Mikromol
AMPS : Amonyum persülfat bis : N,N’-metilen-bis-akrilamid CBB : Coomassie Brillant Blue
Da : Dalton
EDTA : Etilendiaminotetra-asetik asit EC : Enzim Komisyonu
g : Dakikada yerçekimi ivmesi Kb : Kilobaz
kDa : Kilodalton Km : Michaelis sabiti mM : Milimolar
mU/ml : Milli units per milliliter nm : Nanometre
nmol/s : Nanomol/saniye OD : Optik Dansite
PAGE : Poliakrilamid Jel Elektroforezi rpm : Dakikada devir sayısı
sp. : Species (tür, tekil)
SDS : Sodyum dodesil sülfat
SDS-PAGE : Sodyum dodesil sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi Tris : 2-Amino-2-Hidroksimetilpropan-1,3-diol
TEMED : N,N,N’,N’-Tetrametil etilendiamin UV : Ultraviyole
U/mg : Unit/miligram U/mL : Units per milliliter
v/v : Hacim/Hacim (volume/volume) w/v : Ağırlık/Hacim (weight/volume)
1. GİRİŞ
Günümüz dünyasının en önemli sorunlardan biri de hızla artan dünya nüfusudur. FAO'nun raporlarına göre her yıl insanlara 15-20 milyon ton gıda maddesi gerekmektedir. Dünyanın yüzölçümü sınırlı olduğundan bu ihtiyacı karşılayacak üretim için yeni alanların tarıma açılması mümkün değildir. Mevcut alanlardan daha fazla üretim yapılabilmesi için tarım ilaçları bugün bütün dünyada kullanılmasından vazgeçilemeyecek maddeler olarak kabul edilmektedir. Dünyada tarım ilacı üretimi 3 milyon ton civarında, yıllık satış tutarı ise 25-30 milyar dolar arasında değişmektedir. Dünya pestisit pazarı 1998’de 1993'e göre % 2.5'luk yıllık büyüme ile 31 milyar dolara ulaşmıştır (Anonymous, 2002). Türkiye’de ise 2002 sonu itibariyle 2000’e yakın ruhsatlı ilaç olup bunlar içerisinde yer alan teknik madde sayısı 300 civarındadır. Ülkemizde 12.198.917 kg (L) pestisid kullanılmış ve bunun 2.250.898 kg (L)’ı insektisidlerdir. En çok kullanılan etkili maddeli insektisidler Metamidophos, Chlorphyrifos ethyl, Parathion-methyl, Dichlorvos, Endosülfan, Carbaryl ve Azinphos- methyl dir (Delen ve ark, 2005). Herbisitler tarım ilaçları içinde % 47,5 'lik bir payla birinci sırayı almaktadır. Bunu % 29 ile insektisitler izlemekte, fungisitlerin ise % 17'luk bir payı bulunmaktadır.
Herbisitler ve insektisitler kullanımın % 70'in üstündeki bir bölümünü kapsamaktadır (Ulusoy ve ark., 2017).
Bunların pestisitlerin 16 tanesi ülkemizde üretilmekte olup, diğerleri ithal edilmekte veya hazır ilaç olarak ülkemize girmektedir. Türkiye'de ilaç kullanımı daha çok polikültür tarımın yapıldığı Akdeniz ve Ege bölgelerinde yoğunlaşmaktadır (Anonymous, 2002). Bu kadar büyük bir oranda kullanım da beraberinde yıkıcı çevresel etkileri doğurmaktadır. Zaman içerisinde kullanılan ilaç dozlarının etkisiz olması, ilaç doz ve uygulama sayılarının artmasına neden olmakta, bu durum çevre ve insan sağlığına olumsuz etkileri yanında hedef olmayan organizmaları da etkilemektedir. Bununla beraber en önemli problemlerden biri olan direnç sorununun ortaya çıkmasına neden olmaktadır.
Pestisitlerin yaygın ve bilinçsiz kullanımından dolayı zararlılarda özel, davranışsal, yapısal, fizyolojik ve çapraz direnç gelişir. Bu dirençler genetik yapıda meydana gelen mutasyonlar (Hedef Bölge (Target-Site) ya da Esteras, Glutathion-S Transferaz, Monooxigenaz, ve hidrolaz gibi detoksifikasyon enzimleri tarafından neden olunur (Çakır ve Yamanel, 2005).
Çukurova Bölgesi’nin iklim koşulları çok sayıda kültür bitkisi çeşidinin üretimine imkan sağlamaktadır. Bu bitkiler üzerinde pekçok zararlı önemli kayıplara neden olmaktadırlar. Yaprakbitleri tarım sektöründe büyük bir sorundur.
Aşırı üreme yeteneklerinden dolayı, yaprakbitleri birçok üründe ağır hasarlara neden olabilmektedir.
Pamuk yaprakbiti Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) de afidler içerisinde etkin zararlılardan birisidir. A. gossypii polifag bir tür olup çok geniş ve değişik konukçusu bulunmaktadır. Başlıca zarar yaptığı bitkiler kabakgiller, turunçgiller, pamuk, bamya, susam, fasulye, şeker pancarı, ıspanak, patlıcan, yerfıstığı, muz, nar gibi bitkilerdir. İsrail'de 70 kadar bitki türünde bulunduğu kaydedilmekte Florida (A.B.D.)'da ise konukçu sayısının 64 olduğu bildirilmektedir (Avidov ve Harpaz, 1969; Pears ve Davidson, 1956). Yurdumuzda en çok kabakgiller ile pamuklarda zararlıdır.
