3. MATERYAL VE METOD
3.2. Metot
3.2.3. Aphis gossypii Popülasyonlarında Neonicotinoid Dirençliliğin
Biyokimyasal analizlerde enzim okumalarında 96 kuyulu U.V. geçirgen şeffaf plateler ve Multiskan Go (ThermoScientific) plate okuyucusu kullanılmıştır (Şekil 3.9.).
Şekil 3.9. Microplate okuma cihazı (a) ve analizlerde kullanılan şeffaf plate(b)
3.2.3.1. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının Toplam Esteraz (EST) enzim aktivitelerinin belirlenmesi
ESTs grubu, karboksilesteraz (CE) enzim ailesi oldukça çok yönlü üç boyutlu α/β katlanmış hidrolitik yapıda enzim grubudur (Oakeshott ve ark., 2010).
Bu enzim suyu kullanarak ester bağlarını hidrolize edip su ve alkol metabolitlerinin oluşmasını sağlar (Testa ve Kramer, 2007). Günümüzde yaygın olarak kullanımda
olan organofosfata, karbamat ve piretiroidli kimyasal gruplardaki insektisitler ester bağlarına sahiptir ve EST aktivitesine maruz kaldılarında detoksifiye olmaları zayıf yanlarıdır (Sogorb ve Vilanova, 2002; Russell ve ark., 2011). Pekçok yönden ester gruplarının hidrolizi insektisitlerin hedef bölge etkinliğinin bozulmasına ve toksisitesinin azalmasına neden olmaktadır (Sogorb ve Vilanova, 2002). EST kaynaklı metabolik direnç genel olarak iki mekanizmaya dayanır. Bunlar gen amplifikasyonu kaynaklı ve gen ifadelerinin ekspresyonundan kaynaklanan nedenlerdir (Li ve ark., 2007). Gen amplifikasyonlarına dayanan daha güçlü sekresyonun organofosfatların, karbamatların ve piretiroidlerin etkisizleştirilmesine neden olduğu Hemiptera ve Diptera takımlarında gözlemlenmiştir (Field ve ark., 1999; Bass ve Field, 2011). Myzus persicae’de E4 ve FE4 CE genlerinin gen amplifikasyonlarının organofaosfatlu karbamatlı ve piretiroidli insektisitlerin bozulmasında etkin olduğu da ortaya konmuştur (Devonshire, 1989). CE genleri gen regülasyonunun üst düzeyde aktivasyonu ile meydana gelen dirençliliğe Diptera, Hemiptera ve Hymenoptera takımlarında rastlanmıştır (Hemingway ve ark., 2004; Bass ve Field, 2011). Ayrıca imidaclorpid dirençli A. gossypii türünde AChE ve alfa-naftil asetat (α-NA) ESTs enzimlerinin de yüksek miktarda bulunduğu bildirilmiştir (Wang ve ark., 2002).
20 A.gossypii birey 100 μl sodyum fosfat buffer (0.1M, pH 7.5) (%0.1 Triton X-100 içeren) içinde homojenize edilmiştir. Bu homojenat 10000 g’de +4
oC’de ve 5 dk santrifüj edildikten sonra enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Enzim kaynağı olarak kullanılan supernatant 10 kez seyreltilmiştir. Mikroplakanın hücrelerine 25 μl supernatant +25 μl fosfat buffer (0.2 M, pH:6) konulmuştur.
Çalışma hücrelere 200 μl substrat solüsyonunun eklenmesiyle başlatılmıştır.
Substrat solüsyonu 30 mg fast blue RR tuzunun 50 ml 0.2 M sodyum fosfat buffer’da çözülmesi ve bu karışıma 500 μl 100 mM α – naphtyl acetate’ın eklenmesiyle elde edilmiştir. Enzim aktivitesi 23 oC’de, 450 nm’de 10 dk süreyle Multiskan Go (Thermo Scientific) plate okuyucu ile okunmuştur. Kontrol hücreleri
ise homojenatsız olarak okunmuştur. Enzim okumaları en az üç tekerrürlü olacak şekilde yapılmıştır (Stumpf ve Nauen, 2002).
