4. BULGULAR VE TARTIŞMA
4.1. Adana ilinden toplanmış ve kültüre alınmış Aphis gossypii Popülasyonları 61
üremesini devam ettirebilmiş popülasyonlar seçilerek ikinci bir ayrıma gidilmiş ve söz konusu üzerinde çalışılacak olan popülasyonlar belirlenmiştir (Çizelge 4.1.).
Çizelge 4.1. Laboratuvarda kültüre alınan ve yaşamını devam ettiren popülasyonlar Popülasyon no Popülasyon adı Koordinat Toplama
zamanı
1 Körkuyu Ceyhan 35057’09.3”N,
350 47’36.9”E
4/5/2016
2 Durhasandede-Ceyhan 36056’47.5”N,
350 45’25.6”E
4/5/2016
3 Bebeli Köyü-Karataş 36°38'15.2"N 35°27'08.0"E
21/9/2015
4 Bahçe- Karataş 36°37'26.8"N
35°25'47.3"E
5/9/2016
5 Çukurova Üniversitesi 37°01'16.1"N 35°21'17.6"E
Yaprak bitlerinin insektisitlere direnç durumunun belirlenmesinde biyoanaliz metodu olarak IRAC (Insecticide Resistance Action Committee)’ın 019 nolu metodu kullanılmıştır (IRAC, 2015). Uygulanan neonicotinoid grubu insektisitlerin LC50 değerleri Nauen ve ark., (2008)’nın bildirdiği yönteme göre
belirlenmiştir. Çizelge 4.2, 4.3, 4.4 ve 4.5’ de LC50, 90 ve 95 değerleri, güven aralıkları ve eğim değerleri verilmiştir.
Acetamiprid’in LC50 değerlerine bakıldığında en yüksek değer Kürkçüler popülasyonunda (13,58 ppm) gözlenirken en düşük değer, bahçe popülasyonunda (1,92 ppm) gözlemlenmiştir. Güven aralıkları bazı popülasyonlarda benzer görülmekle birlikte aşağı yukarı her popülasyonda farklı düzeylerde görülmektedir.
Kürkçüler (13,58 ppm) ve Körkuyu (8,99 ppm) popülasyonları direnç düzeyleri birbirlerine yakındır ve belirgin düzeydedir. Eğim değerlerine bakıldığında en yüksek eğim Kürkçüler popülasyonunda (2.47 ± 0.749) olup diğer popülasyonlara göre daha homojen bir yapıya sahiptir. En düşük eğime Bebeli köyü popülasyonu (0.779 ± 0.264) sahip olup heterojen bir yapıya sahiptir. Popülasyonların genelde heterojen bir yapıya sahip olduğu söylenebilir. LC90 ve LC95 değerlerine göre tüm popülasyonlarda yüksek düzeyde dayanıklı bireylerin olduğu görülmektedir.
Direnç düzeyi, RF50 değerleri Kürkçüler (10,89) ve Körkuyu (7,21) popülasyonları için yüksek olduğu görülmektedir. En düşük değerlerin ise Bahçe (1,54) ve Bebeli Köyü (1,88) popülasyonlarında olduğu görülmektedir.
Acetamiprid dayanıklılığının deneme yapılan tüm popülasyonlarda farklı düzeylerde olmakla birlikte var olduğu görülmektedir (Çizelge 4.2).
Probit-log doz eğrilerinde popülasyon eğrileri Y-eksenine yaklaştıkça doz azalmasına paralel olarak direnç azalır, uzaklaştıkça artar. Eğrilerde eğim değeri 2’nin üzerindeyse popülasyonda insektisit dayanıklılığı homojen dağılıyor iken, 2 değerinden azsa popülasyonda insektisit bakımından bir heterojenlik söz konusudur, bu sonuca göre uygulanan ilaca hem dayanıklı hem duyarlı bireyler vardır ve bunların oranı birbirine yakındır (Robertson ve ark., 2007).