Pamuk yaprakbiti’nin önemli olan bir diğer zarar şekli de bitkilere birçok önemli virüs hastalıklarını bulaştırmasıdır. Bu türün 70 kadar virüs hastalığının vektörü olduğu kaydedilmiştir (Kennedy ve ark., 1962). Aphis gossypii üzerinde etkin pek çok doğal düşman olmasına rağmen en çok kullanılan mücadele yöntemi kimyasal mücadeledir. Aphis gossypii Glover önemli bir pamuk zararlısı olup mücadele edilmezse ürün zararını ciddi bir şekilde artırmaktadır (Godfrey ve ark., 1997). Dünyada Güney Amerika, Güney-doğu Asya , Afrika’da ülkemizde ve pamuk üretimin bir hayli fazla miktarda yapıldığı Avustralya’da önemli bir zararlıdır (Reddall ve ark., 2004). Güncel olarak afidlerin kontrolünde karbamatlı, organofosfat, endosülfan, neonikotinoid, pymetrozin diafenthiuron ve parafinli yağlar kullanılmaktadır (InfoPest, 2008). Avustralya’da pamuk alanlarında
bitkilerin büyüme periyotlarında A.gossypii’nin organofosfatlı (dimethoate ve omethoate) ve karbamat (primicarb) insektisitlerine direnci hayli miktarda artığı gözlemlenmiştir (Herron ve ark., 2001). Bununla birlikte Avustralya gibi büyük pamuk üretici ülkelerde afitlerin kontrolünde neonikotinoidler yaygın olarak kullanılmaktadır. Neonikotinoidlerin 1991’den keşfinden beri dirençlilik çeşitli türlere göre ciddi direnç artışı Bemisia tabaci type B’de 1000 kat bir artış söz konusudur (Nauen ve Denholm, 2005).
Ülkemizde Akdeniz Bölgesi pamuk agroekosistemi, tarım ilacı kullanımının en yoğun olduğu bölgemizdir. Bu durum agroekosistemde varolan dengeleri tamamıyla bozmuş, dolayısıyla ilaçlamalardan beklenen fayda sağlanamamaya başlamıştır. Ülkemizde özellikle pamuk agroekosistemi, diğer bütün ülkelerde olduğu gibi insektisit direnci problemi ile karşı karşıyadır.
İnsektisitlere karşı görülen direnç, günümüz modern tarımının yüz yüze kaldığı önemli sorunlardan bir tanesidir. Günümüzde 553 türün en azından bir insektisit veya akarisite karşı direnç kazanmış durumda olduğu kaydedilmektedir (Tomlin, 1997).
Çukurova’da A.gossypii mücadelesinde sık kullanılan gruplardan biri neonicotinoidlerdir. Neonicotinoidlerin keşfi son 30 yılın tarımsal mücadele açısından bir dönüm noktası olarak düşünülebilir(Jeschke ve Nauen, 2008).
Dünya’da yıllık satışı yaklaşık 1.56 milyar dolar olup, bu toplam insektisid pazarının % 17 sine karşılık gelmektedir. Etkin etki tarzlarından dolayı uzun süredir kullanılan ticari insektisit gruplarıyla çapraz direnç geliştirmemiştir ve sonuç olarak bitkiler üzerindeki önemli zararlılarla mücadelede pyrethroidler, organofosforlular, carbamatlılar ve birkaç diğer insektisid gruplarıyla yer değiştirmeye başlamıştır (Jeschke ve Nauen, 2008). Neonicotinoitler yaprak, toprak ve tohum uygulamalarında temelde sistemik etki ile böceklere seçici toksitite gösterirler. Özellikle beyaz sinek, yaprakbiti ve yaprakpireleri gibi pek çok Hemiptere karşı etkiliyken, aynı zamanda patates böceği Leptinotarsa decemlinata gibi bazı çiğneyici böceklere karşı da etkilidir. Fakat lepidopter larvaları
mücadelesinde ve kontakt etki olarak zayıftırlar (Prabhaker ve ark., 2005;
Tomizawa ve Casida, 2003). Neonicotinoid insektisidler böcek nicotinic acetylcolinesterazının (nAChR) seçici agonistidir ve hem bitki koruma hem de hayvan sağlığı koruma uygulamalarında yoğun bir şekilde kullanılmaktadırlar (Millar ve Denholm, 2007).
Ülkemizde yoğun bir şekilde kullanılan kimyasalların beraberinde getirdiği direnç problemi ile ilgi son yıllarda pek çok çalışma yapılmaktadır. Bemisia tabaci üzerine Adana, Antalya, İzmir ve Tarsus’ ta pamuk bitkisi alanlarında ki popülasyonlarda organikfosforlulara ve sentetik phyretroitlere dirençla ilgili yapılan biyoanaliz ve biyokimyasal çalışmalar sonucunda tüm insektisitlere yüksek düzeyde direnç belirlenmiştir (Erdoğan ve ark., 2008). Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lep: Noctuidae) spinosada hassas ırktan daha az duyarlı bulunmuştur (Aydın ve Gürkan, 2005). Helicoverpa armigera (Hübner) (Lep: Noctuidae)’ da tralomethrin, lambda cyhalothrine direnç belirlenirken; endosulfan, prefenos ve metomylle direnç belirlenmemiştir (Uğurlu ve Gürkan, 2007). Spodoptera littoralis’ in Adana ve Antalya popülasyonlarında chlorpyrifosa direnç belirlenmiştir (Özyardımcı, 2002). Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae)’
nin Adana ve Antalya popülasyonlarında pirimicarb ve demeton-S-methyle değişen düzeylerde duyarlılık belirlenmiştir (Velioğlu ve ark., 2008). Akdeniz bölgesi pamuk ekiliş alanlarında Spodoptera littoralis’ in sentetik pyretroitlere Glutathion S trensferaz (GST) aktivitesinde önemli bir fark görülmezken, karboksilesteras (EST) aktivitesi yüksek saptanmıştır (Hadim ve Gürkan, 2007). Myzus persicae Ankara, Antalya ve Mersin illerinde organikfosforlu, karbamatlı ve sentetik piretroidli insektisitlere direnç belirlenmiştir (Velioğlu ve ark, 2008). Tetranychus urticae hassas ve dayanıklı bireyler arasında yapılan çapraz çalışmalar sonucu bifenthrine dirençta azalma belirlenmiştir. Monoxygenaz (P450) enzim aktivitesi ise dayanıklı ırkta yüksek belirlenmiştir (Ay ve Yorulmaz, 2009).
1.1. Pamuk Yaprakbiti Aphis gossypii
Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) küçük şeffaf vücutlu değişken renk ve vücut büyüklüğüne sahip olan bir böcek olup, erginleri kanatlı ve kanatsız formları vardır (Blackman ve Eastop, 2000) (Şekil 1.1.).
