YÜKSEK LİSANS TEZİ
Keziban Sinem TULUKOĞLU
KARPUZLARDA ANTER VE OVÜL KÜLTÜRÜNDE SOĞUK UYGULAMASI, THIDIAZURON (TDZ) VE 2,4-D UYGULAMALARININ HAPLOİD EMBRİYO UYARTIMINA ETKİLERİ
BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI
ADANA, 2014
UYGULAMASI, THİDİAZURON (TDZ) VE 2,4-D UYGULAMALARININ HAPLOİD EMBRİYO UYARTIMINA ETKİLERİ
Keziban Sinem TULUKOĞLU
YÜKSEK LİSANS TEZİ
BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI
Bu Tez 01/08/2014 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir.
………... ………... ...
Prof. Dr. Nebahat SARI Prof. Dr. Ş. Şebnem ELLİALTIOĞLU Doç. Dr. İlknur SOLMAZ
DANIŞMAN ÜYE ÜYE
Bu Tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır.
Kod No:
Prof. Dr. Mustafa GÖK
Enstitü Müdürü
Bu Çalışma Ç. Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir.
Proje No: ZF2013YL15
Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
ÖZ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
KARPUZLARDA ANTER VE OVÜL KÜLTÜRÜNDE SOĞUK UYGULAMASI, THIDIAZURON (TDZ) VE 2,4-D UYGULAMALARININ
HAPLOİD EMBRİYO UYARTIMINA ETKİLERİ
Keziban Sinem TULUKOĞLU
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI
Danışman : Prof. Dr. Nebahat SARI Yıl: 2014, Sayfa: 78 Jüri : Prof. Dr. Nebahat SARI
: Prof. Dr. Ş. Şebnem ELLİALTIOĞLU : Doç. Dr. İlknur SOLMAZ
Bu çalışma, Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü ile Ç.Ü.
Biyoteknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi’nde gerçekleştirilmiştir. Karpuzlarda (Citrullus lanatus L. (Thunb.) Matsum. ve Nakai) anter ve ovül kültüründe soğuk ön uygulaması, TDZ ve 2,4-D uygulamalarının haploid embriyo uyartımına etkilerinin incelendiği çalışma, iki deneme şeklinde kurulmuştur. Birinci denemede +4 oC’de 0, 2, 4 ve 6 gün süreyle çiçek tomurcuklarına soğuk şoku uygulanmıştır. Soğuk şokunun ardından izole edilen anter ve ovüller 0, 1, 3 ve 5 mg/l 2,4-D ile 0, 0.01, 0.02 ve 0.04 mg/l TDZ’nin farklı dozları ve farklı dozlardaki kombinasyonlarını içeren MS bitki besi ortamı içerisinde kültüre alınmıştır. İkinci denemede ise, birinci denemeden farklı olarak anter kültürü için 3 mg/l 2,4-D, ovül kültürü için ise 5 mg/l 2,4-D bütün embriyo teşvik ortamlarında sabit tutulmuş, farklı TDZ dozlarının (0, 0.01, 0.02 ve 0.04 mg/l) etkileri incelenmiştir. Her iki deneme sonucunda, anter kültüründe yalnızca kallus elde edilebilmiş, ovül kültüründe ise kültüre alınan ovüllerde boyutça artma ve koyu yeşil renk oluşumu gözlemlenmiştir. Oluşan bu yapılar bitkicik formasyonu olarak kaydedilmiştir. Elde edilen bitkicik formasyonları, hormon içermeyen MS besi ortamı içerinde kültüre alınmıştır. Kültüre alınmasından 3 ile 4 hafta sonunda oluşan bitkicik formasyonları kahverengileşerek canlılıklarını yitirmişlerdir.
Anahtar Kelimeler: Karpuz, Ovül-Anter Kültürü, Soğuk Uygulaması, 2,4-D, TDZ
ABSTRACT MSc. THESIS
EFFECTS OF COLD PRETREATMENT, THIDIAZURON (TDZ) AND 2,4- D APPLICATION ON HAPLOID EMBRIYO INDUCTION VIA ANTHER
AND OVULE CULTURE IN WATERMELON
Keziban Sinem TULUKOĞLU
ÇUKUROVA UNIVERSITY
INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF HORTICULTURE
Supervisor : Prof. Dr. Nebahat SARI Year: 2014, Pages: 78 Jury : Prof. Dr. Nebahat SARI
: Prof. Dr. Ş. Şebnem ELLİALTIOĞLU : Assoc. Prof. Dr. İlknur SOLMAZ
This study has been carried out in C.Ü. Faculty of Agriculture, Department of Horticulture and C.U. Biotechnology Research and Application Centre. This study has been conducted analyse the effects of cold pretreatment, TDZ, 2,4-D application on watermelon via anther and ovule culture has been established two different testing.. At first study, cold pretreatment has been applied to flower buds for 0, 2, 4, 6 days at +4 oC. After cold pretreatment, anther and ovule were that isolated and has been cultured in MS basal media which contained 0, 1, 3, 5 mg/l 2,4-D, 0, 0.01, 0.02, 0.04 mg/l TDZ and combination of different doses 2,4-D and TDZ. At second study, 3 mg/l 2,4-D for anther culture and 5 mg/l 2,4-D for ovule culture has been stable in all media and has been searched the effect of 0, 0.01, 0.02 and 0.04 mg/l TDZ. Only callus from anther culture has been obtained at the end of both two studies. In case of ovule culture, it has been observed that ovules get bigger and dark green. This structure has been named as plantlets formations. Then, plantlets formations has been transfered to MS basal media without plant growth regulator. After 3-4 weeks of cultured, plantlets formations became brown and lost their vitality.
Key Words: Watermelon, Ovule-Anther Culture, Cold Pretreatment, 2,4-D, TDZ
TEŞEKKÜR
Tez konusunun belirlenmesinden sonuçlanmasına kadar her konudaki desteğiyle bana yardımcı olan, mesleki ve kişisel gelişimime tecrübe ve önerileriyle katkıda bulunan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Nebahat SARI’ya en içten saygı ve teşekkürlerimi sunarım.
Tez konumun belirlenmesinde önerileriyle katkı sağlayan Doç. Dr. İlknur SOLMAZ’a, sitolojik incelemeler sırasında yardımlarını ve bilgilerini esirgemeyen Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU ve Arş. Gör. Namık Kemal YÜCEL’e, tezimin kurulumunda her türlü desteğiyle yanımda olan Zir. Yük. Müh. Belgin TURUNÇ BİÇEN’e, tezde kullanılan ortamların hazırlanmasında yardımcı olan Biyolog Barış DAL ve Tütün Tek. Müh. M. Hakan EROL’a çok teşekkür ederim. Ayrıca tezimin kurulum aşamasındaki emeklerinin haricinde, içten dostlukları için tüm Ç.Ü.
Biyoteknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi çalışanlarına ne kadar teşekkür etsem azdır. Yüksek lisans hayatım boyunca dostluğu ile yanımda olan, zor zamanlarımda neşesiyle destek bulduğum meslektaşım Arş. Gör. Güzin CAYMAZ-TARIM’a en içten sevgi ve teşekkürlerimi sunarım. Literatür araştırmalarındaki katkılarından dolayı arkadaşım Arş. Gör. Cansu SAYDAM’a, bitkisel materyallerin toplanmasında yardımlarını esirgemeyen Zir. Müh. Mert UÇAN’a, tez dönemim süresince her türlü sıkıntıma çözüm arayan arkadaşlarım F. Sinem DELİBAŞ’a, Zir. Müh. M. Burak SOYKAN’a, Zir. Müh. Oğuzhan TAN’a, Teks. Müh. A. Yiğit YARAR’a ve Teks.
Müh. Alper KUNT’a içtenlikle teşekkür ederim. Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine tezimi destekledikleri için ayrıca teşekkür ederim.
Son olarak başarılarımın yanında başarısızlıklarımda da yanımda olan, asla asla dememeyi öğreten, hayattaki en büyük şansım ailem, Pervin, Ali ve G. Başak TULUKOĞLU’na sonsuz teşekkür eder, en içten sevgilerimi sunarım.