Çizelge 4.2. Yaprak daldırma yöntemiyle Acetamiprid uygulanan farklı Aphis gossypii popülasyonlarının LC50, LC90, LC95, ꭓ2, eğim ve RF50
değerleri
Şekil 4.1. Acetamiprid uygulanan Aphis gosypii popülasyonlarının logaritmik doz probit doğruları
Acetamiprid uygulanan A. gosypii popülasyonlarının logaritmik doz-probit doğrularına bakıldığında hassas ırk popülasyonunun diğer popülasyonlara göre y eksenine daha yakın olduğu görülmektedir. Hassas popülasyonu LC50 değerine paralel olarak Bahçe, Bebeli, Yumurtalık, Çukurova, Durhasandede, Körkuyu ve Kürkçü popülasyonlarını takip ettiği görülmektedir (Şekil 4.1). Popülasyonların eğim doğruları incelendiğinde daha dik bir eğime sahip olan Çukurova popülasyonunun eğim değerinin ikinin üzerinde olmasından dolayı acetamiprid dayanıklılığı bakımından homojen bir yapıya sahip olduğunu söylemek mümkündür. Diğer popülasyonlar hassas ile birlikte homojen popülasyon olma eğilimindedir.
Çizelge 4.3. Yaprak daldırma yöntemiyle İmidaclorpid uygulanan farklı Aphis gossypii popülasyonlarının LC50, LC90, LC95, ꭓ2, eğim ve RF50
değerleri
İmidaclorpid çalışmalarında en hassas popülasyonun Bebeli olduğunu bunuda Bahçe ve Yumurtalık popülasyonu takip etmektedir. En yüksek dirençlilik düzeyine Kürkçüler popülasyonu sahip olduğu gözlenmektedir. İmidaclorpid LC50
değerlerinin acetamipride kıyasla daha yüksek düzeyde olduğunu, aynı zamanda eğim değerlerinin acetamiprid probit eğimlerine göre daha heterojen bir yapıda olduğu gözlenmektedir. RF50 değerleri incelendiğinde ise en düşük oranın Bebeli popülasyonuna ait olduğu görülmektedir. Kürkçüler popülasyonunda hassas ırka oranla 206,55 kat fark olup bu değer ciddi düzeyde imidaclorpid dayanıklılığı anlamına gelmektedir. Bu kadar yüksek bir değer daha da ilerleyen zaman diliminde imidaclorpid uygulamasının etkisiz hale gelmesine neden olacağı tahmin edilmektedir. Körkuyu ve Çukurova popülasyonlarında da yüksek RF50 değerleri gözlenip bu alanlarda farklı bir grup insektisit ya da bu grup insektisitlerin kullanımına ara verilmesinde fayda vardır.(Çizelge 4.3.)
Şekil 4.2. Imidacloprid uygulanan Aphis gosypii popülasyonlarının logaritmik doz probit doğruları
İmidaclorpid uygulanan popülasyonların logaritmik doz-probit doğrularına göre Kürkçüler popülasyonu daha dik bir eğim değerine sahip olup bu durum dirençlilik düzeyiyle ilgilidir. Hassas popülasyonun dirençli popülasyonlardan daha ayrı ve heterojen bir yapıya sahip olduğu görülmektedir. Bahçe, Bebeli, Yumurtalık popülasyonlarının birbirlerine paralel heterojen bir yapıda olduğu gözlemlenmektedir. Ayrıca Çukurova popülasyonun eğim değerinin 2’nin üzerine çıkmasıyla daha homojen bir yapıda dağılım gösterdiği görülmektedir.
Çizelge 4.4. Yaprak daldırma yöntemiyle Thiametoxam uygulanan farklı Aphis gossypii popülasyonlarının LC50, LC90, LC95, ꭓ2, eğim ve RF50
değerleri
Thiametoxam için en yüksek LC50 değeri Körkuyu popülasyonunda gözlenirken, Bahçe en düşük değere sahiptir. Eğim değerlerinde Bahçe diğerlerine nazaran en yüksek eğim değerine sahip olup daha homojen bir yapıda olduğu görünmektedir. En heterojen yapıya ise yumurtalık popülasyonunda rastlanmıştır.