Şekil 1.1. Ergin Aphis gossypii renk değişimi. A: cüce sarı kanatsız, B: açık yeşil apterae, C: koyu yeşil kanatsız, D: kanatlı ergin birey (Blackman ve Eastop, 2000)
Yaygın fenotipik karakterler olarak değişken sayıda açık sarı, koyu yeşil ve cüce formlarında rastlanılabilir (Paddock, 1919; Wall, 1933; Wilhoit ve Rosenheim 1993; Watt ve Hales, 1996) (Şekil 1.1). Cüce kanatsız’lar normal boyutluların 1/3’ü kadar olup, yeşil yerine sarı renkli morfoloji daha yaygındır (Watt ve Hales
1996). Bu fenotip yaygın olarak daha sıcak iklimlerde gözlenip düşük oranlardadır (Wilhoit ve Rosenheim 1993; Watt ve Hales, 1996). Açık renkli bireylerin aksine koyu renk morfoloji daha soğuk bölgelerde gözlenip, yüksek artış oranlarına sahiptir (Blackman ve Eastop, 2000). Nimfler ise yeşilimsi mavi amber yada mavi renklerde olabilirler (Blackman ve Eastop, 2000). Siphonlar gövdenin arkasında uçları sivrilen iki adet olup afidler tanımlayıcı tipik özelliğidir (Dixon, 1975).
Aphis gossypii’de bir çift kısa ve koyu renkli siphonlar abdomenin sonunda gözlenir (Şekil 1.1). Aphis gossypii karakteristiği olarak baştaki küçük antenler gözlenir (Blackman ve Eastop, 2000).
Aphis gossypii dünya üzerinde geniş bir dağılıma sahip olmasına rağmen çoğunlukla tropikal Avustralya, Kuzey Güney Amerika ve Avrupa gibi sıcak bölgelerde bulunur (Blackman ve Eastop, 2000). Ülkemizde ise özellikle yoğun tarımın yapıldığı akdeniz ege kıyı şeridi ve Güneydoğu Anadolu sıcak kesimlerinde bulunur. Aphis gossypii polifag bir böcek olup, tahıl ve lif kaynağı bitkiler süs bitkileri ve çiçekler gibi 92 farklı bitki familyası üzerinde yaygın olarak beslenirler (Elbert ve Cartwright, 1997). Ana tarım ürünleri ise familyaları Cucurbitaceae (karpuz, hıyar ve kabak), Malvaceae(pamuk, bamya)’dir (Elbert ve Cartwright 1997; Blackman ve Eastop 2000). Bununla birlikte tarımda gıda kökenli olmayan daha pekçok bitki türü de ikincil yada ana konukçu bitki görevi yapar (Elbert ve Cartwright, 1997; Blackman ve Eastop, 2000). Dünya çapında en önemli ekonomik yaprakbiti türü pamuk üzerinde bulunmuştur (Leclant ve Deguine, 1994).
1.1.1. Aphis gossypii Yaşam Döngüsü
Genellikle temel olarak konukçu alternatifi olmadan (monoik) ve konukçu seçimine bağlı olarak iki (heteroik) tip yaprakbiti yaşam döngüsü vardır (Dixon, 1988; Kundu, 1994; Kundu ve Dixon, 1995). Monoik afidler hayat döngüleri boyunca genellikle tek konukçu bitki kullanıp, heteroik afidler taksonomik olarak farklı konukçu bitkiler kullanırlar. Odunsu türler (birincil konukçu) kış boyunca
otsu bitkiler ise yaz sezonu boyunca konukçu olarak kullanır (Kundu, 1994).
Ayrıca pekçok afid döngüsel olarak seksüel üreme dönemlerinde partenogenesisle (holosiklik faz) çoğalırlar ve bunu pekçok generasyon aseksüel üreme (anholosiklik) izler (Moran, 1992; Blackman, 2000).
Şekil 1.2. Yaprakbiti hayat döngüsü (Shingleton ve ark., 2003).
Baharda her yumurta kanatsız vivipar bireyler verirken partonegenetik üreyen dişiler birkaç generasyon ve bahar boyunca aseksüel bireyler meydana getirir (Blackman, 1987; Blackman ve Eastop, 2000) (Şekil 1.2). Bu partenogenetik dişiler kanatlı veya kanatsız olup sonbaharda seksüel olarak dişi yada erkek tek cins bireyler meydana getirirler (Wellings ve ark., 1980; Kundu ve Dixon, 1995;
Blackman ve Eastop, 2000).
Bazı afid türleri anholosiklik olarak çevresel değişikliklerle tetiklenirler.
Afidlerin yıllık seksüel fazları azalan fotoperiyod ya da sıcaklık gibi değişen
mevsimlerdeki şartlar etkindir (Blackman ve Eastop, 2000; Williams ve Dixon, 2007). Bazı şartlar altında dişi ergin bireyler partenogenesisle genç klon bireyler doğrururlar.
Afidlerde partenogenesis teleskopik generasyon olarak adlandırılan ve embriyoların embriyoları içermesi gibi bir fenomen mevcuttur (Moran, 1992). Bu durum bir sezonda, bir afitden çoğalan milyonlarca klon afidi ifade eder (Dixon, 1989; Kersting ve ark.,s 1999). Dahası teleskopik generasyonlar akarlarda olan daha küçük organizmalarda olan birim zamanda daha hızlı gelişme oranlarına sahiptir (Leather ve Dixon, 1984; Dixon, 1989). Bu etki kuşkusuz direnç gelişimde önemli bir etkisi vardır. Çünkü hızlı büyüyen nesiller daha fazla insektisite maruz kalır ve daha çabuk direnç geliştirir (Roush ve McKenzie, 1987). Ayrıca partenogenetik üreme nesiller arasında aleller crossing-over olmadığı için bu genlerde azalma meydana gelmez (Wool ve Hales, 1997). Partenogenesisin bir diğer sonucu tek bir bölgede farklı konukçu tercihinde bulunan bireyler meydana getirmesidir (Carletto ve ark., 2009). Klonal popülasyonlar dünya çapında Araceae, Asteraceae (krizantem), Cucurbitaceae (hıyar), ve Malvaceae (pamuk) konukçularını en çok tercih etmektedir ( Guldemond ve ark., 1994;
Margaritopoulos ve ark., 2006; Carletto ve ark., 2009; Agarwala ve Choudhury, 2013; Chen ve ark., 2013). Aseksüel nesiller kuşağının konukçu bitkilerle olan bu eşsiz ilişkisi ve insektisit direnç gelişiminde meydana gelen hızlı bir evrimleşme güçlü insektisidal baskının temelini meydana getirir (Furk ve ark., 1980; Saito, 1989). Örneğin İngiltere’de A. gossypii krizantem ve hıyar üzerinde çoğalır ancak krizantemde çoğalan bireyler hıyarda ya da tersi durumda çoğalmazlar.