İÇİNDEKİLER SAYFA
ÖZ ... I ABSTRACT ... II TEŞEKKÜR ... III İÇİNDEKİLER ... IV ÇİZELGELER DİZİNİ ... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ ... X SİMGELER VE KISALTMALAR ... XII
1. GİRİŞ ... 1
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ... 7
3. MATERYAL VE METOD ... 15
3.1. Materyal ... 15
3.2. Metod ... 15
3.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi ... 15
3.2.2. Çiçek Tomurcuklarının Toplanması ... 16
3.2.3. Ön Uygulama ... 18
3.2.4. Embriyo Teşvik Ortamının İçeriği ve Hazırlanması ... 19
3.2.5. Çiçek Tomurcuklarının Sterilizasyonu ... 22
3.2.6. Anterlerin Embriyo Teşvik Ortamında Kültüre Alınması ... 23
3.2.7. Ovüllerin Embriyo Teşvik Ortamında Kültüre Alınması ... 25
3.2.8. Ovüllerden Gelişen Bitkicik Formasyonlarının Kültüre Alınması .... 26
3.2.9. İncelenen Özellikler ... 27
3.2.10. Sonuçların Değerlendirilmesi ... 28
4. BULGULAR VE TARTIŞMA ... 29
4.1. Birinci Deneme Anter Kültürü Bulguları ... 29
4.1.1. Halep Karası ve Zeugma F1 Genotiplerinin Ap-1 Çiçek Gelişim Aşamasına Ait Anter Kültürü Bulguları ... 30
4.1.2. Halep Karası ve Zeugma F1 Genotiplerinin Ap-2 Çiçek Gelişim Aşamasına Ait Anter Kültürü Bulguları ... 31
4.1.3. Halep Karası ve Zeugma F1 Genotiplerinin Ap-3 Çiçek Gelişim
Aşamasına Ait Anter Kültürü Bulguları ... 32
4.2. Birinci Deneme Ovül Kültürü Bulguları ... 32
4.2.1. Halep Karası ve Zeugma F1 Genotiplerinin A-2 Çiçek Gelişim Aşamasına Ait Ovül Kültürü Bulguları ... 33
4.2.2. Halep Karası ve Zeugma F1 Genotiplerinin A-1 Çiçek Gelişim Aşamasına Ait Ovül Kültürü Bulguları ... 34
4.3. İkinci Deneme Anter Kültürü Bulguları ... 35
4.3.1. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 Genotiplerinin Ap-1 Çiçek Gelişim Aşamasına Ait Anter Kültürü Bulguları ... 37
4.3.2. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 Genotiplerinin Ap-2 Çiçek Gelişim Aşamasına Ait Anter Kültürü Bulguları ... 37
4.3.3. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 Genotiplerinin Ap-3 Çiçek Gelişim Aşamasına Ait Anter Kültürü Bulguları ... 38
4.4. İkinci Deneme Ovül Kültürü Bulguları ... 41
4.4.1. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 Genotiplerinin A-2 Çiçek Gelişim Aşamasına Ait Ovül Kültürü Bulguları ... 41
4.4.2. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 Genotiplerinin A-1 Çiçek Gelişim Aşamasına Ait Ovül Kültürü Bulguları ... 43
4.5. Birinci ve İkinci Deneme Anter Kültürü Bulgularının Tartışılması ... 45
4.6. Birinci ve İkinci Deneme Ovül Kültürü Bulgularının Tartışılması ... 51
5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER ... 57
KAYNAKLAR ... 61
ÖZGEÇMİŞ ... 71
EKLER ... 72
EK 1. Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin Ap-1 aşamasındaki anterlerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 74
EK 2. Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin Ap-2 aşamasındaki anterlerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 75
EK 3. Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin Ap-3 aşamasındaki anterlerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 76
EK 4. Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin A-2 aşamasındaki
ovüllerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 77 EK 5. Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin A-1 aşamasındaki
ovüllerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 78
ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA
Çizelge 1.1. 100 g karpuzun besin içeriği (Anonim, 2006) ... 3 Çizelge 3.1. MS temel besi ortamında bulunan besin maddeleri ve miktarları
(Murashige ve Skoog, 1962) ... 20 Çizelge 3.2. Birinci denemede kullanılan hormon uygulamalarının içerikleri ... 21 Çizelge 3.3. İkinci denemede kullanılan hormon uygulamalarının içerikleri ... 22 Çizelge 4.1. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 genotiplerinin Ap-1
aşamasındaki anterlerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 36 Çizelge 4.2. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 genotiplerinin Ap-2
aşamasındaki anterlerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 39 Çizelge 4.3. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 genotiplerinin Ap-3
aşamasındaki anterlerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 40 Çizelge 4.4. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 genotiplerinin A-2 aşamasındaki
ovüllerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 42 Çizelge 4.5. Starburst F1 ve Crimson Tide F1 genotiplerinin A-1 aşamasındaki
ovüllerine soğuk uygulaması, 2,4-D ve TDZ dozlarının etkisi ... 44
ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA
Şekil 3.1. Çimlenen tohumlar ve 3-4 gerçek yapraklı aşamadaki fideler ... 16 Şekil 3.2. Donör olarak kullanılacak bitkilerin dikimden sonraki görüntüleri ve
bitkilerin ipe sardırılması ... 16 Şekil 3.3. Anter kültüründe eksplant kaynağı olarak kullanılan erkek çiçeklerin
gelişme dönemleri ... 17 Şekil 3.4. Anter kültüründe kullanılan erkek çiçeklerin bitki üzerindeki
görüntüsü ... 17 Şekil 3.5. Ovül kültüründe kullanılan çiçek tomurcuklarının gelişme dönemleri
... 18 Şekil 3.6. Ovül kültüründe kullanılan çiçek tomurcuklarının bitki üzerindeki
görüntüsü ... 18 Şekil 3.7. Karanlık ortama alınan uygulamalar ... 19 Şekil 3.8. a, b) Çiçek tomurcuklarının etil alkolde bekletilmesi; c, d) Çiçek
tomurcuklarının Tween 20 ilave edilmiş sodyum hipoklorit çözeltisinde bekletilmesi ... 23 Şekil 3.8. devamı e) Çiçek tomurcuklarının steril saf su ile durulanma aşaması. .... 23 Şekil 3.9. Anter kültürleri için a) Çiçeklerden sapın kesilmesi; b) Çanak ve taç
yaprakların ayrılması; c) Filamentlerden izolasyonu; d) Anterlerin besi ortamında kültüre alınması. ... 24 Şekil 3.10. a) Ovüllerin binoküler mikroskop altında ovaryumlardan izolasyonu;
b) Ovüllerin besi ortamında kültüre alınması... 25 Şekil 3.11. Ovül ve anter kültürlerinin bitki büyütme odasındaki görüntüleri ... 26 Şekil 3.12. a) Ovüllerden gelişme gösteren bitkicik formasyonları; b, c)
Eksplantların MS besi ortamı içeren kavanozlara aktarılması; d) Eksplantları içeren kavanozların bitki büyüme odasında gelişmeye alınması ... 27 Şekil 4.1. a) Kültür ortamı içerisindeki anterlerin şişmesi; b, c) Anterlerde
oluşan kalluslar ve yapıları*; d) Kahverengileşerek canlılıklarını kaybeden anter ve kalluslar* *Oklar ile belirtilmiştir ... 30
Şekil 4.2. a) Kültür ortamı içerisindeki ovüllerin yeşermesi; b, c) Ovüllerden gelişen bitkicik formasyonları*; d) Kahverengişerek canlılıklarını kaybeden ovüller* *Oklar ile belirtilmiştir ... 33 Şekil 4.3. Ortam uygulamalarının Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin
anterlerinde kallus oluşumuna etkisi ... 46 Şekil 4.4. Ortam uygulamalarının Starburst F1 ve Crimson Tide F1
genotiplerinin anterlerinde kallus oluşumuna etkisi ... 47 Şekil 4.5. Soğuk ön uygulama sürelerinin Halep Karası ve Zeugma F1
genotiplerinin anterlerinde kallus oluşumuna etkisi ... 48 Şekil 4.6. Soğuk ön uygulama sürelerinin Starburst F1 ve Crimson Tide F1
genotiplerinin anterlerinde kallus oluşumuna etkisi ... 48 Şekil 4.7. Çiçek gelişim aşamalarının Halep Karası ve Zeugma F1
genotiplerinin anterlerinde kallus oluşumuna etkisi ... 50 Şekil 4.8. Çiçek gelişim aşamalarının Starburst F1 ve Crimson Tide F1
genotiplerinin anterlerinde kallus oluşumuna etkisi ... 50 Şekil 4.9. Ortam uygulamalarının Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin
ovüllerinde bitkicik formasyonuna etkisi ... 53 Şekil 4.10. Ortam uygulamalarının Starburst F1 ve Crimson Tide F1
genotiplerinin ovüllerinde bitkicik formasyonuna etkisi ... 53 Şekil 4.11. Soğuk ön uygulama sürelerinin Halep Karası ve Zeugma F1
genotiplerinin ovüllerinde bitkicik formasyonuna etkisi ... 54 Şekil 4.12. Soğuk ön uygulama sürelerinin Starburst F1 ve Crimson Tide F1
genotiplerinin ovüllerinde bitkicik formasyonuna etkisi ... 54 Şekil 4.13. Çiçek gelişim aşamalarının Halep Karası ve Zeugma F1
genotiplerinin ovüllerinde bitkicik formasyonuna etkisi ... 56 Şekil 4.14. Çiçek gelişim aşamalarının Starburst F1 ve Crimson Tide F1
genotiplerinin ovüllerinde bitkicik formasyonuna etkisi ... 56
SİMGELER VE KISALTMALAR
dk : Dakika
mg : Miligram
l : Litre
mm : Milimetre
% : Yüzde
2,4-D : 2,4- Diklorofenoksiasetik asit TDZ : Thidiazuron
Ap-1 : Büyüme ucunun altındaki birinci nodülden toplanan erkek çiçekler Ap-2 : Büyüme ucunun altındaki ikinci nodülden toplanan erkek çiçekler Ap-3 : Büyüme ucunun altındaki üçüncü nodülden toplanan erkek çiçekler A-2 : Antezisten 2 gün önce toplanan hermafrodit/ dişi çiçekler
A-1 : Antezisten 1 gün önce toplanan hermafrodit/ dişi çiçekler
1. GİRİŞ
Dünyada karpuz üretimi 3 472 997 milyon ha alanda, 105 372 341 milyon tonluk kapasiteyle yapılırken, Türkiye 165 000 ha alanda 4 044 184 tonluk karpuz üretimi ile Çin’in arkasından ikinci sırada yer almaktadır. Ülkemizde karpuz, 26 milyon tonluk sebze üretimi içerisinde yaklaşık 4 milyon ton’luk üretimiyle domatesten sonra ikinci sırada bulunmaktadır (Anonim, 2012).