3.2.3.1.(1). α-naftol standart eğrisinin hazırlanması
Esteraz aktivitesi tayininde doğru hesaplama yapılabilmesi için α-naftol standart eğrisi çizilmiştir. Bunun için; 14,42 mg (100 μ mol) α-naftol 5 ml aseton içinde çözülerek stok solüsyonu hazırlanmıştır. Boya solüsyonu olarak taze % 1 Fast blue BB tuzu w/v 0,04 M Na-P tamponu içerisinde çözülmüştür. Stok çözeltiden 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ve 45 μl alınarak Na-P tamponla (40 mM, pH 6.8) 1 ml’ye tamamlanmış α-naftol standart solüsyonları hazırlanmıştır. Kör olarak 1ml α-naftol içermeyen Na-P tampon kullanılmıştır. Standart solüsyonlarından ve körden 1 ml alınarak, Na-P tamponla 5 ml’ye tamamlanmıştır.
Son olarak bu karışıma 1 ml boya solüsyonları eklenmiştir. Son karışım karanlıkda oda sıcaklığında 20 dk inkübe edilmiş ve 450 nm de köre karşı absorbans değerleri okunarak Microsoft excel paket programında standart eğrisi çizilmiştir (Şekil 4.6).
EST aktivitesi = [Δ(Absorbans)/Δ(dakika)] x [Vt (toplam örnek hacmi) / Vö (örnek hacmi) x
ɛ
x 1cm]x 106= pmol/min/ml (U/ml)
ɛ
(ekstinsiyon katsyısı) = 0,011 mM/cm (Alfa naftol standart eğrisinden hesaplanmıştır.)Spesifik EST aktivitesi = [pmol/min/ml] / [mg protein / ml] = pmol/min/mg protein
3.2.3.2. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının glutathion S-transferaz (GST) enzim aktivitelerinin belirlenmesi
GSTs enzimler indirgenmiş glutatyonun konjugasyonunda ksenobiyotik metabolizmasında detoksifikasyon amacıyla oldukça etkin iyi bilinen ve önemli bir
enzim grubudur (Mannervik ve Danielson, 1988). Yoğun GST aktivitesi bireysel dirençlerin oluşumunda organofosfat, organoklorin, DDT (dichlorodiphenyltrichloroethane) ve piretiroit kimyasal sınıflarında yaygın olarak gözlemlenmiştir (Ranson ve Hemingway 2005; Li ve ark., 2007). GST dirençlilik mekanizması temelinde GSTs gen amplifikasyonları ve aşırı düzeyde ekspresyonların meydana gelmesi yatar. Organofosfat dirençli Musca domestica ve piretiroid dirençli Nilaparvata lugens’de dirençlilik GST enzimlerinin aşırı üretiminden sorumlu MdGSTD3 ve NlGSTD1 genlerinin neden olduğu ortaya konmuştur (Syvanen ve ark., 1996; Vontas ve ark., 2001; Vontas ve ark., 2002).
Imidaclorpid ve acetamiprid dirençli pamuk yaprakpiresi Amrasca bigutulla bigutulla (Ishida)’da dirençlilikle alakalı olarak yükseltgenmiş GST aktivitelerine rastlanmıştır (Kshirsagar ve ark., 2012).
GST enziminin kinetik olarak belirlenmesinde Stumpf ve Nauen (2002)’in geliştirdikleri yöntem kullanılmıştır.
1. 30 birey 300 μl Tris HCL buffer (0.05M, pH:7.5) içinde homojenize edilmiştir.
2. Supernatant 10000g, +4 oC’de 5 dk santrifüj edilmiştir.
3. 100 μl supernatant, 100 μl 1-chloro-2,4- dinitrobenzene (CDNB) ve 100 μl indirgenmiş glutathione (GSH)’dan oluşan toplam hacim mikroplaka hücrelerine konulmuştur. CDNB %0.1 ethanolde hazırlanmış ve son konsantrasyonda hücrelerde 0.4 mM CDNB bulunmuştur. GSH Tris HCL tamponda hazırlanmış ve son konsantrasyonda hücrelerde 4 mM GSH bulunmuştur.
4. Absorbanstaki değişim 340 nm, 25 oC’de ve 5 dk’da okunmuştur. Enzim okumaları en az üç tekrarlı olacak şekilde yapılmıştır.
Toplam GST aktivitesi = [Δ(Absorbans)/Δ(dakika)] x [Vt (toplam örnek hacmi) / Vö (örnek hacmi) x
ɛ
x 1cm]x 106= pmol/min/ml (U/ml)
ɛ
(ekstinsiyon katsyısı) = 8,6 mM/cm (Srigiriraju, 2008)3.2.3.3. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının asetilkolinesteraz (AChE) enziminin kinetik olarak incelenmesi
Asetilkolinesteraz belirlenmesinde Stumpf ve ark., (2001)’na ait yöntem kullanılmıştır.