Krizantemdeki meydana gelen organofosfat ve karbamat direnci gözlenirken hıyarda üreyenlerde meydana gelmeyebilir (Guldemond ve ark., 1994).
Avustralyada yapılan çalışmalarda süperklonların oluşuma kanıt olarak sekiz mikrosatellit markır bulunmuştur. Ayrıca konukçu bitki ve pirimicarp dirençliliği arasında ilişkili iki multilokus genotip gruba rastlanmıştır (Chen ve ark., 2013).
1.1.2. Aphis gossypii Tarafından Meydana Gelen Ekonomik Kayıplar
A. gossypii doğrudan olarak ürünler üzerinde ciddi ekonomik kayıplara neden olabilmektedir (CABI, 2005). Yaprakbitleri tipik olarak bitkilerin genç yapraklarının alt yüzeyinde ince delici ağız parçası olan stiletleriyle bitkinin floem damarlarına girerek özsuyunu emmektedir (Blackman ve Eastop, 2000; CABI, 2005). Floem dokusundan bitki besinlerinin emilmesi genç sürgünlerin ve meyvenin beslenmesinde problemlere neden olmaktadır. Eğer bitki besini ulaşmazsa bitkide bodurlaşma ürün kaybı ve gelişim geriliği meydana gelir (Cotton atchment Communities Cooperative Research Centre, 2008). Dolaylı olarak bazı bitki virüslerinin vektörlüğünü yapmakta ve bitki özsuyunun açığa çıkmasına neden olmaktadır (Blackman and Eastop 2000).
A. gossypii kalıcı olan ya da olmayan 50 farklı virüsün taşıyıcılığını yapmaktadır. A. gossypii cucurbitaceae’de hıyar mozaik virüsünün (CMV) en önemli vektörü olup, ayrıca papaya halkalı leke virüsü vektörü P (PRSVP) ve W (PRSV-W) türlerinin her ikisini de taşır (CABI, 2005). Pamukta vektör olarak pamuk antokyanos virüsü, pamuk bukleleme virüsü, mavi pamuk hastalığı, pamuk kabarık top virüsü (CBT), pamuk yaprak rulo virüsü (CLR) ve mor solgunluk virüslerinin taşıyıcısıdır (Kennedy ve ark., 1978; Brown, 1992; Reddall ve ark., 2004). Afidlerin yaprak özsuyuyla beslenmesi sonucu fumajin olarak adlandırılan tatlı ve yapışkan özsu mantari bir hastalık meydana gelir. Fumajinin yaprak yüzeyine teması sonucu isli siyah bir tabaka meydana getirmekte, fotosentetik aktivitede gerilemeye ayrıca fungusların için besin kaynağı haline getirip ikincil enfeksiyonlara neden olmaktadır (Isley, 1946). Pamuğun açılması esnasında bu fumajinin ayrıca beyaz pamuk liflerinin kirlenmesine ve birbirlerine yapışmasına neden olmakta ve bu durum istenmeyen ürün kayıplarına yol açmaktadır (Hequet ve ark., 2000). Pamuğun hasattan sonra çırçırlama gibi işlemlerde yapışmaya neden olması makinelerin çalışması ve ürün kalitesi açsından önemli bir problem meydana getirmektedir (Miller ve ark., 1994; Slosser ve ark., 2002). Sonuç olarak
ekonomik olarak pamuk lifleri kalitesi açısından hem üretici hemde işleme prosesleri ve fiyatlandırılması açısından oldukça önemlidir.
1.1.3. Aphis gossypii Mücadelesi
Tarihsel açıdan A. gossypii’ye karşı insektisit kullanmak eskiden beri kullanılan en yaygın metotdur. Ayrıca biyolojik mücadele metotlarıda kullanılmaktadır. Bununla birlikte kimyasal mücadelenin limitleri göstermiştir ki A.
gossypii bireylerinde meydana gelen insektisit direnç durumlarından dolayı büyük insektisit gruplarının etkililik ve yararlılık açısından faydaları gün geçtikçe azalmaktadır (Whalon ve ark., 2008). Günümüz kontrol yöntemleri en iyi mücadele pratiği olan entegre mücadele stratejileri üzerinde yoğunlaşılması ve çalışılması ekonomik mücadele eşiğin anahtar rolünü oluşturur (Wilson ve ark., 2004; Fitt ve ark., 2009). Günümüz en iyi mücadele yöntemleri, hijyen kurallarına dikkat ederek bitki artıklarının ortamdan uzaklaştırılarak afidlerin kışlama olanaklarının ortadan kaldırılması, biyolojik mücadelede etkin faydalı böcekleri teşvik etmek ve kimyasal mücadeleden önce ekonomik zarar eşiği düzelerinin tespit edilmesidir (Wilson ve ark., 2004; Wilson ve ark., 2013).