Tüm Citrullus türlerinin gen merkezi Afrika’dır (Robinson ve Deckers- Walters, 1997). Karpuz, Orta Afrika’dan önce yakın çevreye Anadolu ve İran’a geçmiştir. Daha sonra Asya’ya yayılmıştır. M.Ö. 1000 yıllarında Çin’de karpuz tarımının yapıldığı mevcut literatürde bildirilmektedir. Karpuzun Avrupa’ya İspanya üzerinden girmiş, buradan da diğer Avrupa ülkelerine orta çağın başlarında yayılış göstermiş olabileceği düşünülmektedir. Avrupa’da botanikçiler tarafından 16. ve 17.
yüzyılda yazılan kitaplarda karpuzdan söz edilmektedir. Amerika’ya karpuzun Avrupa’dan göç edenler tarafından taşındığı görüşü yaygındır. Cucurbitaceae familyasına ait olan Citrullus cinsi, Afrika, Asya ve Akdeniz’in sıcak bölgelerinde yetişen 4 diploid (n=11) tür içermektedir (Jeffrey, 1975). Bunlar günümüzde ticari olarak yetiştiriciliği yapılan C. lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai, C. colocynthis (L.) Schrad., C. ecirrhosus ve C. rehmii De Winter’dir. C. lanatus ve C. rehmii tek yıllık türler iken, C. colocynthis ve C. ecirrhosus çok yıllık türlerdir. Dünya’da tropik ve subtropik bölgelerde yetiştirilen C. lanatus (Thunb.) Matsum. ve Nakai, Citrullus cinsi içerisinde en fazla çeşitlilik gösteren türdür (Maynard, 2001), kültür formu C.
lanatus var. lanatus ve yabani form olan C. lanatus var. citroides (L.H. Bailey Mansf.) alt türlerini içermektedir (Whitaker ve Bemis, 1976; Bates ve Robinson, 1995; Robinson ve Decker-Walters, 1997; Levi ve ark., 2001; Wehner, 2008). Tüm dünyada ticari olarak yetiştiriciliği yapılan karpuzlar, C. lanatus var. lanatus alt türüne ait olup, çekirdekli ve çekirdeksiz (triploid) tiplere sahiptir. Meyveleri boyut, şekil ve kabuk özellikleri bakımından oldukça zengin bir çeşitlilik göstermektedir.
Meyvelerde boyut; mini, küçük, orta, büyük ve çok büyük, şekil; yuvarlak, oval, eliptik ve silindirik, kabuk; düz ya da çizgili, kabuk rengi; yeşilin farklı tonlarında
(koyu, orta, açık) ve gri, çizgiler; açık veya koyu yeşil zemin üzerine geniş, orta ve dar, et rengi; beyaz, sarı, turuncu ve kırmızı olabilmektedir.
Karpuz içeriğinde bulunan yüksek miktarda su ile sıcak havalarda serinletici etkiye sahip yazlık bir sebzedir. Karpuz A vitamini ile B6 ve C vitaminleri, protein, şeker, karbonhidrat, potasyum, fosfor gibi insan sağlığı ve beslenmesi için gerekli birçok elementçe zengindir (Çizelge 1.1) (Vural ve ark., 2000). Karpuzda antioksidan maddelerden likopen ve β- karoten karetenoidleri bulunur. İçerdiği önemli miktarda likopen kanser riskini azaltmada, LDL (low density lipoprotein)’yi düşürmede ve deriyi UV ışınlarının zararlı etkilerinden korumada yardımcıdır (Perkins, 2005). Karpuz zengin bir citrulline kaynağıdır. Citrulline, insanlar için temel amino asitlerden arjinini metabolize etmede görev alır. Arjinine azot oksit sentezinde kullanılan azotlu bir substrattır ve kalp-damar sistemleri ve bağışıklık fonksiyonlarında asli rol oynamaktadır (Collins ve ark., 2007). İştah açıcı ve ferahlatıcı bir sebze olmasının yanı sıra; göz ağrılarına, mide rahatsızlıklarına ve baş ağrılarına da olumlu etki yaptığı bilinmektedir (Sarı, 2011).
Çizelge 1.1. 100 g karpuzun besin içeriği (Anonim, 2013)
100 g Karpuzun Besin İçeriği Birim Miktar
Su g 91.45
Enerji kcal 30
Protein g 0.61
Karbonhidrat g 7.55
Şeker (toplam) g 6.20
Kalsiyum, Ca mg 7
Sodyum, Na mg 1
Çinko, Zn mg 0.10
Demir, F mg 0.24
Magnezyum, Mg mg 10
Fosfor, P mg 11
Potasyum, K mg 112
Vitamin C (toplam askorbik asit) mg 8.1
Vitamin B-6 mg 0.045
Vitamin A IU 569
Thiamin mg 0.033
Riboflavin mg 0.021
Niacin mg 0.178
Karetenoidler µg 7.481
Dünyada ticari olarak yetiştirilen karpuz bitkileri ile yapılan ıslah çalışmaları oldukça önemlidir. Sebze ıslahının temelini, kendilenmiş saf hatlar oluşturmaktadır.
Karpuzlarda kendileme depresyonuyla çok fazla karşılaşılmamasından dolayı, saf hatlar kendileme yöntemi gibi klasik ıslah çalışmalarıyla elde edilmektedir. Klasik ıslah çalışmalarının çok zaman alması, saf hatların geliştirilmesi için en azından 5-6 nesil kendileme yapılması, ıslahçıları ıslah süresini kısaltan ve % 100 saf hatların elde edilmesine olanak sağlayan haploidizasyon tekniklerine yönlendirmiştir.
Haploidizasyon sonucunda hızla saf hatlar oluşturulmakta ve sonucunda hibrit ıslahı da kolaylaşmaktadır. Doğrudan çeşit olarak da kullanılabilen ya da üstün yeni çeşitlerin ve yüksek verimli hibritlerin kaynağı olan saf hatlar, sebze ıslahının ilk adımı olarak görülmektedir (Veilluex, 1994; Metwally ve ark., 1998a, b).
Somatik hücrelerinde, ait oldukları bitki türünün eşey hücrelerinde taşıdıkları kadar kromozom sayısına (n) sahip bitkilere haploid bitki adı verilmektedir (Khush ve Virmani, 1996). Normal bir bitkide bulunan tüm organlara sahip olmalarına
karşın, diploid bitkiler ile karşılaştırıldıklarında yaprakları dar ve küçük, boyları daha kısa, çiçekleri ise küçüktür. İndirgenmiş kromozom sayısına sahip gametlerin yapısını gösterdiklerinden kısırdırlar, meyve tutma özellikleri bulunmaz ve tohum oluşturamazlar. Haploid bitkilerin ürün vermeleri ve nesillerini devam ettirebilmeleri için kromozom sayılarının bazı kimyasal maddeler (kolhisin, azot protoksit, etil merkuriklorid, kloral hidrat, kafein, asenaften, sulfinilamid, hekzaklorosiklohekzan) yardımıyla iki katına çıkarılması gerekmektedir. Dihaploidizasyon adı verilen bu yöntem ile haploid bitkiler kısa sürede durağanlaştırılarak ıslah çalışmalarında kullanılabilmektedir (Sarı, 1994).
Haploidlere ilgi Blakeslee ve ark. (1922), tarafından Datura stramonium L.
bitkisinde ilk doğal haploid bitkilerin keşfedilmesiyle başlamıştır. Bunun ardından pek çok bitki türünde spontan haploid oluşumu üzerine çalışmalar yoğunlaşmıştır (Khush ve Virmani, 1996). Haploid bitkilerin farklı yollardan doğada kendiliğinden ortaya çıkma sıklığı çok düşük seviyelerde olmakta, tür ve hatta tür içindeki genotiplere göre değişmekte, bazı genotiplerde ise spontan haploidi oluşumu hiç görülmemektedir (Pochard ve Dumas de Vaulx, 1979). Doğal haploidinin yetersiz ve düzensiz oluşumu, ıslah programlarında kullanılmasına olanak sağlamaması, araştırıcıları haploid embriyo uyartımını teşvik amacıyla uzak akrabalar arası melezlemeler, tozlanmanın geciktirilmesi, sıcaklık şokları, eksik veya yetersiz (ışınlanmış) polenlerle tozlama, X ve UV ışınlarının kullanılması, çeşitli kimyasallar ile muamele gibi farklı yöntemlere başvurmaya itmiştir (Emiroğlu ve Gürel, 1993).
Günümüzde donör bitkinin gelişme ve kültür koşullarına göre farklılık gösteren, bir türün normal kromozom sayısının yarısına (n) sahip gametlerden faydalanarak; o türün gametik kromozom sayısını bulunduran bitkilerin elde edilmesinde kullanılan iki ana haploidizasyon yöntemi bulunmaktadır. Bunlar, anterlerin veya izole edilmiş mikrosporların, in vitro kültüre alınması yöntemiyle haploid üretimi androgenesis ve döllenmemiş yumurtalığın ya da yumurta hücrelerinin in vitro kültüre alınması yöntemiyle haploid üretimi ginogenesis’dir. Eksik veya yetersiz tozlama ile elde edilen bitkiler ise yine dişi gametten haploidi uyartımı ile sağlanmaktadır (Ellialtıoğlu ve ark., 2001).
İlk karpuz haploid bitkileri Gürsöz (Sarı) ve ark. (1991) tarafından elde edilmiştir. Ancak; karpuzlarda haploidizasyon teknikleri ile embriyo elde edilmesi ve bitkiye dönüştürülmesi başarılı olsa da (Sarı, 1994), halen rutinde ıslah çalışmalarında kullanılacak kadar bitki elde edilememektedir. Yapılan literatür araştırmalarına göre, karpuz bitkisinin ışınlanmış polenlerle tozlama yoluyla haploid bitki elde etmede tepkileri düşüktür ve sınırlı sayıda haploid embriyo veya bitki elde edilmiş (Gürsöz ve ark., 1991; Sarı ve ark., 1994; Solmaz ve ark., 2011) ve bu bitkilerde kromozom katlamaları da yapılarak dihaploid karpuz bitkileri geliştirilmiştir (Sarı ve Abak, 1996). Daha sonra alternatif yöntem olarak denenen ovül-ovaryum kültürlerinden de az sayıda kallus ve bitki elde edilmiş; yapılan kromozomik incelemelerde bu bitkilerin diploid olduğu tespit edilmiştir (Gürsoy ve ark., 2012).