RF50 değerlerine bakıldığında Bahçe ve Yumurtalık popülasyonları en düşük değerlere sahipken en dirençli popülasyon Körkuyu olarak bulunmuştur(Çizelge 4.4.).
Şekil 4.3. Thiametoxam uygulanan Aphis gossypii popülasyonlarının logaritmik doz probit doğruları
Thiametoxam uygulanmış A.gossypii popülasyonlarının logaritmik doz-probit doğrularına bakıldığında popülasyonların genel olarak homojen olma eğiliminde olduğu ve birbirlerine paralellik teşkil ettiği gözlenmiştir. Hassas popülasyon diğer popülasyonlardan ayrıldığı ve daha heterojen bir eğime sahiptir.
Körkuyu popülasyonunun daha dik bir eğim çizdiği ve y eksenine diğer popülasyonlara göre daha yakın olduğu saptanmıştır. Bebeli, Yumurtalık ve Bahçe popülasyonlarının birbirlerine paralel takip ettikleri görülmektedir. Çukurova
0
popülasyonu daha yatık bir eğime sahip olup diğerlerine göre daha homojen bir değer gözlenmiştir (Şekil 4.3.)
Çizelge 4.5. Yaprak daldırma yöntemiyle clothianidin uygulanan farklı Aphis gossypii popülasyonlarının LC50, LC90, LC95, ꭓ2, eğim ve RF50 değerleri
Clothianidin uygulanan popülasyonlarda en yüksek LC50 değeri Bahçe popülasyonunda kaydedilmiştir. Hassas popülasyona en yakın Körkuyu popülasyonu olup bunu Çukurova ve yumurtalık popülasyonları takip etmiştir.
Ayrıca bu popülasyonların düşük güven aralıkları düzeyine sahip olduğu ve duyarlı oldukları görülmektedir. Yine eğim değerlerine bakıldığında dayanıklılığın homojen bir dağılım göstermediği saptanmıştır (Çizelge 4.5.). RF50 değerlerine göre Bahçe popülasyonun en yüksek düzeyde olduğu Körkuyu popülasyonunun en alt limitte kaldığı gözlemlenmiştir.
Şekil 4.4. Clothianidin uygulanan A. gossypii popülasyonlarının logaritmik doz probit doğruları
Clothianidin uygulanan popülasyonların logaritmik doz-probit doğrularına bakıldığı zaman hassas popülasyonun diğer popülasyonlardan ayrı ve y eksenine yakın olmakla birlikte hassasa paralel bir eğim çizdikleri gözlemlenmiştir (Şekil 4.4.). Körkuyu’nun diğer popülasyonlara oranla daha hassas olduğu ve grafiğin daha solunda kaldığı ayrıca heterojen bir yapıya sahip olduğu gözlemlenmektedir.
En yüksek LC50 değerine sahip Bahçe ve Kürkçüler popülasyonunun hassassın
daha sağında kaldığı diğer popülasyonlardan daha ayrı olduğu ve homojen bir dağılıma eğilimi olduğu gözlemlenmiştir. Genel olarak grafiklere bakıldığında popülasyonlarda heterojen bir dağılım olduğu görülmektedir.
Popülasyonlar birbirleriyle karşılaştırıldığında popülasyonlar arasında dirençlilik faktörü bakımından farklılık gözlenmiştir. Hassas popülasyonun bütün ilaçlara karşı diğer popülasyonlara nazaran daha hassas oldukları gözlemlenirken farklı düzeylerde limit değerleri belirlenmiştir. En fazla dirençliliğin gösterildiği etken madde imidaclorpid (206,55 kat) olup bunu sırasıyla thiametoxam (65,72 kat) clothianidin (38,35 kat) takip etmiş ve en hassas olunan etken madde acetamiprid (10,89 kat) olarak bulunmuştur. Popülasyon yapısı itibariyle acetamiprid dayanıklılığının eğim değerlerinden daha homojen bir yapıya sahip olduğu anlaşılmıştır.