1.1.3.1. Kültürel ve Biyolojik Mücadele
Polifak olan A. gossypii tarımsal hijyenite açısından bitki artıklarının ortadan kaldırılması oldukça önemlidir. Çünkü A. gossypii popülasyonları için kışlıyacak ve yeniden üremeyi sağlayacak bitki materyallerinin ortadan kaldırılması popülasyonları bu ortamdan uzak kalmalarını sağlayacaktır (Smith ve ark., 2006). Eğer afidler dirençlilik gösterdikleri ilaçlamada olgun pamuk bitkisinden daha yakındaki bitki konukçularına geçerse ertesi yıl yeniden dirençli kolonizasyonlar meydana getirebilirler (Schulze ve Tomkins, 2002). Doğru ve dozunda inesktisit seçimi ve kullanımı agroekosistem açısından insan müdahalesi olmaksızın faydalı mikroorganizmaların devamını ve kontrolünü sağlar (Wilson ve ark., 1999). İnsektisit seçimi pamuğun büyüme dönemlerinde oldukça önemlidir. A.
gossypii mücadelesinde erken dönem (fide dönemi) müdahelesi sonrasında yararlı mikroorganizmların da korunmasında önemli katkıları vardır (Mansfield ve ark., 2006). A. gossypii mücadelesinde ekonomik zarar eşiği önemli olup erken dönemde zarar düzeyi gözlenmiyor ise ilaçlı mücadeleye gerek yoktur (Maas, 2014). Çünkü pamuk bitkisi enfeksiyon süresi 10 günü geçmiyorsa ve % 90’ın üzerinde bile olsa bu durum müdahele açısından çok önemli değildir. Eğer enfeksiyon süresi 2-3 haftayı geçerse müdahele edilebilir düzeydedir (Cotton Catchment Communities Cooperative Research Centre, 2008). Afidlerin kontrolündeki ana müdahele ürün kaybı ve CBT virüslerinin taşıyıcısı olması durumunda önemlidir (Cotton Catchment Communities Cooperative Research Centre, 2008). Afidlere müdahelede için fide yetişme döneminde ilk ana yaprakların altındaki afid sayısını belirlemek ve kayıta altına almak ve skorlamak mücadele başlangıcı için önemlidir.
Afidelerin skorlanması ve “Afid Ürün Kaybı Tahmin Edici”( Aphid Yield Loss Estimator) ye eklenerek tahmin ürün kaybı hakkında bilgi edinilebilir. Bu eklentiyle ürün kaybı hakkında % 85 düzeyinde doğrulukla tahmin yapılabilir (CottASSIST, 2008). Afidlerin ilk yapraklarındaki sayı skorlamasıyla biyolojik mücadele içinde fikir vermektedir (Cotton Catchment Communities Cooperative Research Centre 2008). Kimyasal mücahele ürün kaybı tahmin oranı ancak % 4’ün üzerinde hesaplanırsa yapılmalıdır (Maas, 2014). Pamuk yetiştiriciliğinde sezonun sonunda doğru kozaların açılması esnasında afidlerin görülmesi sonucu pamuk liflerinde hem kalite kaybı hemde kirliliğe neden olmaktadır.
1.1.3.2. Kimyasal Mücadele
Türkiye’de ve dünyada A. gossypii’ ye karşı etki mekanizması (MoA;
Mode of action) sınıfında kayıtlı 20’den fazla insektisit kullanılmaktadır (Nauen ve ark., 2012; Sparks ve Nauen, 2015) (Çizelge 1.1). İnsektisitlerin sınırlı bir kısmı yaprak üzerinden doğrudan olarak uygulanmaktadır. Ayrıca tohum kaplamda ve toprakta granül olarak da kullanılmaktadır. Sistematik etki yapanlar özellikle bitki özsuyuyla beslenen böcekler üzerinde koruyucu etkisi yüksektir (Elbert ve ark.,
2008). A. gossypii’ ye selektif olarak kullanılan insektisit sınıflarının bir kısmına karşı dirençlilik göstermektedir (IRAC, 2015).
Çizelge 1.1. Aphis gossypii mücadelesinde yaygın kullanılan insektisit grupları ((MoA sınıfları) CottonInfo 2015, IRAC 2016)
1.1.4. Aphis gossypii İnsektisit Direnç Gelişimi Tarihçesi
Aphis gossypii’nin dünya çapında zararlı olarak kabul edilmesi, ilk olarak 1800 yıllarda Güney Carolina (Amerika)’da kısmen küçük bir zararlı olarak bildirilmiştir (Slosser ve ark., 1989). 1980’ lı yıllara kadar ana zararlıdan çok ikincil zararlı konumunda dünyada pekçok ülkede görülmekteydi. 1960 yılından itibaren carbamate (group 1A), organophosphate (group 1B), cyclodiene organochlorine (group 2A), pyrethroid (group 3A) ve neonicotinoid kimyasal (group 4A) sınıflarına karşı dirençlilik gelişimleri rapor edilmiştir (Çizelge 1.2). İlk rapor Ghong ve ark. (1964), tarafından organophosphate grubu dimethoate etken maddeli insektisite karşı rapor edilmiştir. Ardından 1980 yılında Furk ve ark.,(1980) pirimicarb etken maddesine, ve Zil'bermints ve Zhuravela (1984)’de pyrethroidlere karşı dirençlilik rapor etmiştir. Kerns ve Gaylor (1992)’de Aphis gossypii’de Texas ve Alabama’ da organophosphate (80-kat) ve pyrethroid (50-kat) direnç gelişimi rapor etmişlerdir. O’Brien ve ark., (1992) carbamate ve organochlorine’e karşı Mississippi’de, Hawaii’de >2000-kat organophosphate, oxydemeton-methyl’e karşı direnç rapor edilmiştir (Hollingsworth ve ark., 1994).
Hindistan’da pamuk alanlarından toplanmış Aphis gossypii’lerde >1000 kat birkaç pyrethroid’e karşı dirençlilik rapor edilmiştir (Ahmad ve ark., 2003). Aphis gossypii’ler de neonikotinoidlere direnç açısından Güney Amerika (Gore ve ark., 2013), Güney Kore (Koo ve ark., 2014), Çin (Wang ve ark., 2002), Japonya (Matsuura ve Nakamura, 2014) ve Avustralya’da (Herron ve Wilson, 2011) rapor edilmiştir. Gore ve ark., (2013) neonicotinoid (thiamethoxam) etken maddesine karşı Güney Amerika’da 25 farklı alanda A. gossypii’ye karşı 562 kat direnç gözlemlenmiştir. Japonya’da Matsuura ve Nakamura (2014) hıyar yetiştirilen alanlardan thiamethoxam etken maddesine karşı 91 kat dirençlilik rapor etmiştir.
Güney Kore’de Koo ve ark., (2014)’de A. gossypii’ye karşı altı farklı alanda test edilmiş altı farklı neonicotinoid insektisitine karşı denemede 14,000-kat clothianidin dirençlilik düzeyi rapor etmiştir.