Cucurbitaceae familyasına ait türlerde ışınlanmış polenlerle haploid embriyo uyartımları yöntem olarak çalışmakla birlikte; kavun dışındaki türlerde bu yöntemin hala dar boğazları bulunmaktadır. Sonraki çalışmalar döllenmemiş yumurtalığın ya da ovüllerin ya da anterlerin kültüre alınmasıyla haploid embriyo oluşturma ve bu embriyolardan haploid bitki elde etme üzerine yoğunlaşmıştır (Dumas de Vaulx ve Chambonnet, 1986; Gémes ve ark., 2002; Kumar ve ark., 2002; Rakha ve ark., 2012).
Androgenesis ve ginogenesisi; bitki genotipi, donör bitkinin fiziksel koşulları, çiçeklerin gelişim aşamaları, sıcaklık-soğuk muameleleri ve bitki besin ortamını içeren birçok faktör etkilemektedir (Bajaj, 1990). Anter ve ovül kültürlerinde, eksplantların +4 oC soğukta tutulmalarının haploid embriyo oluşumuna yol açan gametofitik gelişme seyrinden sporofitik gelişme seyrine yönelmesine yol açtığı için bazı denemelerde başarılı sonuçlar verdiği bildirilmiştir. Shalaby (2007) kabakta yaptığı denemede ovüllere uygulanan soğuk uygulamasının embriyo verimini arttırıcı yönde etkili olduğunu vurgulamıştır. Kwack ve Fujieda (1988), Cucurbita moschata L.’nın döllenmemiş ovülleri üzerinde yaptığı çalışmada aynı sonuçları elde etmişlerdir. Kumar ve ark. (2002), hıyarda +4 oC, 2 gün soğuklama muamelesinin anter kültüründe başarıyı arttırdığını belirtmişlerdir.
Thidiazuron (TDZ)’un düşük dozlarda dahi diğer sitokininlere nazaran daha etkin olduğu belirlenmiş, hücre bölünmesini ve somatik embriyogenesisi arttıran nitelikte bir büyüme düzenleyicisi olduğu bildirilmiştir (Lu, 1993; Murty ve ark., 1998). 2,4-D ise birçok kültür bitkisinde somatik embriyogenis teşvikinde olumlu yanıt vermekte olan bir bitki büyüme düzenleyicisidir (Evans ve ark., 1981). Gémes ve ark. (1996), kabak ve hıyarda 0.02 mg/l TDZ’nin in vitro ginogenesise olumlu tepki verdiğini belirtirken, Metwally ve ark. (1998a) kabakta yaptıkları ovül kültürü çalışmalarında 1 ya da 5 mg/l 2,4-D’yi önermektedirler. Rakha ve ark. (2012), anter kültürü uygulamalarında 1 mg/l 2,4-D’yi ve ovül kültüründe ise 5 mg/l 2,4-D’yi embriyo teşvikinde önermektedirler.
Sunulan bu çalışmanın amacı, dünyada ve ülkemizde önemli ürün gruplarından birisi olan karpuzda haploid embriyo ve bitki geliştirmek amacıyla; biri açık tozlanan (Halep Karası), üçü hibrit (Zeugma F1, Starburst F1 ve Crimson Tide F1) karpuz çeşitlerinde +4 oC’de farklı soğuklama süreleri ile farklı thidiazuron ve 2,4-D uygulama miktarlarının anter ve ovül kültürlerinde embriyo üretimine etkilerini araştırmaktır.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR
Blakeslee ve ark. (1922) tarafından Datura stramonium’da ilk haploid bitkilerin keşfedilmesinden sonra, haploidi ile ilgili çalışmalar başlamıştır.
Haploidlerin sağladığı potansiyel, araştırmacıları haploid bitki elde etmek amacıyla yapılan denemelere yoğunlaştırmıştır. Birçok bitki türünde ya çiçeklere uygulanan dışsal muameleler yardımıyla ya da haploid eşey hücrelerini in vitro kültüre alarak haploid bitki elde edilmesi amacına ulaşılmaya çalışılmıştır (Maheshwari, 1996).
Guha ve Maheshwari 1964, 1966 ve 1967 yıllarında art arda yayınladıkları makalelerinde, Datura innoxia bitkisinde in vitro uyartım sonucu androgenesis yoluyla ilk haploid bitkileri elde ettiklerini bildirmişlerdir. Geliştirilen bu anter kültürü tekniği, biber (Sibi ve ark., 1979; Dumas de Vaulx ve ark., 1981; Abak, 1983), patlıcan (Chambonnet, 1985) gibi birçok sebzede ıslah programlarında kullanılır duruma gelmiştir.
Cucurbitaceae familyasına ait türlerde haploid bitki elde etmek amacıyla yapılan ilk çalışmalar ise 1950’lerde başlamıştır. Hayase (1954), türler arası melezleme yönteminden yararlanarak Cucurbita maxima Duch. ex Lam. çiçeklerini, Cucurbita moschata Duch. ex Lam. çiçek tozları ile tozlayarak kışlık kabakta haploid bitkiler elde etmiştir. Swaminathan ve Singh (1958), X ışınları uygulanan tohumdan elde edilen diploid karpuz bitkisi üzerinde tek bir haploid kol gelişimi gözlemlediklerini belirtmişler, elde edilen haploid bitkinin şaşırtma sonrası gelişimi ise başarısız olmuştur.
Aalders (1958), hıyarda (Cucumis sativus L.) haploid bitki elde etmek amacıyla, hasat ettiği olgunlaşmamış meyvelerin tohumlarını suda yüzdürme yöntemini uygulayarak su üzerinde kalan hafif tohumların embriyolarını kültüre almış ve 13 adet haploid hıyar bitkisi elde etmiştir. Cucurbitaceae familyasının ilk monoploid özelliği taşıyan bu bitkilerinin 8 tanesi büyütülebilmiş ve kolhisin uygulanarak diploid hale getirilmiştir. Fakat bu bitkilerden yeni bireyler elde edilememiştir.
Gürsöz (Sarı) (1990)’ün bildirdiğine göre Dumas de Vaulx (1979), kavunu (Cucumis melo L.) (2n=24), Cucumis ficifolius (2n=4x=48) ile tozlayarak türler arası
melezlemeler yapmıştır. Polenlerin çim borusu gelişimini uyartmak amacıyla, stigmalarını yüzeysel olarak bistüri ile kesip dişi çiçekleri kavun polenleri ile tozlayarak meyveler elde etmiştir. Tozlama sonucu elde edilen meyvelerin tohumlarından melez bitki elde edilememiştir ve oluşan bitkilerin gelişimlerinde sorunlarla karşılaşılmıştır. Bitkilerde kromozom sayımları yapıldığında haploid yapıda oldukları ve haploid oranlarının ise ilkbahar aylarında % 0.284, sonbaharda ise % 0.070 olduğu tespit edilmiştir.
Dryanovska ve Ilieva (1983), kavunda (Cucumis melo L.) organogenesis ve haploid bitki elde edebilmek için androgenesis ve gynogenesis yöntemlerini kullanmışlardır. Araştırıcılar, ovülleri plasenta ile kültüre alarak kallus oluşturmuş ve ovül kültürü neticesinde bir adet haploid bitki elde etmişlerdir.
Zhang ve Rhodes (1992)’un bildirdiğine göre, Xue ve ark. (1983), frekansı düşük olmasına rağmen anter kültürü ile karpuzda haploid bitkicikler elde ettiklerini ve bu bitkicikleri başarıyla diploid bitkilere dönüştürdüklerini bildirmişlerdir.
Anterler tek çekirdekli aşamada, 5 mm çapta ve çiçek tomurcukları açık taç yapraklara sahip iken toplanmıştır. Kallus oluşumu 2 ppm BA, 2 ppm kinetin, % 3 sakkaroz ve % 0.6 -0.7 agar içeren pH 5.8’lik MS ortamında sağlanmıştır.
Organogenesis ise agar ile katılaştırılmış 5-10 ppm GA₃, 4 ppm BA, 30-40 ppm adenin ve 500 ppm laktalbümin hidrolizat içeren MS ortamında sağlanmıştır.
Organogenesis farklılaşması ve sürgün oluşumunun 2 ppm triaconital içeren agar bazlı besi ortamında meydana geldiğini ve kök oluşumunun ise 0.2 ppm IBA, 1 ppm IAA ve % 1.5 sakkaroz içeren pH 5.7’lik MS besi ortamında oluştuğunu rapor etmişlerdir.
Kumar (1984), iki kabakgil türü Luffa cylindrica ve Trichosanthes dioica Roxb.’da olası kallus oluşum ve farklılaşmalarını araştırmak amacıyla anter kültürü yapmıştır. Araştırmacı, kültüre alınan anterlerden direkt ya da indirekt olarak kök ve embriyo elde ettiğini, araştırması sonucunda oluşan köklerden üçünün, embriyolardan ise birinin haploid olduğunu bildirmiştir.
Chambonnet ve Dumas de Vaulx (1985), kabakta (Cucurbita pepo L.) döllenmemiş ovülleri in vitro kültüre alarak embriyo kesesi hücrelerinden haploid bitkiler elde etmişlerdir. Araştırıcılar, uygun in vitro koşullar altında kültüre alınan
ovüllerden elde ettikleri embriyoları bitki oluşturmaya başladığında hormonsuz besin ortamına transfer etmişlerdir. En yüksek sonuçlar antezisten 1 veya 2 gün önce henüz döllenme olmadan elde edilen ovüllerin kullanılmasıyla elde edilmiştir ve 100 ovül başına 4-7 arasında bitki oluşumu gerçekleşmiştir. Bitkilerin çoğunluğunun diploid, bazılarının haploid-diploid kimera, aneuploid veya poliploid olduğu saptanmıştır.
