Proteinler

Proteinlerin oluşumunda primer, sekonder, tersiyer ve kuaterner olmak üzere 4 yapı etkilidir [29]:

Primer yapı; bir protein zincirindeki amino asitlerin kovalent peptit bağla birleşmesi sonucu oluşmaktadır.

Sekonder yapı; polipeptid zincirlerin hidrojen bağı ile birleşmesi sonucu oluşmaktadır. Peptit zinciri α-heliks biçimindedir.

Tersiyer yapı; bir polipeptit zincirin katlanmasıyla veya kıvrılmasıyla oluşmaktadır. Bu yapıda hidrojen, kovalent, disülfit ve hidrofobik bağlar yer alabilmektedir.

Kuaterner yapı; birden fazla peptit zinciri içeren proteinler için kullanılan bir yapıdır. Belirli tersiyer yapıların kovalent bağı olmaksızın yığılmış halidir ve oldukça dayanıklı bir yapıdır [30]. Kompleks proteinler üzerine ışınlamanın etkisini belirleyebilmek için amino asit ve peptitler üzerinde oluşacak değişiklikleri tespit etmek gerekmektedir. 20 tane amino asit vardır ve her biri kendine özgü yapı ve kompozisyona sahiptir. Bu nedenle radyasyon kimyaları oldukça komplekstir [31].

Alifatik bir amino asit olan alaninin sulu çözeltisinin oksijensiz ortamda ışınlanmasıyla oluşan temel radyolitik reaksiyonlar şu şekildedir [5,20,32]:

⏐ ⏐ CH3 CH3

•H + H3N+⎯ CH ⎯ COO- → H3N+⎯ C• ⎯ COO- + H2 hidrojen kopması ⏐ ⏐

CH3 CH3

H H ⏐ ⏐

e-aq + H3N+⎯ C ⎯ COO- → NH3 + •C ⎯ COO- deaminasyon ⏐ ⏐

CH3 CH3

Oluşan radikaller daha sonra reaksiyona girmektedirler:

H3N+⎯ C•⎯ COO- + H3N+⎯ C•⎯ COO- → H2N+ = C ⎯ COO- + Alanin ⏐ ⏐ ⏐ CH3 CH3 CH3 +H2O +NH4 + O = C ⎯ COO- ⏐ CH3 pürivik asit +H2O

H3N+⎯ C• ⎯ COO- + •CH ⎯ COO- → H2N+= C ⎯ COO- + CH2 ⎯ COO- ⏐ ⏐ ⏐ ⏐

CH3 CH3 CH3 CH3

imino asit propiyonik asit

Karboksil gruptan α-karbona radikal transferi, başka bir reaksiyona yol açmaktadır. Böylece orjinal amino asitten bir eksik karbonlu aminler oluşmaktadır:

H H ⏐ ⏐

H3N+ ⎯ C ⎯ COO• → H3N+ ⎯ C• + CO2 dekarboksilasyon ⏐ ⏐

Dekarboksilasyon sonucu oluşan radikaller bir amin veya bir aldehit oluşturmak üzere başka bir radikal ile reaksiyona girebilmektedir:

2H3N+⎯ HC• → H2N+ = CH + H2N ⎯ CH2 ⏐ ⏐ ⏐ CH3 CH3 CH3 Etilamin +H2O +NH4 + CH = O ⏐ CH3 Asetaldehit

Radyolitik ürünlerin yapısı, oluştuğu amino asidin yapısına bağlı olarak değişiklik göstermektedir. Oksijensiz ortamda 1 M alanin çözeltisinin 10 kGy’de ışınlanması ile oluşan ürünler Tablo 4.3’te gösterilmektedir.

Tablo 4.3. Alaninin (1 M) ışınlanması (10 kGy) sonucu oluşan radyolitik ürünler [5]

Radyolitik ürün Miktarı (mg/kg) Pürivik asit 176 Propiyonik asit 80 Amonyak 79 Karbondioksit 27 Asetaldehit 27 Etilamin 8 Hidrojen 2.3 Ortamdaki oksijen konsantrasyonu yeterince yüksek ise, çözünmüş elektronlar ve hidrojen atomlarının uzaklaşmasıyla indirgen deaminasyon sınırlanmakta, hidroksil radikalleri aracılığıyla oksidatif deaminasyon ön plana çıkmaktadır [20,31].