Türkiyede Aphis gossypii insektisit dirençliliği üzerine Akdeniz Bölgesi farklı lokasyonlarından toplanan popülasyonlarda değişen düzeyde pirimicarb ve demeton-S-metil dirençliliği gözlemlendiğini bildirmişlerdir (Velioğlu ve ark., 2008).
Çizelge 1.2. Dünyada laboratuvar şartlarında Aphis gossypii’ye karşı denenen ve direnç gelişimi gözlenen insektisit grupları (Whalon ve ark., 2008).
1.2. Neonikotinoidler
Neonikotinoidler böcek sinir sistemi iyon kanalları, reseptörleri ya da enzimleri üzerine etki eden bütün dünyada en yaygın ve ticari kullanımı olan insektisit grubudur (Greenwood ve ark., 2007). Bu bileşikler zararlı kontrolünde kullanılır ve tıpkı hedef bölgelerde doğal olarak meydana gelen bileşikler gibi etki eden sentetik analoglarıdır (Isman, 2006). Neonicotinoid kimyasal sınıfının keşfi ve sentezi doğal insektisit olarak kullanılan ve asetilkolin reseptörleri (ACh) üzerinde agonist olan, postsinaptik etki gösteren nikotine dayanır (Yamamoto, 1999). Ancak nikotin aynı zamanda memeli ACh reseptörleri üzerinde de etkili olması nedeniyle daha geniş çapta tarımsal alanda kullanımı açasından çok pratik değildir (Yamamoto, 1999). Ancak nikotinin sentetik türevlerinin geliştirilmesi ve böcek nikotinik asetilkolin reseptörlerine (nAChRs) etkisi sayesinde bazı dezavantajlarını geride bırakmıştır (Jeschke ve Nauen 2008).
1.2.1. Gelişim ve Yapı
70’li yılların başlarında Kaliforniya Modesto’daki Shell Development Company’s Biological Research Centre yeni bitki koruma kimyasallarını keşfetmek amacıyla üniversite kaynaklarından bazı önde gelen kuruluşları taramaya başladı. Ev sineği Musca domestica Linnaeus ve bezelye afidi Acyrthosiphon pisum Harris’e karşı düşük seviyede insektisit etki gösteren 2- (dibromo-nitromethyl)-3-methyl pyridine en umut verici olmuştur (Soloway ve ark., 1978; Soloway ve ark., 1979; Kollmeyer ve ark., 1999). Bu buluş böcek nAChR’leri için özgüllük gösteren yeni sınıfların NHC’lerin gelişmesine yol açtı.
NHC’ler ile daha fazla çalışmanın ardından , memelilere olan düşük toksik etkisi ve hassas böceklere hızlı öldürücü etkisinden dolayı nithiazine seçilmiştir (Soloway ve ark., 1978; Soloway ve ark., 1979; Kollmeyer ve ark., 1999).
Bununla birlikte nitromethylene amidine iskeletine odaklanan nithiazine’nin gelişimi daha sonra arazi koşullarında fotokimyasal olarak değişken olduğu ve bu nedenle ticarileştirilemediği bulunmuştur (Kleier ve ark., 1985).
1980’lerde nithiazinenin kimyasal yapısı üzerine devam eden araştırmalar l-(6- chloro-3-pyridylmethyl)-2-nitromethyleneimidazolidine’nin keşfine yol açmıştır (Kollmeyer ve ark., 1999). Chloropyridlymethyl ikamesinin böcek nAChR’lerine karşı toksisitesini önemli derecede arttırdığı bulunmuştur. Ayrıca araştırmacıları diğer “bioisosteric heterocycleları” keşfetmeye yöneltmiştir (Kagabu, 2011).
Fotoperatiflikteki orijinal nithiazine kusuru, 2-nitromethylene chromophore ile 2- nitroimino chromophore’nun yer değiştirilmesi ile elde edilen ve arazi koşullarında nispeten kalıcı olan l-(6-chloro-3-pyridylmethyl)-2-nitroimino-imidazolidine bileşiği elde edilmiştir (Moriya ve ark., 1993; Kagabu ve Medej, 1995). Bu kimyasal günümüzde imidacloprid olarak bilinmektedir(Şekil 1.3.).
Şekil 1.3. Sentetik insektisit imidaclorpidin kimyasal yapısı ve diğer türevleri (Matsuda ve ark., 2009).
1991 yılında Bayer tarafından satışa sunulan bu kimyasal (Elbert ve ark., 1991) yeni bir kimyasal sınıfının (Grup 4: nAChR competitive modulators) oluşumunun başlangıcı olmuş ve yaygın olarak kullanılan sentetik pyrethroid’lerden daha popüler duruma gelmiştir (Jeschke ve Nauen, 2008).
Günümüzde Grup 4A neonicotinoidler, thiamethoxam (Syngenta) (Maienfisch ve
ark., 1999), acetamiprid (Nippon Soda) (Yamada ve ark., 1999), dinotefuran (Mitsui chemicals), clothianidin (Takeda ve Bayer) (Ohkawara ve ark., 2002) ve thiacloprid (Bayer CropScience) (Jeschke ve ark., 2001)’leri içermektedir.
Neonicotinoid kimyasal sınıfını yapısal parçalara bağlı olarak alt bölümlere ayırmada kullanılan çeşitli terimler vardır. Neonicotinoid kimyasal sınıfı parçalarına göre sınıflandırıldığında; 6-chloro-3-pyridinylmethyl, 2-chloro-5- thiazolymethyl, ve 3-tetrahydrofuranmethyl bileşikleri sırasıyla chloronicotinyls, chlorothiazolyls ve furanicotinyls olarak isimlendirilir. Neonicotinoid kimyasal sınıfı pharmacophore’un bir parçası olarak işlevine göre sınıflandırıldığında;
nitroiminler veya nitroguanidinler (imidacloprid, thiamethoxam, clothianidin ve dinotefuran); nitromethylenes (nithiazine ve nitenpyram); ve cyanoimines (acetamiprid ve thiacloprid) terimleri kullanılmaktadır. Yeni geliştirilen insektisit sulfoxaflor aynı zamanda bir nAChR agonisti gibi etki göstermektedir. Ancak nAChR ile etkileşime girdiği yeni yol (yapısal farklılıklarından dolayı) ve 4A neonicotinoid grubu ile insektisidal çapraz direnç olmadığı için sulfoxaflor IRAC (Insecticide Resistance Action Committee) tarafından grup 4 içinde bağımsız şekilde 4C olarak (4B: nikotin) yerleştirilmiştir (Sparks ve ark., 2013).