Diploid bitkilerin genetik analizi sonucu yapılan karşılaştırma sonucunda ana bitkiye benzemeyen 8 heterozigot F1 bitki gözlenmiştir. Rejenerasyona uğramış F1
bitkilerinin her biri farklı fenotipik özellikler göstermişlerdir.
Sauton (1987), ticari bir F1 kavun çeşidini normal kültür koşulları altında serada yetiştirerek kendileme yapmış, daha sonra ovaryumları tozlanmadan 5 gün sonra toplamıştır. Birkaç damla Tween-20 damlatılmış olan % 10’luk kalsiyum hipoklorit solüsyonunda 10 dakika yüzey sterilizasyonu yapılan ovaryumları, saf su ile 3 kez çalkalayarak içerisinde nemlendirilmiş filtre kağıtları bulunan petrilere aseptik koşullarda aktarmıştır. Plasenta dokuları dikkatlice uzaklaştırılan ovülleri 20 g/l sakkaroz + 10 g/l agar ilave edilen MS ortamında kültüre almıştır. Kültür tarihinden 3-4 hafta sonra ovüllerin çimlendiği, sonraki 4 hafta sonunda da oluşan bitkilerin toprağa şaşırtılacak duruma geldiğini gözlemlemiştir.
Shail ve Robinson (1987), kapakta yaptıkları türler arası melezleme çalışmalarında, Cucurbita pepo cv. Black Jack ile C. ecuadorensis’i tozlamışlardır.
Tozlanmadan 24 ile 72 saat sonra izole edilen ovüllerin besin ortamına aktarımlarının ardından kallus ve kök oluşturduklarını, ancak bitkiye dönüşümün gerçekleşmediğini bildirmişlerdir.
Kwack ve Fujieda (1988), Cucurbita moschata’nın döllenmemiş ovüllerini in vitro kültüre alarak haploidi uyartımını incelemişlerdir. Araştırıcılar, antezis safhasında alınarak 2 gün 5 ⁰C’de ön sıcaklık uygulanan ovaryumlardan alınan ovüllerin 30 g/l sakaroz içeren MS ortamı üzerinde kültüre alınmasının en iyi sonucu verdiğini ve ovüllerden % 17’sinin embriyo oluşturduğunu bildirmişlerdir. Bu embriyoların uygun bir ortama transfer edildiğinde çoğunun kallus oluşturmaya yöneldiğini ve anormal morfolojik gelişmeler gösterdiğini, sadece birkaç tanesinin normal sürgün ve kök verdiğini izlemişlerdir. Bu araştırma ile elde edilen 3 bitkiden birinin diploid (2n=40), ikisinin ise tetraploid olduğu saptanmıştır.
Sarı ve ark. (1994), tarafından “Crimson Sweet”, “Halep Karası”, “Sugar Baby” ve “Panonia F1” karpuz çeşitlerinde ışınlanmış polenlerle uyartım yoluyla toplam 761 adet partenokarpik embriyo elde edilmiştir. En yüksek embriyo oranının
“Halep Karası” çeşidinde olduğunu, bitkiye dönüşüm oranlarının ise çok düşük seviyede kaldığını belirten araştırıcılar, in vitro kültür sonrası 17 adet bitki elde ettiklerini bildirmişlerdir. Yapılan sitometrik incelemeler (flow sitometri) sonrasında elde edilen tüm bitkilerin haploid olduğu saptanmış ve kolhisin kullanarak katlanmış haploid hatlar üretilmiştir.
Gémés ve ark. (1996), kabakta döllenmemiş ovaryumları 2-3 cm uzunluğa ulaştığında (çiçek açımından önce) toplayarak yüzey dezenfeksiyonundan sonra, ovaryumların dış kabuklarını soyarak dilimleyip in vitro kültüre almışlardır.
Eksplantlar, başlangıçta TDZ ve % 4 sakkaroz ilave edilmiş, daha sonra da NAA ve BA’nın farklı bileşimleri kullanılmış EI ortamına transfer edilmiştir. Yaklaşık 6 hafta sonra ovüllerden embriyoların oluştuğu ve her bir ovaryumdan yaklaşık 10-15 embriyo oluştuğu gözlenmiştir. Araştırma sonucunda elde edilen bitkiciklerin kromozom sayısı ölçümlerinde, % 70’inin haploid, % 30’unun katlanmış haploid ve aneuploid olduğu saptanmıştır.
Metwally ve ark. (1998a), kabak bitkisinin ovaryumlarını antezisten 1 gün önce toplayarak 0, 2, 4 ve 8 gün süre ile +4 oC sıcaklıkta tutmuşlardır. Araştırıcılar daha sonra ovülleri çıkararak 30 g/l sakkaroz, 8 g/l agar ve 2,4-D’ nin 0.1, 1.0, 5.0 ve 10 mg/l’lik 4 farklı konsantrasyonunun eklendiği MS ortamında kültüre almış ve 25±1⁰C sıcaklık ve 16 saatlik ışık periyodunda 4 hafta bekletmişlerdir. Bu süre sonunda ovüller büyüme düzenleyici madde içermeyen MS ortamına transfer edilmiştir. Kültüre alınan 100 ovülden elde edilen bitki sayısı dikkate alındığında en fazla bitkinin, soğuk uygulaması yapılmayan ovaryumlardan çıkarılan ve 1 veya 5 mg/l 2,4-D eklenen MS ortamında kültüre alınan ovüllerden elde edildiği bildirilmiştir.
Gémés ve ark. (2002), 5 partenokarpik hıyar ıslah hattı (7D4C, KS0C, D20F2A5, E10D14, Perez ML) (ana ebeveyn) ve bir hibrit çeşit (Perez F1) kullanarak ovaryum kültürü yapmışlardır. Araştırıcılar donör bitkileri sera koşulları altında yetiştirilen bitkilerden döllenmemiş ovaryumları tam çiçeklenmeden 3 gün
önce, 6 saat önce ve tam çiçeklenme döneminde toplayarak in vitro kültüre almışlardır. Araştırmada her genotipte 150 ovaryum test edilmiştir. Rejenerasyon ortamına (CBM) 0.02 mg/l TDZ ve % 4 sakkaroz ilave edilmiş, kültürler karanlıkta 24 oC, 28 oC veya 35 oC sıcaklıklarda inkübe edilerek 2 ile10 gün süre ile kültüre alınmıştır. Ovaryumlar 0.05 mg/l NAA, 0.2 mg/l BA ve % 3 sakkaroz ilave edilen rejenerasyon ortamına (CBM) transfer edildikten sonra 26 oC’de, 16/8 saat (aydınlık/
karanlık) ışık rejimine tabi tutulmuştur. Araştırıcılar çalışma sonucunda en fazla embriyonun 35 oC sıcaklık uygulamasından elde edildiğini, ovaryum başına elde edilen embriyo oranının en fazla % 18.4, bitki oranının ise % 7.1 olduğunu bildirmişlerdir.
Kumar ve ark. (2002), Calypso ve Green Long hıyar çeşitlerinde büyüme düzenleyicilerin ve anterlere uygulanan sıcaklık ön-muamelelerinin in vitro anter kültürüne tepkilerini incelemişlerdir. Optimum embriyojenik kallus/embriyo oluşumu 2.0 mM 2,4-D (2,4-diklorofoneksiasetik asit) ve 1.0 mM BAP (benzilaminopürin) kombinasyonlarından sağlandığı görülmüştür. Çiçek tomurcukları 4 oC’de 0-10 gün ve 32 oC’de bir gün boyunca ön-muameleye sokulmuş, en iyi sonucun 4 oC sıcaklıkta, 2 gün boyunca bekletilenden alındığı bildirilmiştir. Embriyo farklılaşması 0.09 sakkaroz, 0.25 mM NAA (naftalin asetik asit) ve 0.25 mM (kinetin) içeren B5 ortamında, embriyo gelişmesi ise 5.0 mM ABA (absisik asit) içeren ortamda gerçekleştirilmiştir. Embriyolardan bitkiciklerin oluşumu 0.09 M sakkaroz içeren B5 ortamında sağlanmıştır. Ploidi seviyelerinin analizi için her çeşitten 24 bitkiciğin kök uçları kullanılmış, Calypso çeşidinde 21 ve Green Long çeşidinde 17 haploid bitki elde edildiği bildirmiştir.
Mohamed ve Refaei (2004), yazlık kabak (Cucurbita pepo L.) “Eskenderany”
çeşidinde yaptıkları çalışmada donör bitkinin farklı ekim sezonu ve tarihlerinin anter kültürüne etkilerini incelemişlerdir. Kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonundan en iyi yanıt, 1 Mart’tan itibaren yaz süresince ve 1 Kasım’dan itibaren kış süresince yetişen bitkilerden elde edilmiştir. Kış sezonu zarfında yetişen bitkilerden sağlanan anterlerdeki kallus oluşum ve bitki rejenerasyon düzeyinin yaz sezonundakilerden oldukça fazla olduğunu belirten araştırıcılar, rejenerantların yaklaşık % 60’ının ise haploid yapılı (2n = X = 20) bitkilerden oluştuklarını saptamışlardır.