Diğer popülasyonlar kıyaslandıkları zaman dirençlilik düzeyleri, alt ve üst limitler popülasyonlar ve etken maddeye göre değiştiği gözlenmiştir. Genel değerlendirmede Kürkçüler, Körkuyu ve Durhasandede popülasyonlarının diğer popülasyonlara göre LC50 ve LC90 değerlerinin ey yüksek düzeyde olduğu, en hassas popülasyonların ise her etken maddede değiştiği saptanmıştır. (Çizelge 4.2., 4.3., 3.3., 4.5.).
Çalışmada denemeye alınan etken maddeler karşılaştırıldığında tüm insektisitler arasında popülasyonlara göre fark etmekle beraber çapraz dirençtan bahsedilebilir. Acetamiprid ve imidaclorpid uygulandığı Kürkçü ve körkuyu popülasyonlarında maksimum LC50 değerleri elde edilmiştir. Bu iki popülasyonda bu ilaçlara yüksek çapraz direnç belirlenmiştir. Çalışmamızda olduğu gibi önceki yapılan çalışmalarda da aynı etki grubundan olan (mode of action 4A neonicotinoid) imidaclorpid ve thiametoxamda çapraz direnç olduğu bildirilmiştir (Wang ve ark., 2007; Shi ve ark., 2011). Ayrıca insektisitler içerisinde en az direnç görülen etken maddeler acetamiprid ve clothianidindir. En yüksek direnç imidaclorpid de gözlemlenmiştir.
Neonicotinoid grubu ilaçların keşfi ve kronolojik sıralamasına bakıldığında imidaclorpidin piyasaya sürülen ilk neonicotinoid insektisiti olduğu (1991) ve diğer zararlılara karşı da etkili olması açısından ve yoğun kullanımından dolayı imidaclorpide karşı bu denli zamanla artan bir dirençliliğin söz konusu olduğu düşünülebilir. Ayrıca aynı gruptan insektisitlerde zamanla kullanıma bağlı olarak benzer etken maddelere karşı doğal olarak meydana gelen bir çapraz dirençde söz konusudur (Marshall ve ark., 2012). Ayrıca kaynaklarda özellikle dünya çapında artan sayıda imidaclorpid dirençlilik çalışmalarının varlığı dikkat çekicidir (Bass ve ark., 2015).
Ek olarak pamuk alanlarında Bemisia tabacii, gibi zararlıların mücadelesinde de yoğun olarak neonicotinoid grubu insektisitler kullanılmaktadır.
Pamuk tarımının yapıldığı bölgemizde çeşitli sebze yetiştiriciliği de yapılmakta olup bu alanlarda da yoğun ilaçlama tabloları gözlenmektedir. Çiftçilerin ayrıca ilaçlı mücadele farklı ilaçları karışım yapması, ilaçlamanın kalibrasyon yapılmadan çok sık ve belirtilen kullanım dozunun üstüne çıkılması dirençliliğin meydana gelmesinde etkili diğer faktörlerden olduğu düşünülmektedir.
Dünyada pamuk tarımı yapılan diğer alanlarda neonicotinoid grubu insektisitlere karşı oluşan direnç çalışmalarına bakıldığında Çin’de bazı pamuk alanlarında yapılan A. gosyypii imidaclorpide karşı 1200 kat, (Chen ve ark., 2017,) Avustralya pamuk alanlarında Thiametoxam’a karşı 85 kat (Marshall ve ark., 2012), Asya kıtası bazı pamuk alanlarında İmidaclorpide karşı 66,49 kat (Shi ve ark., (2011), ve acetamiprid, clothianidin ve thiamethoxama karşı 6,4, 10 ve 22 kat dirençlilik (Herron ve Wilson, (2011), yine Çin’de Shandong bölgesinde yapılan çalışmalarda imidaclorpid ve thiametoxama karşı 17 kat (Wang ve ark., 2007) dirençlilik olduğu gözlemlenmiştir.