1.2.2. Tarımsal ve Ekonomik Önem
Neonicotionid grubu insektisitler ilk olarak 1991 yılında pazara sürüldü ve hızlı bir şekilde Dünya çapında 3.7 milyar dolardan fazla satışla en popüler bitki koruma ürünü olarak piyasada yer aldı (Gerwick ve Sparks, 2014). Dünyada 120den fazla ülke pazarına giriş yapan Neonicotinoid grubu insektisitler pamuk, tahıllar, sorgum, mısır ve kanola gibi çeşitli bitkiler üzerinde kullanılmaktadır (Jeschke ve ark., 2011; APVMA 2013). Neonicotinoid grubu insektisitlerin piyasaya girmesinden önce, organophosphate, carbamate ve pyrethroid grubu kimyasallar insektisit pazarına hakimdi (Elbert ve ark., 2008). Bununla birlikte 2008 yılında Neonicotinoid grubu kimyasallar insektisit pazarının %24’ünü oluşturuyordu (Jeschke ve ark., 2011) ve 2009 yılında pazar değeri 2.63 milyar
dolar olmuştur (SimonDelso ve ark., 2015). 3 Neonicotinoid grubu insektisit (imidacloprid, thiamethoxam ve clothianidin) bu grubun toplam pazarının %85’ini oluşturmaktadır (Elbert ve ark., 2008, Jeschke ve ark., 2011).
Dünya çapında toplam 1.09 milyar dolarlık değer ile küresel pazarın
%41.5’lik bir kısmını oluşturan (Jeschke ve ark., 2011) imidacloprid en yüksek satışa sahip neonicotinoid grubu insektisittir (Nauen et al. 2008). Sırasıyla 0.63 milyar dolar ve 0.44 milyar dolarlık satış değeri ile thiamethoxam ve clothianidin toplam neonicotinoid grubu insektisitlerin satışı bakımından 2. ve 3. sırada yer almaktadırlar (Simon-Delso ve ark., 2015). Dünyada 80den fazla ülkede 20nin üzerinde farklı üründe Cruiser® olarak adlandırılan thiamethoxamın tohum uygulama formülasyonu kullanılırken, Actara® olarak adlandırılan thimethoxamın yaprak spray formülasyonu bu insektisidin dünya pazarındaki satışının yarısından fazlasını oluşturmaktadır (Syngenta 2013). Dünyada thiamethoxamın satışı 2011 yılında 1 milyar dolarken (Syngenta 2012), 2012 yılında ise 1.1 milyar dolara ulaşmıştır (Syngenta, 2013).
Türkiye’da imidacloprid ve thiamethoxam bileşikleri Hemiptera takımından bitki özsuyu ile beslenen böcekler (aphid ve beyazsinek), yaprakla beslenen böcekler ve bitkinin toprak altı kısımlarıyla beslenen böceklerin (telkurdu) kontrolünde rutin olarak kullanılmaktadır (Çizelge 1.3). İmidacloprid içeren tohum uygulama formları arasında Gaucho® ve Genero® (imidacloprid) ile Amparo® (imidacloprid plus thiodicarb) bulunmaktadır. Türkiye’de pamuk ekilen alanların %80’ninde en çok Thiamethoxamın tohum formulasyonları (Cruiser®
and Cruiser Extreme®) kullanılmaktadır. Shield® (clothianidin), Mospilan®
(acetamiprid), Actara® (thiamethoxam) ve Confidor® (imidacloprid) ise düzenli olarak Türkiye’de pamuk alanlarında yaprak spreyi formunda kullanılmaktadırlar (Çizelge 1.3).
Çizelge 1.3. Türkiyede pamuk alanlarında yaygın kullanılan neonicotinoid insektisitler (Anonymous, 2018)
1.2.3. Hedef Bölge
Nikotinik asetilkolin reseptörleri, asıl rolü böcek ve omurgalı sinir sistemlerinde kolinerjik sinaptik iletime aracılık etmek olan “Cys-loop ligand-gated ion channel superfamily (cys-LGIC)” üyesidir (Brejc ve ark., 2001, Karlin 2002, Lester ve ark. 2004). Böcek nAChR leri, periferik sinir sisteminde nAChR'leri içeren memelilerden farklı olarak yalnızca merkezi sinir sistemi ile sınırlıdır (Gepner ve ark., 1978; Breer ve Sattelle, 1987). Böcekler ve memeliler arasındaki bu temel fizyolojik farklılıklar, hedef dışı organizmalara toksisitesinin az ve böceklere seçiciliğinin yüksek olmasından dolayı Neonicotinoidleri oldukça değerli yapmaktadır (Tomizawa ve Casida 2003; Matsuda ve ark., 2009). nAChR hetero yada homo-pentamer alt ünite kombinasyonları simetrik olarak merkezde bir katron poru etrafında bir araya gelen bir yapıya sahiptir.(Celie ve ark., 2004, Unwin, 2005) (Şekil 1.4.).
Şekil 1.4. Heteromeril acetylcholine reseptörünün şematize edilmesi (Jones ve Sattelle, 2010).