1. Aphis gossypii 50 bireyi eppendorf tüp içinde bulunan 500 μl %0.1 Trion X-100 içeren fosfat buffer (0.1,M pH:7.5) içinde plastik ezici ile homojenize edilmiştir.
2. Buz içinde 20 dakika dokuların çözülmesi beklendikten sonra, homojenat 10 000 g, 4 oC’de ve 5 dk santrifüj edilerek elde edilen supernatant enzim kaynağı olarak kullanılmıştır.
3. AChE aktivitesini ölçmek için mikroplaka hücrelerine 100 μl acetylcholine iodide (ATChI), 100 μl 5.5-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) ve 100 μl enzim solüsyonu konmuştur. 300 μL’lik son konsantrasyonunda her bir maddenin miktarı 0.5 mM olmuştur. AChE aktivitesi kinetik mikroplaka okuyucuda 23 oC’de 412 nm’de 20 dakikada ölçülmüştür. Kontrol hücreleri ise homojenatsız olarak okunmuştur. Deney üç kez tekrarlı olacak şekilde yapılmıştır.
Toplam AChE aktivitesi = [Δ(Absorbans)/Δ(dakika)] x [Vt (toplam örnek hacmi) / Vö (örnek hacmi) x
ɛ
x 1cm]x 106= pmol/min/ml (U/ml)
ɛ
(ekstinsiyon katsyısı) = 1,36 mM/cm (Srigiriraju, 2008)3.2.3.4. Farklı Aphis gossypii popülasyonlarının Monooksigenaz (P450) aktivitesinin belirlenmesi
P450 enzimleri hücre içi mikrozomal elektron transferinde görevli yağlı asitler, steroidler gibi içsel bileşiklerin oksidatif metabolizmasında ve dışsal kaynaklı ksenobiyotik metabolizmasında etkin görevli enzimlerdir (Hodgson, 1985). Böceklerde P450 enzimleri pekçok işlevde görev alır. Bunlar büyüme ve gelişme, konukçu bitkilerin sentezlediği toksik metabolitlerin detoksifikasyonu, insektisitlerin detoksifikasyonunda ya da moleküllerin aktivasyonu gibi çeşitli görevlerde bulunur (Feyereisen, 1999). P450 enzimlerinin varyantları hidroksilasyon, epoksidasyon, O-, N-, ve S-dealkilasyon yada N- ve S-oksidasyonu gibi pestisit metabolizmasında görevli çok önemli 60 kadar farklı enzimatik reaksiyonlarda etkindir. Hemen hemen bütün insektisit sınıflarında dirençlilik metabolizmasında P450 kaynaklı ekspresyonlara rastlanmıştır (Scott ve Wen, 2001; Li ve ark., 2007). P450 sistemi ve izoformlarının çokluğu karmaşık yapısından dolayı dirençliliğin arkasındaki nedenlerin tam olarak anlaşılması mümkün olmamıştır (Scott ve Wen, 2001; Feyereisen, 2005; Wang ve ark., 2007).
Ancak pekçok yönden dirençliliğin meydana gelmesinde P450 genlerinin aşırı ekspresyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir.
P450 enzim aktivitesinin belirlenmesi için Hansen ve Hodgson (1971) yöntemi kullanılmıştır.
1. 50 adet Aphis gossypii bireyi eppendorf tüp içinde bulunan 500 μl %0.1 Triton X-100 içeren fosfat buffer (0.1,M pH:7.5) içinde plastik ezici ile homojenize edilmiştir.
2. Homojenat 10 000 g’de, 4 ℃’de ve 5 dk santrifüj edilerek elde edilen supernant enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Mikroplaka hücrelerinin herbirine stok solüsyondan 90 μl enzim kaynağı, substrat olarak 100 μl 2mM p-nitroanisole (PNOD) karıştırılmıştır.
3. 27 oC’de 2 dk inkübe ettikten sonra 10 μl 9,6 mM nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) ilave edilerek reaksiyon başlatılmıştır.