4.3. Aphis gossypii Popülasyonlarında Neonicotinoid Dayanıklılığının Enzimlerle İlişkisinin Saptanması
4.3.1. Farklı Aphis gossypii Popülasyonlarında Esteraz (EST) Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi
Karboksil esteraz aktivitesinin belirlendiği çalışmada enzim aktivitesi bakımından popülasyonlar arasında istatistiki olarak fark önemli bulunmuştur(p<0,05). Enzim aktivite tayini hesaplamalarında kullanılan ekstinsiyon katsayısı, metod 3.2.3.1.(a)’da belirtildiği gibi α-naftol standart grafiği çizilerek (ɛ=0,0117) hesaplanmıştır (Şekil 4.6.). Bütün enzimlerin protein miktarları BSA standart eğirisinden hesaplanmıştır (Şekil 4.13.). Denemenin yürütüldüğü 8 popülasyondan hassas popülasyon en düşük karboksil esteraz aktivitesi gösterirken, Körkuyu popülasyonu en yüksek aktiviteyi göstermiştir (F=75,79; P <0.05, df=23, ) (Çizelge 4.6., Şekil 4.5.). Popülasyonlar arasında hassas haricinde en az esteraz aktivitesini Çukurova popülasyonu göstermiştir.
Velioğlu ve ark., 2008 Akdeniz Bölgesi farklı pamuk alanlarından toplanan A.
gossypii örneklerinde hassasa oranla yüksek miktarlarda esteraz aktivitesi gözlemlenmiştir. Yapılan önceki çalışmalar göstermiştir ki pekçok böcek türü ve afidlerde organofosfat, karbamat ve pyrethroid dirençlilik düzeyi ile genel esteraz aktiviteleri arasında güçlü pozitif bir ilişki bulunmuştur (Devonshire ve Moores, 1982). İnvivo şartlarda afitlerde total proteinlerin % 3 ve üzeri düzeyinde esteras enziminin olması oldukça yüksek miktarda dirençliliği ifade etmektedir (Devonshire ve Sawicki, 1979; Devonshire, 1989). Bu bakımdan popülasyonların toplandığı alanlarda daha önce ve hala organik fosforlu ilaçların kullanıldığı ve afidlerin bu ilaçlar nedeniyle direnç geliştirdiği söylenebilir.
Çizelge 4.6. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının Esteraz aktiviteleri (nmol/dk/mg protein)
* Aynı sütun içinde aynı harfi içeren ortalamalar arasındaki fark Duncan testine göre istatistiki olarak önemli değildir. (P>0.05)
Şekil 4.5. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının Esteraz aktivite grafikleri
örnek no U/ml nmol/dk mg
protein
Bebeli 19,80 16,50±0,57 c
Durhasandede 19,74 16,45±1,15 c
Hassas 3,31 2,76±0,57 a
Çukurova 11,23 9,36±0,57 b
Körkuyu 21,42 17,85±0,57 c
Yumurtalık 10,34 8,61±1,15 b
Kürkçüler 10,62 8,85±0,57 b
Bahçe 20,66 17,21±0,57 c
Şekil 4.6. α-naftol 450 nm standart eğri grafiği
4.3.2. Poliakrilamid Jel Elektroforez (PAGE) İle Esterazın İncelenmesi:
Adana ilinden toplanan A. gossypii popülasyonları ile hassas popülasyona ait elektroforez bant dizilişleri şekil 4.7.’de görülmektedir. Şekil incelendiğinde, hassas popülasyon ile bölgemizdeki popülasyonlarının farklı yoğunluklarda ancak benzer bant dizilişlerine sahip oldukları görülmektedir. Hassas popülasyona ait bantlar daha az yoğun olduğu gözlemlenmiştir. Diğer tarla popülasyonlarının da hassas popülasyona göre bant kalınlıkları daha yoğun bulunmuştur. En yoğun ve kalın bantlar ise sırasıyla Körkuyu, Bahçe ve Durhasandede popülasyonlarında en zayıf bant ise yumurtalık popülasyonunda gözlemlenmiştir. Dünyadaki çalışmalara bakıldığında, A. gossypii’de, esteraz aktivitesi, esteraz bant dizilişi ve insektisitlere direnç arasında ilişki olup olmadığına dair pek çok çalışma yapıldığı görülmektedir. Bu belirli esteraz bant dizilişleri ve aktiviteleri, yüksek düzeyde toplam enzim aktivitesi ve orta düzeyde organikfosforlu insektisit direnci ile yakından ilişkili bulunmuştur (O’Brien ve ark., 1992; Saito ve Hama, 2000).