Yılmaz Ergin (2005), haploid embriyo ve bu embriyolardan bitki elde etmek amacıyla kabakta (Cucurbita pepo L. ) ovaryum kültürü yapmıştır. “Sakız” ve
“Zeybek F1” kabak çeşitlerinin, antezisten 1 gün önce, antezis döneminde ve antezisten 1 gün sonra alınan döllenmemiş ovaryumları 4, 6, 8 dilime bölünerek, farklı miktarlarda TDZ (0.01, 0.1 ve 1 mg/l) eklenen bitki besi ortamına (CBM) transfer edilmiştir. Embriyo teşvik ortamının karanlık koşullarda yaklaşık 3 hafta inkübe edildiği ve yalnızca 0.1 mg/l TDZ ilave edilen CBM ortamında antezisten 1 gün önce ve antezis döneminde alınan ovaryumlarda embriyo oluşumu gözlendiği açıklanmıştır. Araştırıcı ikinci bir deneme olarak enine disk şeklinde ve boyuna dilim şeklinde kesilen ovaryumları embriyo teşvik ortamına transfer etmiştir, gelişme gösteren ovüller NAA ve BA’in farklı konsantrasyonlardaki kombinasyonlarını içeren rejenerasyon ortamına aktarılmıştır. Transfer edilen ovüllerin bazılarında şişme şeklinde gelişime görüldüğü, ancak bitkiye dönüşümün gerçekleşmediği bildirilmiştir.
Shalaby (2007), kabakta in vitro ginogenesis indüksiyonu üzerine genotipin, gövde üzerindeki dişi çiçek pozisyonlarının, sıcaklık uygulamalarının ve sakkaroz konsantrasyonlarının etkilerini araştırdığı; dört farklı deneme gerçekleştirmiştir. İlk denemede 12 farklı genotipten antezisten 1 gün önce toplanan dişi çiçeklerin ovülleri 2,4- D ve kinetinin her birinden 1 mg/l ve % 3 sakkaroz içeren MS besi ortamında kültüre alınmıştır. İzole edilen ovüllerde ginogenesise en iyi tepkiyi “Raad F1” çeşidi göstermiştir. İkinci denemede, iki farklı genotipin (Giad F1 ve Raad F1) ovülleri ana gövde üzerindeki birinci, ikinci ve üçüncü nodlarda oluşan dişi çiçeklerden elde edilmiş ve ilk denemede tanımlanan besi ortamına aktarılmıştır. Petri başına en yüksek ovül yüzdesi ve bitki oluşum miktarı, ikinci nodlarda oluşan çiçeklerden kaydedilmiştir. Üçüncü denemesinde “Queen F1” çeşidinden ayırdığı ovülleri 4oC ve 32 oC’de 0, 4, 7 ve 14 gün süresince inkübe eden araştırıcı, 4 oC ve 32 oC’de 4 gün uygulanan sıcaklık şoklarının embriyojenik ovül oluşumunu arttırdığını tespit etmiştir. Son olarak “Eskenderany” çeşidi ile yaptığı çalışmada üç farklı sakkaroz dozunun (30, 60 ve 90 g/l) ovül kültürüne etkilerini incelemiştir. En iyi sonucun 30 g/l sakkaroz eklenen MS besi ortamından alındığını ve 90 g/l sakkaroz içeren MS besi ortamında ise ginogenik ovüllerin oluşmadığını bildirmiştir. Denemeler
sonucunda elde edilen bitkilerin köklerinde yapılan kromozomik incelemelerde, bitkilerin % 65’inin haploid olduğu açıklanmıştır.
Suprunova ve Shmykova (2008), hıyarda in vitro ovül, anter ve mikrospor kültürlerinden elde edilen haploid bitki verimini arttırmak amacıyla, genotip, bitki büyüme düzenleyicilerin konstrasyonu, çiçek tomurcuğu uzunluğu ve mikrosporların gelişim evresinin etkilerini araştırmışlardır. İncelenen büyüme düzenleyiciler arasından, ginogenesis indüksiyonu için en uygun konsantrasyon 0.2 mg/l thidiazuron (TDZ) olarak bulunmuştur. Ovülleri kültüre alınan genotiplerden yalnızca “Gordion” çeşidinde haploid bitki elde edilmiştir. Araştırıcılar yaptıkları sitolojik incelemeler sonucunda, androgenesis aracılığıyla haploid bitki eldesi için geç tek çekirdekli ve erken biselüler evredeki mikrosporları içeren, 6 mm’den daha uzun çiçek tomurcuklarının en uygun aşama olduğu sonucuna varmışlardır. Elde edilen embriyojenik kallusların anter kültüründe somatik hücrelerden, mikrospor kültüründe ise polen tanesinin vejetatif hücrelerinden oluştuklarını belirlemişlerdir.
Diao ve ark. (2009), tarafından hıyarda 35 oC’de sıcaklık ön uygulama süresinin, TDZ ve AgNO3 konsantrasyonlarının ovaryum kültüründe embriyo oluşumuna etkilerini araştırmışlardır. Kültür başlangıcında uygulanan 35 oC’de 3 günlük sıcaklık şoku en yüksek embriyo oluşum frekansı ile sonuçlanmıştır. TDZ’nin embriyo oluşumunda olumlu etkiye sahip olduğunu bildiren araştırıcılar, en yüksek embriyo oluşum sıklığını (% 72.7) 0.04 mg/l TDZ eklenen indüksiyon ortamında elde ettiklerini bildirmişlerdir. Gümüş nitratın embriyo oluşumuna herhangi bir etkisinin olmadığını, fakat oluşum süresini kısalttığını açıklamışlardır. Denemede kullanılan genotipler arasında belirgin bir farka rastlanmamıştır. Elde edilen 40 adet rejenere bitki arasından iki bitki haploid (2n = x =7), beş bitki tetraploid (2n = x=
28), geri kalanı ise diploid olarak belirlenmiştir. Mikrosatellit markırlar (SSR) diploid bitkilerdeki homozigotluğu araştırmak için kullanılmıştır. Elde edilen 17 bitkinin spontan dihaploid olduğu tespit edilmiştir. Çalışma sonuçlarına dayanarak, hıyarda ovaryum kültürünün DH hatların üretimi için kullanışlı bir yöntem olduğu tespitine varılmıştır.
Gürsoy ve ark. (2012), ovül ve ovaryum kültüründe haploid embriyo elde etmek için yaptıkları çalışmalarında, “Halep Karası” karpuz çeşidinin döllenmemiş
ovaryumlarını antezisten 1 gün önce, antezis döneminde ve antezisten 1 gün sonra toplamışlardır. Steril koşullarda ovaryum kültürü için yumurtalıklardan dilimlenerek elde edilen eksplantları ve ovül kültürü için ise ovaryumlardan izole edilen ovülleri 1mg/l TDZ, 1 mg/l SPM (spermin), 1 mg/l TDZ + 1mg/l SPM eklenen iki farklı besi ortamında (CBM ve MS) kültüre almışlardır. Kültürler 25-26 oC’de, 16/8 saat aydınlık/karanlık periyodunda 8 hafta süresince inkübe edilmiştir. Rejenerasyon gösteren ovülleri ve ovaryum eksplanlarını bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen MS ve CBM ortamlarına transfer etmişlerdir. Ovül kültüründe en yüksek rejenerasyon yüzdesini (% 2.5) antezisten 1 gün sonra toplanan dişi çiçeklerde, 1 mg/l TDZ + MS ve 1mg/l SPM + CBM besi ortamlarından elde ettiklerini, ovaryum kültüründe ise en yüksek rejenerasyon yüzdesini (% 10) antezisten bir gün sonra toplanan dişi çiçeklerde, 1 mg/l TDZ + MS besi ortamında sağlandığını bildirmişlerdir. Araştırıcılar ovaryumlardan rejenere olan tüm karpuz bitkilerinin (10 adet) diploid yapılı olduklarını tespit etmişlerdir.
Rakha ve ark. (2012), kabakta anter ve ovül kültürü yapmışlardır. Ovül kültüründe genotipin, 2,4-D konsantrasyonlarının ve soğuklama uygulamalarının etkilerini incelemişler, sonuç olarak 4 oC’de 7 veya 14 gün soğuğa maruz bırakılan, besi ortamı içeriğinde 5 mg/l 2,4-D içeren uygulamadan en yüksek rejenere bitki yüzdesi (% 25.33) ve ovül başına bitki miktarını elde etmişlerdir. Anter kültüründe ise 4 oC’de 4 gün soğuklama uygulanan anterlerin genotipe, besi ortamının sakkaroz (50, 120, 90, 150 g/l) ve 2,4-D (1 ve 5 mg/l) içeriklerine verdikleri tepkileri incelemişler, sonuç olarak en olumlu yanıtı 90 g/l sakkaroz ve 1 mg/l 2,4-D konsantrasyonlarının verdiğini, ayrıca ovüllerden elde edilen bitkilerin % 60’ının ve anterlerden elde edilen bitkilerin % 50’sinin haploid olduklarını rapor etmişlerdir.
3. MATERYAL VE METOD
3.1. Materyal
Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü ile Ç.Ü.
Biyoteknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi bünyesinde yürütülen bu çalışma, birinci ve ikinci deneme olmak üzere iki deneme olarak yürütülmüştür. Birinci denemede bitkisel materyal olarak açık tozlanan bir çeşit olan Halep Karası ile ticari çeşitlerden Zeugma F1 genotipleri, ikinci denemede ise ticari çeşitlerden Starburst F1
ve Crimson Tide F1 genotipleri kullanılmıştır. Halep Karası, yuvarlak meyve şekilli, meyve kabuk rengi koyu yeşil zemin rengi üzerine koyu çizgili bir çeşittir. İri çekirdeklere sahip olup, meyve et rengi canlı kırmızıdır. Zeugma F1, oval meyve şekline sahip, orta yeşil zemin rengi üzerinde beyazımsı-sarı belirgin çizgileri olan albenisi yüksek bir çeşittir. Starburst F1, oval ala karpuz tipinde, meyve dış kabuğu beyaz renk üzerine koyu yeşil çizgilere sahiptir ve meyve et rengi koyu kırmızıdır.
