DNA komet analiz yöntemi

DNA Komet analiz yöntemi, prensipte DNA içeren tüm gıdaların ışınlanıp ışınlanmadığının belirlenmesinde kullanılan basit, hızlı ve spesifik bir tarama tekniğidir. Bu yöntem bir elektrik alanı uygulanan agaroz jelde DNA’nın taşınması esasına dayanır. Değişik hayvansal ve bitkisel gıdalara uygulanabilir. Özellikle tavuk, ördek, bıldırcın, sülün, dana eti, kuzu eti, geyik eti, balık (alabalık, somon) gibi hayvansal gıdalarda ve badem, incir, mercimek, soya fasulyesi, kuru fasulye, çilek, greyfurt, keten tohumu, susam, ayçiçeği, gül biberi gibi bitkisel gıdalara başarıyla uygulanmıştır [24].

DNA parçalanması, iyonlaştırıcı ışınlar dahil çeşitli kimyasal veya fiziksel işlemlerle meydana gelebilir. DNA içeren gıda maddeleri iyonlaştırıcı ışınlarla etkileştiğinde, bu büyük moleküllerde, tekli veya ikili zincir kırılmaları meydana gelir. Bu parçalanma tek hücrelerin veya çekirdeklilerin mikrojel elektroforez yöntemi ile incelenebilir. Hücre veya çekirdek mikroskop camı (lam) üzerinde agaroz içine yerleştirilir, özellikle çekirdek membranını parçalayan kimyasallar kullanılarak membranlar parçalanır.

Ayarlanabilir güç kaynağı ile elektroforezde ki preparata bir gerilim uygulanır. DNA parçaları uzayarak veya anot yönünde bir kuyruk oluşturmak suretiyle hücreden dışarıya göç eder ve hasar görmüş hücreler bir kuyruklu yıldız görüntüsü vererek uzar. Komet analiz yöntemi, DNA hasarını ölçmek için çeşitli koşullar altında uygulanabilir. Analiz hem bazik hem de nötral koşullar da yapılabilir. Genellikle, bazik koşullarda tekli ve ikili DNA zincir kırılmaları ve bazik- kararsız bölgeler incelenirken, nötral koşullarda sadece ikili DNA zincir kırılmaları incelenir. Ancak nötral koşullar kullanılarak tekli zincir kırılmaları, çekirdekteki ve süpersarmal DNA’nın açılması nedeniyle komet görünüşü üzerinde bir etki oluşturur. Işınlanmış hücreler çekirdekten anoda doğru DNA uzamasında bir artış gösterir. Böylece ışınlanmamış hücrelere göre daha uzun kometler (daha fazla parçalanma) meydana gelir.

Işınlanmamış hücreler hemen hemen dairesel şekilde veya yalnızca kuyruk görünümündedir (Şekil 9.12c). Özellikle lam üzerinde elektriksel güç uygulanarak göç eden kometler floresan

özellikli mikroskopta incelenip, kuyruk uzunlukları görüntü analiz sistemiyle ölçülebilir ve böylece birkaç dakika içinde yüzlerce hücre gözlenebilir. Elektroforezden sonra boyanmış DNA’nın oluşturduğu şekil, hücrelerin maruz kaldıkları işlemlere bağlıdır.

Işınlama DNA parçalanmasına neden olur, böylece komet (kuyruklu yıldız görünümü) gözlenir. Hasarsız hücreler, kuyruksuz veya çok az kuyruklu zarar görmemiş çekirdekler olarak görünür (Şekil 9.12 a, b, c) [24].