O’Brien ve ark. (1992). Yapılan araştırmalarla, ABD (O’Brien ve ark. 1992), Çin (Moores ve ark. 1996, Han ve ark. 1998), Japonya (Suzuki ve ark. 1993, Saito ve
y = 0,0117x
Hama 2000), Avustralya (Herron ve ark. 2001), Afrika’nın (Deguine 1996) ve Avrupa’nın bir kısmında (Furk ve Hines 1993, Delorme ve ark. 1997) organikfosforlulara direnç durumu belirlenmiştir. Birçok araştırıcı organikfosforlulara direnç ile esteraz aktivitesi arasında pozitif korelasyonda bir ilişki olduğunu belirtmektedir (Takada ve Murakami, 1988; O’Brien ve Graves, 1992; Suzuki ve ark., 1993; Saito ve Hama, 2000).
Şekil 4.7. (a) Total esteraz protein aktivitesi, 1:Durhasandede, 2:Bebeli 3:Kürkçüler, 4:Çukurova üniversitesi, 5:Körkuyu, 6:Bahçe, 7:
yumurtalık, 8:Hassas, (b) Protein büyüklüğü PAGE, M:marker(Broad Range Markers: sc-2361) 1:Hassas, 2:Durhasandede, 3:Bebeli 4:Kürkçüler, 5:Çukurova üniversitesi, 6:Körkuyu, 7:Bahçe, 8:
yumurtalık, yaklaşk bant büyüklükleri 14 kDa.
4.3.3. Farklı Aphis gosyypii Popülasyonlarında Glutathion S-transferaz (GST) Aktivitelerinin Belirlenmesi
Glutathion S-transferaz (GST) enzim aktivitesinin belirlendiği çalışmada enzim aktivitesi bakımından popülasyonlar arasında istatistiki olarak fark önemli bulunmuştur(p<0,05). Popülasyonlar arasında GST enzim aktivitesi 40-140 pmol/dk/mg protein arasında değişen oranlar gözlemlenmiştir. Çalışmanın yürütüldüğü 8 popülasyondan hassas popülasyon en düşük GST aktivitesi gösterirken, Bahçe popülasyonu en yüksek aktiviteyi göstermiştir (P <0.05, df=23,
a b
F=1075,67) (Çizelge 4.7., Şekil 4.8.). Popülasyonlar arasında hassas haricinde en az GST aktivitesini Bebeli popülasyonu göstermiştir. GST aktivitesi genellikle organofosfat ve klorlandırılmış hidrokarbon grubu insektisitlerde dirençlilik oluşumunda rol almaktadır (Hemmingway ve ark., 1984; Rauch ve Nauen, 2003).
Bu bakımdan popülasyonların toplandığı alanlarda yoğun insektisit kullanımın olduğu ve yaprakbitlerinin bu ilaçlar nedeniyle direnç geliştirdiği söylenebilir.