Crimson Tide F1 ise kendine has buğulu çizgileri olan meyveler oluşturur. Meyve eti kırmızıdır.
3.2. Metod
3.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi
Birinci denemede kullanılan Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin tohumları, içerisinde 2:1 oranında torf ve perlit karışımı bulunan viyollere 25.03.2013 tarihinde ekilmiştir. Zeugma F1 tohumlarında çimlenme gerçekleşmediğinden ticari bir firmadan fideler temin edilmiştir. Her iki genotip içinde fideler 3-4 gerçek yapraklı dönemde (Şekil 3.1.) iken 09.04.2013 tarihinde cm seraya (100-50) x 50 cm aralık mesafeler ile çift sıralı olarak dikilmiştir. İkinci denemede kullanılan Starburst F1 ve Crimson Tide F1 fideleri de yine ticari bir firmadan temin edilmiş, bitkiler 3-4 gerçek yapraklı dönemde iken 16.05.2014 tarihinde (100-50) x 50 cm aralık mesafeler ile çift sıralı olarak plastik seraya
dikilmiştir. Sulamada damla sulama sisteminden yararlanılmış, bitki gelişimi için gerekli ilaçlama ve gübreleme işlemleri uygulanmıştır. Bitkiler ipe sardırılarak tek gövdeli olarak yetiştirilmiştir (Şekil 3.2).
Şekil 3.1. Çimlenen tohumlar ve 3-4 gerçek yapraklı aşamadaki fideler
Şekil 3.2. Donör olarak kullanılacak bitkilerin dikimden sonraki görüntüleri ve bitkilerin ipe sardırılması
3.2.2. Çiçek Tomurcuklarının Toplanması
Anter kültüründe kullanılacak erkek çiçekler, büyüme ucunun (apeks) altındaki birinci nodülden (çanak yaprak, taç yapraktan büyük), büyüme ucunun altındaki ikinci nodülden (taç yaprak ve çanak yaprak eşit) ve büyüme ucunun altındaki üçüncü nodülden (taç yaprak, çanak yapraktan büyük) olmak üzere üç farklı gelişme döneminde donör bitkiden toplanmıştır (Şekil 3.3.). Büyüme ucunun altındaki birinci nodülden toplanan erkek çiçeklere Ap-1, ikinci nodülden
toplananlara Ap-2 ve üçüncü nodülden toplananlara Ap-3 kodları verilmiştir (Şekil 3.4.).
Halep Karası genotipine ait hermafrodit çiçekler ve Zeugma F1, Starburst F1
ve Crimson Tide F1 genotiplerine ait dişi çiçekler ovül kültüründe kullanılmak üzere iki farklı gelişme döneminde saplarından kesilerek toplanmıştır (Şekil 3.5.).
Antezisten 2 gün önce toplanan dişi çiçekler (A-2), antezisten 1 gün önce toplanan dişi çiçekler (A-1) şeklinde kodlanmıştır (Şekil 3.6.).
Şekil 3.3. Anter kültüründe eksplant kaynağı olarak kullanılan erkek çiçeklerin gelişme dönemleri
Şekil 3.4. Anter kültüründe kullanılan erkek çiçeklerin bitki üzerindeki görüntüsü
Şekil 3.5. Ovül kültüründe kullanılan çiçek tomurcuklarının gelişme dönemleri
Şekil 3.6. Ovül kültüründe kullanılan çiçek tomurcuklarının bitki üzerindeki görüntüsü
3.2.3. Ön Uygulama
Çalışmanın bu aşamasında her iki denemede de kullanılan genotiplerin çiçek tomurcukları araziden toplanarak soğuk ön uygulaması için Ç.Ü. Biyoteknoloji
Araştırma ve Uygulama Merkezine getirilmiştir. Çiçek tomurcuklarına, embriyo teşvik ortamına aktarılmadan önce +4 oC sıcaklıktaki soğuk hava deposunda 0, 2, 4 ve 6 gün süreyle soğuklatma uygulanmıştır.
İkinci denemede ise ilk denemeden farklı olarak, kültüre alınan anter ve ovüller her uygulamada sabit olarak bir hafta boyunca kutu ve alüminyum folyo ile sağlanan karanlık ortamda bekletilmiştir (Şekil 3.7.).
Şekil 3.7. Karanlık ortama alınan uygulamalar
3.2.4. Embriyo Teşvik Ortamının İçeriği ve Hazırlanması
Çalışmada temel besin ortamı olarak ilk aşamada embriyo teşvik amacı ile daha önce kabakgil türlerinde yapılmış ovül-ovaryum kültürü ve anter kültürü çalışmalarında kullanılan ve olumlu sonuçlar verdiği belirtilen MS besi ortamı (Çizelge 3.1.) kullanılmıştır (Metwally ve ark., 1998 a ve b). Hazır MS besi ortamı içerisine katılaştırıcı olarak 8 g/l agar tüm ortamlarda standart şekilde kullanılmıştır.
Besi ortamının pH’sı 5.7 olacak şekilde 1 N’lik HCl ve 1 N’lik KOH ile ayarlanmıştır. Anter kültürlerinde 90 g/l sakkaroz (Rakha ve ark., 2012; Kumar ve ark., 2004), ovül kültürlerinde ise 30 g/l sakkaroz karbon kaynağı olarak tüm ortamlarda yer almıştır.
Birinci denemede, yapılan literatür araştırmalarına göre kabakgillerde embriyogenesisi teşvik ettiği belirlenen bitki büyüme düzenleyicilerden oksin olarak 2,4-D (0, 1, 3, 5 mg/l) (Metwally ve ark., 1998a,b; Rakha ve ark., 2012; Yılmaz Ergin, 2005) ve sitokinin olarak da TDZ (0, 0.01, 0.02, 0.04 mg/l)’nin (Gemes ve
ark., 2002; Kumar ve ark., 2002; Yılmaz Ergin, 2005) farklı konsantrasyonları ile farklı konsantrasyonlardaki kombinasyonları temel besi ortamı içerisine eklenmiştir ve her uygulama için bir kod verilmiştir (Çizelge 3.2.)
İkinci denemede ise ilk deneme gözlemlerine dayanarak, embriyo teşvik ortamlarında oksin olarak kullanılan 2,4-D dozu anter kültürü için 3 mg/l, ovül kültürü için 5 mg/l olarak tüm uygulamalarda sabit olarak belirlenmiştir. Sitokinin olarak kullanılan TDZ’nin 0, 0.01, 0.02 ve 0.04 mg/l dozlarının anter ve ovül kültürlerine etkileri incelenmiştir (Çizelge 3.3.).
Ortamlar 121 oC’de, 1.2 atm basınç altında, 20 dk süreyle steril edilmiştir.
Oda sıcaklığında yaklaşık 50-60 oC’ye kadar soğutulan ortamlar, aseptik koşullar altında, steril plastik petri kaplarına yaklaşık 10 ml olacak şekilde paylaştırılmıştır.
Çizelge 3.1. MS temel besi ortamında bulunan besin maddeleri ve miktarları (Murashige ve Skoog, 1962)
Makro Elementler Miktarı (mg/l)
KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O KH2PO4
1900 1650 370 440 170
Mikro Elementler Miktarı (mg/l)
H3BO3
MnSO4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Kl
FeNaEDTA
62 16.9 8.6 0.25 0.025 0.025 0.83 36.72
Amino Asitler Miktarı (mg/l)
Glycine Thiamine-HCl
2.0 0.1
Vitaminler Miktarı (mg/l)
Pyridoxine-HCl Nikotinik asit Myo-inositol
0.5 0.5 100
Diğer Miktarı
Agar pH
8 g/l 5.7
Çizelge 3.2. Birinci denemede kullanılan hormon uygulamalarının içerikleri Ι. Deneme Anter ve Ovül Kültürü Ortamları
Uyg. Kodu
Uygulanan Hormon Dozları
2,4-D (mg/l) TDZ (mg/l)
1 0 0
2 0 0.01
3 0 0.02
4 0 0.04
5 1 0
6 1 0.01
7 1 0.02
8 1 0.04
9 3 0
10 3 0.01
11 3 0.02
12 3 0.04
13 5 0
14 5 0.01
15 5 0.02
16 5 0.04
Çizelge 3.3. İkinci denemede kullanılan hormon uygulamalarının içerikleri ΙΙ. Deneme Anter Kültürü Ortamları
Uyg. Kodu
Uygulanan Hormon Dozları
2,4-D (mg/l) TDZ (mg/l)
1 3 0
2 3 0.01
3 3 0.02
4 3 0.04
ΙΙ. Deneme Ovül Kültürü Ortamları
Uyg. Kodu
Uygulanan Hormon Dozları
2,4-D mg/l TDZ mg/l
1 5 0
2 5 0.01
3 5 0.02
4 5 0.04
3.2.5. Çiçek Tomurcuklarının Sterilizasyonu
Seradan toplanarak Ç.Ü. Biyoteknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi Doku Kültürü Laboratuvarı’na getirilen dişi ve erkek çiçekler yüzey sterilizasyonu için ilk olarak 30 dk boyunca çeşme suyu altında bekletilmiştir. Bu uygulamanın ardından dişi ve erkek çiçekler steril kabine alınarak % 70’lik etil alkol çözeltisi içerisinde 2 dk tutulduktan sonra 3-4 kez steril saf su ile durulanmıştır. Bir sonraki aşamada çiçek tomurcukları, 1-2 damla Tween 20 damlatılan % 30’luk sodyum hipoklorit solüsyonu içerisinde 20 dk bekletilmiş, 3-4 kez steril saf su ile durulandıktan sonra yüzey sterilizasyonu tamamlanmıştır (Şekil 3.8.).