Işınlamaya en hassas amino asitler, kükürt içeren amino asitler ve aromatik amino asitlerdir. Özellikle kükürt içeren amino asitler, alifatik amino asitlere kıyasla serbest radikallerle çok daha kolay reaksiyona girebilirler. Tiyol veya disülfit gruplarını içerdikleri için bu amino asitler, ışınlamaya karşı hassasiyet gösterirler. Genellikle kükürt kısımları okside olmakta ve H2S veya uçucu kükürt bileşenleri oluşmaktadır. Bunlar da gıda ürünlerinde istenmeyen kokunun oluşmasına neden olmaktadır [17,20,31].

–SH grubu içeren sisteinde öncelikle şu reaksiyonlar meydana gelmektedir [5]: e-aq + H3N+⎯ CH ⎯ COO- → H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- + H2S ⏐ ⏐ hidrojen sülfür CH2 ⎯ SH CH2• +H+

•OH + H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- → H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- + H2O ⏐ ⏐

CH2 ⎯ SH CH2 ⎯ S•

sistein sistein radikali

•H + H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- → H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- + H2 ⏐ ⏐

CH2 ⎯ SH CH2 ⎯ S•

sistein sistein radikali

Bu reaksiyonlarla oluşan alanin ve sistein radikalleri, aşağıdaki gibi reaksiyonlara girebilmektedir:

H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- + H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- → Alanin + H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- ⏐ ⏐ ⏐

CH2 • CH2 ⎯ SH CH2 ⎯ S•

alanin radikali sistein sistein radikali

2 H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- → H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- H3N+ ⎯ CH ⎯ COO- ⏐ ⏐ ⏐

CH2 ⎯ S• CH2 ⎯ S ⎯ S ⎯ CH2

sistein radikali sistin

Sisteinin ışınlanmasıyla hidrojen, hidrojen sülfür, alanin ve sistin gibi kararlı son ürünler oluşmaktadır.

Metiyoninin ışınlanması, metil merkaptan ve hidrojen sülfür oluşumuna yol açmaktadır. Bu bileşenler, gıdalarda kötü koku ve flavorun oluşumuna yol açtığı için istenmemektedir [20]. Sığır eti proteinlerinin amino asit miktarının 0-1 oC’de ışınlama öncesi ve sonrasında test edildiği bir çalışmada, 200 kGy’de ışınlama sonucu amino asitlerde önemli bir parçalanmanın olmadığı tespit edilmiştir. Başka bir çalışmada da 71 kGy’de ışınlamanın sistin, metiyonin ve triptofan amino asitlerinde önemli oranda azalmaya neden olmadığı bildirilmektedir. 70 kGy’de ışınlama ile lizin kaybı mevcut değildir. Bununla birlikte pişirme ile esansiyel bir amino asit olan lizinde % 40’lık bir kayıp meydana gelmektedir [31].

Aromatik amino asitlerde temel reaksiyon, aromatik halkanın hidroksilasyonudur. Örneğin fenil alanin sulu ortamda ışınlandığında hidroksil radikalinin aromatik halkaya değişik pozisyonlarda bağlanmasıyla amino asit hidroksilasyonu gerçekleşmektedir. Bağlanma pozisyonuna bağlı olarak oluşan ürün orto-, meta -, para-tirozin olabilmektedir.

H3N+−CH− COO− H3N+−CH− COO− H3N+−CH− COO− CH2 CH2 CH2 OH O •OH •

fenil alanin o-tirozinin başlangıç ürünü o-tirozin

Daha sonraki oksidasyon, bunları 2,3-, 3,5- ve 3,4-dihidroksifenilalanine (dopa) dönüştürebilir. Tirozinle oluşan esas ürün 3,4-dopa’dır. 3,4-dopa ve fenilalaninin daha ileri oksidasyonu, melanin tipi renkli pigmentlerin oluşumuna yol açmaktadır. Orto-tirozin, ışınlanmış gıdaların tespiti için kullanılabilmektedir [20].

Histidin de radyasyona oldukça duyarlı amino asitlerdendir. Histidinin deaminasyonu, diğer amino asitlere kıyasla daha yüksek orandadır. Hem kenar zincirler hem de imidazol halkası amonyak oluşumuna katılmaktadır [5,33]. Dekarboksilasyon reaksiyonları ise histamin oluşumuna yol açmaktadır. Ancak oluşan miktar oldukça düşüktür ve yaklaşık olarak orijinal histidin miktarının % 1’i kadardır [20].