Çizelge 4.7. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının glutathion S-transferaz (GST) aktiviteleri (nmol/dk mg protein)
örnek no: U/ml nmol/dk mg protein
Bebeli 6,55 54,58±0,57 b
Hassas 5,14 42,87±1,154 a
Durhasandede 7,07 58,93±0,57 c
Çukurova 7,77 64,78±0,57 d
Körkuyu 9,02 75,17±1,154 e
Yumurtalık 10,88 90,66±0,57 f
Kürkçüler 10,56 88,02±0,57 f
Bahçe 17,06 142,23±1,67 g
* Aynı sütun içinde aynı harfi içeren ortalamalar arasındaki fark Duncan testine göre istatistiki olarak önemli değildir. (P=0.05)
0
Şekil 4.8. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının GST aktivite grafikleri
4.3.4. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarında asetilkolinesteraz (AChE) enzim aktivitelerinin belirlenmesi
AChE aktivitesinin belirlendiği çalışmada enzim aktivitesi bakımından popülasyonlar arasında istatistiki olarak fark önemli bulunmuştur(p<0,05). AChE enzim aktivitesi 0,8-20 pmol/dk/mg protein arasında değişen oranlar gözlemlenmiştir. Denemenin yürütüldüğü 8 popülasyondan hassas popülasyon en düşük AChE aktivitesi gösterirken, Körkuyu popülasyonu en yüksek enzim aktivitesi göstermiştir (P <0,05, df=23, F=125,45) (Çizelge 4.8., Şekil 4.9.). AChE aktivitesi böceklerde organofosfatlı ilaçlara karşı dirençlilik etkin bir enzimdir.
Popülasyonlar arasında hassas haricinde en az esteraz aktivitesini Yumurtalık popülasyonu göstermiştir. Organofosfatlı ilaçlara dirençlilik açısından AChE aktiviteleri karboksilesteraz aktivitelerine paralellik göstermektedir. Bu bakımdan popülasyonların toplandığı alanlarda daha önce ve hala organik fosforlu ilaçların kullanıldığı ve yaprakbitlerinin bu ilaçlar nedeniyle direnç geliştirdiği düşünülebilir.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
U/mg dk protein
Asetilkolinesteraz (AChE) aktivitesi
Çizelge 4.8. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının asetilkolinesteraz (AChE) aktiviteleri (nmol/dk mg protein)
örnek no: U/ml nmol/dk mg protein
Kürkçüler 1,43 1,19±0,60 a
Çukurova 1,43 1,19±0,57 a
Bahçe 11,79 9,83±0,57 b
Yumurtalık 1,10 0,91±0,005 a
Durhasandede 1,91 1,59±0,57 a
Hassas 0,88 0,73±0,02 a
Bebeli 2,27 1,89±0,57 a
Körkuyu 19,18 15,98±0,57 c
* Aynı sütun içinde aynı harfi içeren ortalamalar arasındaki fark Duncan testine göre istatistiki olarak önemli değildir.(P>0.05).
Şekil 4.9. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının AChE aktivite grafikleri
4.3.5. Farklı Aphis gosyypii Popülasyonlarında Sitokrom P450 Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi
Sitokrom P450 enzim aktivitesinin belirlendiği çalışmada enzim aktivitesi bakımından popülasyonlar arasında istatistiki olarak fark önemli bulunmuştur.
Sitokrom P450 enzim aktivitesi 0,05-4 nmol/dk/mg protein arasında değişen oranlarda saptanmıştır. Denemenin yürütüldüğü 8 popülasyondan hassas popülasyon en düşük P450 aktivitesi gösterirken, Körkuyu popülasyonu hassasa oranla 74 kat daha fazla protein miktarıyla en yüksek aktiviteyi göstermiştir (P
<0.5, df=23, F=10,34) (Çizelge 4.9.). Ardından sırayla Kürkçü 54 kat Bahçe 36 kat daha fazla protein yani P450 enzim aktivitesi göstermiştir. Popülasyonlar arasında hassas haricinde en az esteraz aktivitesini Bebeli popülasyonu göstermiştir. P450 enzim aktivitesi böceklerde neonikotinoidli ilaçlara karşı dirençlilikte etkin bir enzimdir. Neonikotinoidli ilaçlara dirençlilik açısından P450 aktiviteleri biyoanaliz aktivitelerine paralellik göstermektedir. Yani en dirençli popülasyonlardan Körkuyu, Kürkçüler ve Çukurova popülasyonlarıyla alakalı olarak P450 aktiviteleri de hassasa oranla yüksek düzeyde bulunmuştur. Bu bakımdan popülasyonların toplandığı alanlarda neonikotinoidli ilaçların kullanıldığı ve afidlerin bu ilaçlara karşı direnç geliştirdiği düşünülmektedir.