Şekil 3.8. a, b) Çiçek tomurcuklarının etil alkolde bekletilmesi; c, d) Çiçek tomurcuklarının Tween 20 ilave edilmiş sodyum hipoklorit çözeltisinde bekletilmesi
Şekil 3.8. devamı e) Çiçek tomurcuklarının steril saf su ile durulanma aşaması
3.2.6. Anterlerin Embriyo Teşvik Ortamında Kültüre Alınması
Anter kültürü için sterilizasyonu tamamlanan erkek çiçekler, steril filtre kâğıtları üzerinde yeterince kurutulmasının ardından steril pens ve bistüri yardımıyla ilk olarak saplarından, taç ve çanak yapraklarından ayrılmıştır. Daha sonra anter
e
filamentleri steril pens ve bistüri ile dikkatlice uzaklaştırılmış, izole edilen anterler embriyo teşvik ortamlarına yerleştirilmiştir (Şekil 3.9.). Çalışmanın bu aşamasında birinci deneme anter kültürü, 2 farklı genotip, 3 farklı çiçek gelişme dönemi, 4 farklı soğuk ön uygulaması, 4 farklı 2,4-D ve TDZ dozlarını içeren toplam 16 ortam uygulaması ve her uygulamada 10 adet anter olacak şekilde 3 tekrarlamalı olarak kurulmuştur. İkinci deneme anter kültürü ise 2 farklı genotip, 3 farklı çiçek gelişme dönemi, 4 farklı soğuk ön uygulaması, 4 farklı TDZ dozlarını içeren toplam 4 ortam uygulaması ve her uygulamada 10 adet anter olacak şekilde 3 tekrarlamalı olarak kurulmuştur. Anter kültürlerinde kültüre alınan eksplantları içeren petriler 25-26 oC sıcaklıktaki, 3000-4000 lüks ışık yoğunluğunda olan, 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık ışıklanma süresine sahip iklim odalarına alınarak gelişmeleri gözlemlenmiştir.
Şekil 3.9. Anter kültürleri için a) Çiçeklerden sapın kesilmesi; b) Çanak ve taç yaprakların ayrılması; c) Filamentlerden izolasyonu; d) Anterlerin besi ortamında kültüre alınması
3.2.7. Ovüllerin Embriyo Teşvik Ortamında Kültüre Alınması
Ovül kültürü için sterilize edilen çiçek tomurcuklarının ovaryumları yeteri kadar steril filtre kâğıdı üzerinde kurutulduktan sonra taç yapraklar ve dişicik tepesi steril bistüri ile kesilmiştir. Ovüller, binoküler mikroskop altında steril pens ve bistüri yardımıyla ovaryumlardan izole edilerek embriyo teşvik ortamlarına yerleştirilmiştir (Şekil 3.10.). Çalışmanın bu aşamasında birinci deneme ovül kültürü, 2 farklı genotip, 2 farklı çiçek gelişme dönemi, 4 farklı soğuk ön uygulaması, 4 farklı 2,4-D ve TDZ dozlarını içeren toplam 16 ortam uygulaması ve her uygulamada 10 adet ovül olacak şekilde 3 tekrarlamalı olarak kurulmuştur. İkinci deneme ovül kültürü ise 2 farklı genotip, 2 farklı çiçek gelişme dönemi, 4 farklı soğuk ön uygulaması, 4 farklı TDZ dozlarını içeren toplam 4 ortam uygulaması ve her uygulamada 10 adet ovül olacak şekilde 3 tekrarlamalı olarak kurulmuştur. Ovül kültürlerinde kültüre alınan eksplantları içeren petriler 25-26 oC sıcaklıktaki, 3000-4000 lüks ışık yoğunluğuna olan, 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık ışıklanma süresine sahip iklim odalarına alınarak gelişmeleri gözlemlenmiştir.
Şekil 3.11’de anter ve ovül kültürlerinin bitki büyüme odasındaki görüntüleri sunulmuştur.
Şekil 3.10. a) Ovüllerin binoküler mikroskop altında ovaryumlardan izolasyonu; b) Ovüllerin besi ortamında kültüre alınması
Şekil 3.11. Ovül ve anter kültürlerinin bitki büyütme odasındaki görüntüleri
3.2.8. Ovüllerden Gelişen Bitkicik Formasyonlarının Kültüre Alınması
Yaklaşık 5-6 hafta süreyle gözlenen ovül kültürlerinden, gelişme gösteren bitkicik formasyonları bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen MS basal besi ortamı bulunan küçük kavanozlara aktarılmıştır ve her kavanoza bir kod verilmiştir (Şekil 3.12.). Eksplantları içeren kavanozlar, 25-26 oC sıcaklıktaki, 3000-4000 lüks ışık yoğunluğuna olan, 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık ışıklanma süresine sahip iklim odalarına alınarak gelişmeleri gözlemlenmiştir.
Şekil 3.12. a) Ovüllerden gelişme gösteren bitkicik formasyonları; b, c) Eksplantların MS besi ortamı içeren kavanozlara aktarılması; d) Eksplantları içeren kavanozların bitki büyüme odasında gelişmeye alınması
3.2.9. İncelenen Özellikler
Anter Canlılığı (%): Anter kültürü süresi sonucunda canlı kalan anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısına oranlanması ile elde edilmiştir.
Kallus Oluşumu (%): Kallus oluşturan anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısı ile oranlanması sonucu elde edilmiştir.
Ovül Canlılığı (%): Ovül kültürü süresi sonucunda canlı kalan ovül sayısının, kültüre alınan toplam ovül sayısı ile oranlanması ile elde edilmiştir.
Bitkicik Formasyonu (%): Şişen ve koyu yeşil renk alan ovüllerin, kültüre alınan toplam ovül sayısına oranlanması ile elde edilmiştir.
3.2.10. Sonuçların Değerlendirilmesi
Deneme her uygulamada 3 petri, her petride 10 eksplant olacak şekilde faktöriyel düzende tesadüf parselleri deneme desenine göre kurulmuştur. Doku kültürlerinde elde edilen eksplant sayıları farklı olduğundan istatistiksel analiz yapılmamış, değerlerin ortalamasının verilmesi ile yetinilmiştir.
4. BULGULAR VE TARTIŞMA
Çalışmanın bu aşamasında, birinci ve ikinci denemeye ait genotiplerin anter ve ovül kültürü bulguları alt başlıklar altında verilmiş, anter ve ovül kültüründe kullanılan çiçek gelişim aşamalarına göre ayrılarak ekler ve çizelgeler ile incelenmiştir. Ayrıca birinci ve ikinci denemeye ait anter ve ovül kültürü bulgularının irdelenmesinde, diğer uygulamalardan bağımsız olarak kullanılan hormon uygulamalarının, soğuk ön uygulamasının ve çiçek gelişim aşamalarının anter ve ovül kültürüne etkilerini içeren grafiklerden yararlanılmıştır.
4.1. Birinci Deneme Anter Kültürü Bulguları
Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin Ap-1, Ap-2 ve Ap-3 aşamasındaki çiçek tomurcukları, +4 oC’deki 0, 2, 4 ve 6 gün süreyle soğuk muamelesinin ardından, bu çiçek tomurcuklarından elde edilen anterler Çizelge 3.2’de belirtilen 2,4-D ve TDZ hormonlarının farklı dozları ve farklı dozlardaki kombinasyonlarını içeren MS besi ortamı içerisinde kültüre alınmıştır. Soğuk uygulamasının, 2,4-D ve TDZ dozlarının anterlerdeki polen embriyogenesisine etkilerinin incelendiği 14 haftalık deneme süresi sonucunda Ek 1, Ek 2 ve Ek 3’de belirtildiği üzere anterlerden yalnızca kallus elde edilebilmiştir (Şekil 4.1.). Elde edilen bu veriler aşağıdaki alt başlıklar altında daha geniş şekilde açıklanmıştır.
Şekil 4.1. a) Kültür ortamı içerisindeki anterlerin şişmesi b, c) Anterlerde oluşan kalluslar ve yapıları*, d) Kahverengişelerek canlılıklarını kaybeden anterler ve kalluslar*
* Oklar ile belirtilmiştir
4.1.1. Halep Karası ve Zeugma F1 Genotiplerinin Ap-1 Çiçek Gelişme Aşamasına Ait Anter Kültürü Bulguları
Halep Karası ve Zeugma F1 genotiplerinin Ap-1 çiçek gelişme aşamasına ait anter kültürü bulguları Ek 1’de sunulmuştur.
Ek 1’e göre Ap-1 aşamasındaki anterlerin kültüre alınması sonucunda, en yüksek kallus oranı % 70 ile soğuk ön uygulamasına maruz bırakılmayan (0 gün) çiçek tomurcuklarından izole edilen anterlerde, 13 no’lu uygulamada (5 mg/l 2,4-D + 0 mg/l TDZ) Halep Karası genotipinden elde edilmiştir. Bu sonucu yine Halep Karası genotipinde % 60 oranlarıyla soğuk uygulanmayan çiçek tomurcuklarından elde edilen anterlerde, 15 no’lu ortam (5 mg/l 2,4-D + 0 mg/l TDZ) ve 2 gün süreyle +4 oC’de soğuk uygulanan çiçek tomurcuklarından elde edilen anterlerde, 9 no’lu ortam (3 mg/l 2,4-D + 0 mg/l TDZ) izlemiştir. Zeugma F1 genotipinde ise en yüksek kallus oluşumu % 60 oranı ile 4 gün süresince +4 oC soğuk muamelesine maruz