Peptitlerin radyasyon kimyasında peptit bağlarındaki kırılmalar etkili olmasına rağmen amino asitler için geçerli olan radyolitik reaksiyonlar da önem taşımaktadır. Peptid bağlarının artması, suda çözünmüş elektronlarla etkileşimi artırmaktadır. Peptidlerin ışınlanmasıyla oluşan başlıca radyolitik ürünler amonyak, yağ asitleri, keto asitler ve radikallerin rekombinasyonu ile oluşan diamino asitlerdir. Ancak diamino asitlerin önemi tam olarak bilinmemektedir ve sistin hariç bitki ve hayvan proteinlerinde bulunmamaktadır [20].

Proteinlerde iyonlaştırıcı radyasyonun neden olduğu reaksiyonlar, bu proteinlerin kompleks yapısından büyük oranda etkilenmektedir. Bu kompleks yapının oluşumunda peptit zincirlerinin katlanması, zincirler arasındaki disülfid bağları, hidrojen bağları, hidrofobik bağlar veya iyonik bağlar önem kazanmaktadır. Kovalent olmayan bağları yıkmak için gerekli olan enerji miktarı, bir kovalent bağ için gerekli olan enerji miktarından daha düşüktür. Dolayısıyla protein çözeltilerinin ışınlanmasında sekonder ve tersiyer yapıdaki değişiklikler ön plana çıkmaktadır [32]. Proteinlerin yapısı kadar doğal veya denature olup olmadığı, kuru, sulu veya dondurulmuş olup olmadığı ve başka maddelerin varlığı gibi faktörler de oluşan radyolitik ürünleri etkilemektedir. Ayrıca absorblanan doz, doz hızı, oksijen varlığı veya yokluğu gibi ışınlama koşulları da etkili olmaktadır. Polipeptit zincirde C-N bağlarının kırılmasının dışında, disülfid bağlarının kırılması da daha küçük moleküllü proteinlerin oluşumuna yol açmaktadır [5,17]. Işınlama süresince fibroz proteinler yıkıma uğramasına rağmen, globuler proteinler kümelenmektedir. Proteinlerin bölünmesi veya kümelenmesi; çözünmüş elektronlar, hidrojen atomu ve hidroksil radikali gibi suyun radyoliz ürünleri ile reaksiyona girebilecek aktif grupları içeren sekonder ve tersiyer yapıların karışıklığından kaynaklanmaktadır. Globuler proteinlerin kümelenmesi, polipeptit zincirler arasındaki çapraz bağlanmanın sonucudur [22].

Işınlama işlemi, proteinlerin yapısını değiştirebilmektedir. Ancak besin değeri ve sindirilebilirliği açısından herhangi bir problem söz konusu değildir. Çünkü amino asitler proteinin kompleks

üzerine yapılan bir çalışma, protein sindirilebilirliğinin % 100 korunduğunu göstermiştir. Ticari dozlarda (2-7 kGy) etlerin ışınlanması, besinsel özelliklerde önemli bir etkiye sahip değildir. Ayrıca proteinlerin biyolojik değerinde de belirgin bir azalma söz konusu olmamıştır [31]. Bebek mamalarındaki amino asit kompozisyonu üzerine ışınlamanın etkisinin araştırıldığı bir çalışmada da amino asit kompozisyonunda belirgin bir değişikliğin olmadığı tespit edilmiştir [34]. Bununla birlikte proteinlerin kümelenmesi veya parçalanması vizkoziteyi etkilemektedir. Örneğin ışınlama yumurta beyazının katılaşma özelliğini düşürmektedir [20,35,36].

Et ve et ürünleri bağ doku içermektedir. Bu nedenle gama ışınlamanın kollagenlere etkisi üzerine de çalışılmıştır. 50 kGy ve 500 kGy’lik dozlarda kristallenme özelliklerinde kayıp, çözünürlükte artış ve fiziksel özelliklerde değişiklikler gözlenmiştir. 500 kGy’de % 10-20 oranında amino asit kaybı tespit edilmiştir [31].

Miyozin kaslardaki en önemli proteinlerden birisidir. Sterilizasyon dozları (20-40 kGy) ve düşük sıcaklıklar, miyozin üzerinde önemli bir etkiye sahip değildir. 10 kGy’lik doz uygulaması, miyozinin çözünürlüğünü azaltmaktadır. Bu da su alma kapasitesinde azalmaya yol açmaktadır. Vakum altında ve daha düşük dozda (6 kGy) ışınlanmış etlerde ise miyozinin fazla etkilenmediği ve depolama süresince kararlılığını koruduğu belirtilmektedir [31].