Yapılan çalışmalara bakıldığında neonicotinoidlerle ilgili çalışmaların sınırlı olduğu görülmüştür. Bu çalışmada Çukurova’da yaygın bir şekilde bulunan Aphis gossypii üzerine neonikotinoidlerin dayanıklılığının belirlenmesiyle ilgili bir çalışma yürütülmüştür. Çalışmada afidlerle mücadelede sık kullanılan neonicotinoid grubu insektisitlerin açık alanlarda direnç durumu biyoanaliz, biyokimyasal ve moleküler yöntemlerle araştırılmıştır. Denemelerde neonicotinoid grubundan Acetamiprid, Clothianidin, Imidacloprid, Thiacloprid, kullanılmış olup, LC50 değerleri belirlenmiştir. Bunun yanı sıra, Acetylcolinesteras (EST), Gulutathion S-Transferas (GST) ve Sitokrom P450 monooxigenas aktiviteleri belirlenmiştir. Çalışmanın diğer bir hedefi de moleküler yöntemler kullanılarak neonikotinoidlere dayanıklılığın nicotinic acetylcholine receptörlerinin (nAChR) β1 alt ünitesi üzerinde enzim kesimleri yapılarak olası mutasyonların varlığına
bakılmıştır. Böylece Aphis gossypii’ nin bu bölgedeki neonikotinoidlere karşı direnç durumu belirlenmeye çalışılmıştır.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR
Suzuki ve ark., (1993), Pamuk yaprak biti (Aphis gossypii Glover) naptil-1- asetatın substrat olarak verildiği çalışmada karboksilesteraz aktivitesinin klonlar ve organofosfor insektisit dirençliliği arasında yakın bir korelasyonun olduğunu bildirmişlerdir. Karbokssil esteraz ektivitesi % 90 oranında çözeltide ayrımı yapılmıştır. Hem hassas hem dirençli klonlara ait çözeltinin fenikstroksona karşı sınırlı hidrolitik aktivitesi gözlenmiştir, aksine dirençli klonlarda oransal karboksil esteraz aktivitesi belirgin olarak gösterilmiştir. Karboksilesteraz aktivitesi ve fenitrokson ayrımı aktivitesi 2-fenoksi-4H-1,3,2-benzodioksafosforin 2-oksit (K-2) ile inhibe edilerek belirlenmiştir. Fakat S,S,S-tributil fosfortritioat (DEF) ve iprobenfos (IBP, Kitazin P) ile belirlenememiştir. Bu üç esteraz inhibitörü arasında yalnızca K-2 fenitrotionun toksisitesi üzerinde sinerjitik etkisi göstermiştir. Ayrıca fenitrokson aktivitesi ayrımı aşırı naptil-1- asetat tarafından belirgin olarak azalmıştır. Bu sonuçlar üzerinden A. gossypii karboksilesteraz aktivitesinin bir ayrım proteini olarak fenitrothion dirençliliğinde rol aldığı belirlenmiştir.
Delorme ve ark., (1997), Güney Fransa’dan dirençli bir A.gossypii türü birkaç insektisite karşı hassas klonlara göre özellikle de primicarpa karşı dirençli olduğu belirlenmiştir. Dirençlilik düzeyi biyolojik testlerle belirlenmiş olup primicarpa karşı yüksek dirençlilik faktörü (1350) belirlenmiştir. Direnç öncelikle antikolinesteraz inhibitörü mekanizması ile sınırlandırılmıştır. Sinerjitik kullanımı (DEF ve PB) tercih edilmiş olup detoksifikasyona dayalı dirençlilik mekanizması üzerinde küçük etki yaptığı, aralarında AChE nin I50 değeri ve ki değerleri arasında yakından bir ilişki olduğu invivo biyoanaliz verileriyle gösterilmiştir. İki tür arasında esteraz aktivitesi 27,7 kat dirençli türde daha fazla olduğu gözlemlenmiştir. Esteraz aktivitesi poliakrilamid jel elektroforezinde farklı bantlarda S ve R türleri olarak gösterilmiş ve primicarpe karşı iki izozimin S türünde daha hassas olduğu bununla birlikte invitro olarak primicarpın (14C) parçalanmadığı gözlemlenmiştir.
Han ve ark., (1998), organofosfat ve karbamat insektisitlerine karşı spesifik olmayan elektroforetik mobil esteraz aktivitesi ve asetilkolinesteraz (AChE) hassaslığı dünya çapında 21 tür ya da A.gossypii klonlarında belirlenmiştir.
Dirençlilikle alakalı bantları demeton-S-metil primicarp ve permetrine karşı biyoanaliz diagnostik doz çalışmasıyla yakından alakalıdır. Sonuçlar önceki çalışmalarda olduğu gibi AChE’ye ait iki mutant formun olduğunu göstermiştir.
Bunu primicarplere olan hasaslık ve insektisitlere karşı birincil dirençlilik mekanizması göstermiştir. Mutant AChE enzimlerinden biri demeton-S-metil’e karşı girençlilik göstermiştir. Aksine spesifik olmayan esteraz aktivitesinin yüksek ya da ortalama seviyesi ile dirençlilik göstermiştir. Permetrin dirençliliği ve kantitatif yada kalitatif değişimler arasındaki korelasyonun eksikliği estreaslarda karakterize edilmemiş bir ayrım oluşturmuştur. Piretroit dirençliliği mekanizması hedef proteindeki bu pestisitlerin hasaslık düzeyine bağlıdır.
Villatte ve ark., (1999), Pamuk yaprak biti A.gossypii Glover., dünya çapında primicarplere dirençlilik gösteren pek çok popülasyonu mevcuttur. Bu direnç ana olarak asetilkolinesterazın modifikasyonundan kaynaklanır. Güney Fransadan toplanıp analiz edilen türlerin, 14 karbamat ve organofosfat insektisitin hidrolizi asetilkolinesteraz tarafından değiştiriliği analiz edilmiştir. Modifiye olmuş enzimler primicarplara karşı direnç sağlar ayrıca bendiocarplara karşıda direnç sağlar. Biyoanalizler göstermiştir ki dirençli türler bendiocarplara karşı da hafif miktarda direnç göstermiştir. Bu direnç mekanizması laboratuvar ortamında test edilmiş olup % 50 primicarp % 50 hassas afidler karıştırılarak deneme kurulmuş ve bendiocarp ile tekrarlanmıştır. Bu popülasyondaki dirençli bireylerin frekansı gösterilmiş ve ilaçlanmamış grupla karşılaştırılmıştır. Etkenler bendiocarp bireylerin dirençliliğini artırmış fakat dirençli türler hassaslara göre daha yüksek direnç göstermiş olup bu seleksiyon popülasyonun geri dönüşüne izin vermemiştir.
Bu bilgiler bu stratejinin açık alanlarda daha yüksek antiresistans özelliklere sahip olmasının gerektiğini göstermiştir.