A.gossypii ile yapılan çalışmalarda aynı popülasyonların yüksek düzeyde P450 enzim aktivitesine paralel olarak neonikotinoidli biyoanaliz çalışmalarında da hassasa oranla dirençlilik olduğunu bildirmişlerdir (Shang ve ark., 2012;
Seyedebrahimi ve ark., 2015).
Neonicotinoid direnç mekanizmasının nAChR genindeki mutasyonlarla alakalı bir kısım çalışmalara olsa da genellikle doğrudan bir ksenobiyotik ya da detoksifikasyon enzimi olan P450 monooksigenazla (7-ethoxycoumarin O- deethylase (ECOD)) ilişkili olduğu bildirilmektedir (Karunker ve ark 2008; Nauen ve ark., 2008; Wang ve ark., 2009).
En yaygın P450 detoksifikasyonu kaynaklı dirençlilik çalışması Bemisia tabaci’de yapılmıştır. İlk kez B.tabaci Q-tipinde İspanya’da imidaclorpide 1000 kat dirençli popülasyonlar bildirilmiştir. (Rauch ve Nauen, 2003; Nauen ve Denholm, 2005). Daha sonraları P450 geni CYP6CM1 geninin aşırı ekspresyonunun B.tabaci’nin imidaclorpid dirençliliğiyle bağlantılı olduğu ortaya konulmuştur (Karunker ve ark., 2008). Ancak A. gossypii neonicotinoid dirençli P450 enzimleri ilişkili çalışmaların sayıları sınırlıdır. Pan ve ark., 2015 yılında thiametoxam dirençli ve hassas A.gosypii’lerde kıyaslamalı transkriptom analiziyle yapmış olduğu çalışmada 620 önemli farklı genin önemli düzeyde eksprese olduğunu ancak P450 geni ekspresyonunda önemli bir fark bulamadığını bildirmiştir.
Hemen hemen bütün insektisit sınıflarında dirençlilik metabolizmasında P450 kaynaklı ekspresyonlara rastlanmıştır (Scott ve Wen, 2001; Li et al., 2007). P450 sistemi ve izoformlarının çokluğu karmaşık yapısından dolayı dirençliliğin arkasındaki nedenlerin tam olarak anlaşılması mümkün olmamıştır (Scott ve Wen, 2001; Feyereisen, 2005; Wang ve ark., 2007). Ancak pekçok yönden dirençliliğn meydana gelmesinde P450 genlerinin aşırı ekspresyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir. En yaygın P450 detoksifikasyonu kaynaklı dirençlilik çalışması Bemisia tabaci’de yapılmıştır. İlk kez B.tabaci Q-tipinde İspanya’da imidaclorpide 1000 kat dirençli popülasyonlar bildirilmiştir (Rauch ve Nauen, 2003; Nauen ve Denholm, 2005). Daha sonraları P450 geni CYP6CM1 geninin aşırı ekspresyonunun B.tabaci’nin imidaclorpid dirençliliğiyle bağlantılı olduğu ortaya konulmuştur (Karunker ve ark., 2008).
Yapılan çalışmalar ışığında popülasyonlarda neonicotinoid dayanıklılığının nedeninin yüksek monooksigenaz aktivitesinden kaynaklandığını ortaya koymuştur.
Çizelge 4.9. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının sitokrom P450 enzim aktiviteleri (nmol/dk/mg protein)
örnek U/ml protein nmol/dk/mg protein enzim oran
Yumurtalık 0,608 0,507±0,04 ab 9,94
Durhasandede 1,825 1,521±0,57 bcd 29,83
Bahçe 2,251 1,876±0,57 cd 36,79
* Aynı sütun içinde aynı harfi içeren ortalamalar arasındaki fark Duncan testine göre istatistiki olarak önemli değildir. (P=0.05)