4. P450 enzim aktivitesinin ölçülmesi microplate okuyucuda 27 oC ve 405 nm dalga boyunda 10 saniye aralıklarla 10 dk boyunca tutularak, ölçüm verileri alınmış ve Bradford (1976)’a göre protein miktarları hesaplanmıştır.
Monooksigenaz aktivitesi = [Δ(Absorbans)/Δ(dakika)] x [Vt (toplam örnek hacmi) / Vö (örnek hacmi) x
ɛ
x 1cm]x 106 = pmol/min/ml (U/ml)ɛ
(ekstinsiyon katsyısı) = 3,32 mM/cm (Srigiriraju, 2008)3.2.3.5. Toplam protein miktarlarının belirlenmesi
A. gossypii bireylerinin toplam protein miktarları bovin serum albümin (BSA)’nın standart olarak kullanıldığı Bradford (1976) metoduna göre belirlenmiştir. Bu metoda göre;
1. Tris HCL (0.05M, pH:7.5) tamponda plastik sivri uçlu spatul yardımıyla tüp içinde ezilerek homojenize edilen yaprak biti homojenatının 10 μl’si protein miktarının belirlenebilmesi amacıyla microplate hücrelerine aktarılmıştır.
2. Aynı zamanda farklı konsantrasyonlarda 1x, 2x, 4x, 8x (1 mg/ml BSA (μl)) Bovin serum albumin ve örnek üzerlerine 250 μl Bradford reagent ekleyerek 15-20 dk oda sıcaklığında inkübasyona bırakılmış olup 595 nm dalga boyunda ölçülmüştür.
3. Ölçülen değerlerle BSA standart eğrisi çizilmiş, eğri denkleminden (y=4,56x) protein konsantrasyonları hesaplanmıştır (Şekil 4.13).
3.2.3.6. Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ile esteraz aktivitelerinin gösterilmesi
Willams ve Reisfeld (1964), metoduna göre poliakrilamid jel hazırlanmıştır. Jel kasetinin hazırlanmasında Clever Scientific marka dikey page elektroforez takımı kullanılmıştır (Şekil 3.10.). Cam plakaların üst kısmında 2 cm boşluk kalacak şekilde % 7,5’luk poliakrilamid jel dökülmüş ve yığma running jelin yaklaşık 30-60 dk polimerize olması için beklenmiştir. Daha sonra üzerinde kalan boşluğu dolduracak şekilde % 2,5’luk (stacking gel) poliakrilamid jel dökülmüş ve taraklar yerleştirilmiştir. 30-60 dk sonra jelin tamamen polimerize olması için beklenmiştir. Polimerizasyonu takiben % 10 sakkaroz, % 1,6 Triton X-100 ve %0.001 bromocresol purple’dan oluşan homojenizasyon çözeltisi hazırlanmıştır. Homojenizasyon çözeltisi içerisine eklenen bromocresol purple, izleme boyası olarak kullanılmıştır. Kanatsız ergin yaprakbiti bireyleri içerisinde 25 µl homojenizasyon çözeltisi bulunan mikrosantrifüj tüplerine tek aktarılmıştır.
Aktarılan yaprakbitleri, plastik sivri uçlu sapatüllerle ezilip homojenize edilmiş ve her bir poliakrilamid jel kuyucuğuna bu homojenatlardan 7,5 µl (yaklaşık 1/3 birey) aktarılmıştır. Örnekler dikey elektoforez tankında 250 voltta 1.5 saat süreyle glisin buffer (pH 7.0) içerisinde yürütülmüştür. 50 ml 0,2 M fosfat buffer (pH:6.0) içerisine 100 mg Fast Blue RR salt (4-benzoyllamino-2,2-dimethoxybenzene diazoniumchloride hemi [zinc chloride]salt; Sigma) konularak hazırlanan ve Whatman 1 no’lu filtre kağıdından süzülen boya çözeltisine subtrat olarak 1 ml 100 mM 1-naftil asetat (CH3CO2C10H7) ilave edilmiştir. Plakalardan çıkarılan jel hazırlanan bu çözeltiye alınmış, oda sıcaklığında yaklaşık 15 dk veya karboksilesteraz bantları net olarak görülünceye kadar boyama işlemi sürdürülmüştür. Boyanan jeller su ile yıkandıktan sonra % 7’lik asetik asit içerisine alınarak fikse edilmiştir. Elde edilen bu jeller bir gün sonra fotoğraflanmıştır.
Şekil 3.10. SDS Page ile elektroforez