Işınlanmış proteinlerin emülsiyon kapasitesi, kontrol ürünlerine kıyasla daha yüksektir. Işınlanmış ürünlerde daha düşük molekül ağırlığına sahip proteinlerin hidrolizi, emülsiyon kapasitesindeki artışın nedeni olabilir [31].

Işınlama ile proteinlerde oluşan değişiklik çok az olmasına rağmen enzimler ve kromoproteinler gibi bazı proteinler üzerine ışınlamanın etkisi büyük önem taşımaktadır.

Enzimler protein yapısında olduğu için iyonlaştırıcı radyasyona karşı benzer tepkiyi göstermektedir. Sulu sistemlerde enzim inaktivasyonu, suyun radyolitik ürünlerinin bir sonucudur. Bununla birlikte radyasyon kaynaklı enzim kümelenmesini, enzim aktivitesinin azalması ile ilişkilendirmek doğru değildir. Yüksek proteinli gıdaların depolanması süresince otolize sebep olan enzimler, soğuk pastörizasyon (2-5 kGy) veya sterilizasyon (~50 kGy) için kullanılan radyasyon dozlarında nadiren inaktif olurlar. Bu nedenle ışınlama ile sterilizasyonda enzimleri inaktif hale getirmek için bir ön ısıtmaya ihtiyaç vardır. Çünkü bu enzimler uzun süreli depolamalarda gıdaların proteolitik parçalanmasına yol açmaktadır. Kuzu karaciğeri ile gerçekleştirilen bir çalışmada 400 kGy’lik ışınlama dozunda bile enzimatik aktivitenin sürdüğü belirtilmektedir [20]. Ayrıca fosfolipaz ve toplam lipaz aktivitesini etkilemek için yaklaşık 100 kGy’lik dozlara ihtiyaç duyulurken; 10 kGy’lik bir doz, proteaz aktivitesinde yaklaşık olarak % 20 oranında azalmaya neden olmaktadır. Enzimlerin radyasyona karşı duyarlılığı, izoaskorbik asit gibi koruyucu maddelerin kullanımı ile azaltılabilmektedir [22]. Çünkü izoaskorbik asit, suyun radyolizi sonucu oluşan serbest radikaller ile reaksiyona girmek için enzimle yarışmaktadır. Seyreltik çözeltilerde enzimlerin inaktivasyonu, oksijen varlığından etkilenmemektedir. Oysa kuru ortamda oksijen varlığı, enzimlerin radyasyona karşı duyarlılığını artırabilmektedir.

Bazı gıdaların kalitesinin belirlenmesinde önemli kriterlerinden biri de renktir. Işınlama sonucu oluşan radyolitik ürünler, miyoglobinin oksidasyonuna, dolayısıyla istenmeyen aroma, koku ve renk değişikliğine neden olabilmektedir. Işınlama esnasında oluşan ozon, miyoglobini okside etmekte ve renk açılmasına neden olmaktadır. Renk değişimi, hem pigment tipine hem de ışınlama öncesi pigment formuna bağlıdır [37,38]. Işınlanmış tavuk göğüs eti pembe renk alırken, ışınlanmış sığır etinde kahverengileşme görülmektedir. Işınlanmış bu pigmentlerin gerçek yapısı daha yeni açığa kavuşturulmuştur. Azotlu ortamda ışınlanan taze etlerde oluşan

pembe rengin, metmiyoglobinden oluşan oksimiyoglobin olduğu belirtilmektedir [20]. Fe+2 içeren pigmentlerin (karboksimiyoglobin veya karboksihemoglobin) karboksi formu, domuz eti gibi açık renkli etlerin iç yüzeyinde ışınlama ile meydana gelen renk değişiminden sorumlu olmaktadır [37,38]. Işınlama sırasında etlerde oluşan pigmentler havayla temas ettiğinde kararlı değildir. Çünkü iç kısım pembe rengini korurken, dış kısım kahverengileşmektedir [19,20].

İyonlaştırıcı radyasyonun DNA ve RNA gibi nükleik asitler üzerine etkisini belirlemeye yönelik bir çok çalışma gerçekleştirilmiştir. DNA’daki değişiklikler, DNA heliksinin denatürasyonu şeklindedir. Bu değişikliklerin bazıları, ışınlanmış gıdaların dedeksiyonu için temel metot olarak kullanılmaktadır [39]. Bir çok gıdada miktarının az olması, daha düşük molekül ağırlığına sahip olması ve daha kolay parçalanması, DNA ile kıyaslandığında RNA ile çalışmayı zorlaştırmaktadır [11].