a. 7 kGy ile ışınlanmış donmuş biftekten tipik

DNA kometleri, gümüş boyama, sağa doğru anot, mikroskop objektifi x20 büyütme

b. 2 kGy ile ışınlanmış donmuş biftekten tipik

DNA kometleri, gümüş boyama, sağa doğru anot, mikroskop objektifi x20 büyütme

c. Işınlanmamış donmuş biftekten tipik DNA

kometleri, gümüş boyama, sağa doğru anot, mikroskop objektifi x20 büyütme

Şekil 9.12. Biftek örneklerinin komet kuyruklu yıldız görünümü

Slayt (lam) boyunca kometin şekli ve dağılımı hakkında genel bir fikir edinmek için önce düşük büyütmede (x 100) inceleme yapılır. Kometler daha sonra yüksek büyütmelerde (x 200 veya hatta x 400) ayrıntılı olarak incelenir. Gıdalara uygulanan ışınlama dozuna bağlı olarak DNA’da parçalanmalar oluşur. Bundan dolayı ışınlama işleminden etkilenen hücrelerde komet oluşumu gözlenirken, ışınlama işleminden etkilenmemiş hiçbir hücre DNA’sı komet oluşturmamaktadır. Buna karşın, ışınlanmamış gıda DNA’ları uygulamada her zaman belli miktarda kuyruksuz veya çok hafif kuyruklu komet oluşturabilir. Işınlanmış numunelerde her ne kadar farklı şekil ve uzunlukları olan belli sayıda hücre gözlenebilirse de, hasar görmemiş hücrelerin varlığı bu durum için karakteristiktir [24]. Işınlanmamış (Şekil 9.13a) ve ışınlanmış (Şekil 9.13b) tavuk eti DNA’sı Komet analiz yöntemi ile incelenmiştir.

a. Kontrol b. 2 kGy

Şekil 9.13. Tavuk eti DNA’sının komet kuyruklu yıldız görünümü [24]

İsveç Ulusal Gıda Kuruluşu adına düzenlenen laboratuvarlar arası bir denemede dokuz katılımcı laboratuvar, ışınlanmış ve ışınlanmamış tavuk kemiği iliği, tavuk ve domuz kas dokusundan yapılmış 3 farklı hücre süspansiyonu türünü analiz etmiştir. Işınlama dozları 0 kGy, 1 kGy, 2,5 kGy, 3 kGy ve 5 kGy arasında değişmiştir. Dağıtılan toplam 162 tane numuneden, 148 tane numune için geçerli sonuç bildirilmiştir. Bunlardan 138 tanesi doğru tespit edilmiştir. 106 tane ışınlanmış numuneden 99 tanesi doğru olarak belirlenirken, 42 tane ışınlanmamış örneğin 39 tanesi doğru belirlenmiştir (Tablo 9. 4) [24].

Tablo 9.4. Tavuk ve domuz eti için laboratuvarlar arası veriler [24]

Ürün numune Toplam sayısı Numune sayısı (geçerli sonuçlar)a Doğru teşhislerin sayısı Hatalı negatif teşhislerin sayısıb Hatalı pozitif teşhislerin sayısıc Tavuk kemik iliği 54 54 52 1 1 Tavuk kası 54 46 42 3 1 Domuz kası 54 48 44 3 1 Hepsi 162 148 138 7 3

a Eksik numuneler için sonuç bildirilmedi.

b Hatalı negatif tespitler, ışınlanmış numunelerin ışınlanmamış olarak tespit edilmesidir.

c Hatalı pozitif tespitler, ışınlanmamış numunelerin ışınlanmış olarak tespit edilmesidir.

Tablo 9.4’de sonuçları verilen tavuk ve domuz etlerinde yapılan çalışma sırasında bazı labotuvarların komet deneyinde yeterli tecrübesi olmadığı bilinmelidir. Her ne kadar, her laboratuvar tavuk kemik iliğinden hazırlanan 0 kGy, 1 kGy, 3 kGy veya 5 kGy ile ışınlanmış ve verilen dozla etiketlenmiş referans numuneleri aldıysa da bazı labrotuvarlarda bu yeni yöntemde bazı zorluklar yaşanmıştır. Bununla birlikte altı laboratuvar bütün örnekleri doğru olarak tespit etmiştir [24].

Başka bir ortaklaşa deney, badem, incir, mercimek, keten tohumu, gül biberi, susam, soya fasulyesi ve ayçiçeği olmak üzere çeşitli bitkilerle yapılmıştır. Kodlanan örnekler ışınlanmamış veya 0.2 kGy, 1 kGy veya 5 kGy’lik dozlarda ışınlanmıştır. Kodlanan 20 örneğe ek olarak, katılımcılara bilinen ışınlama dozlarında 12 numunelik bir referans örnek grubu verilmiştir. Bu laboratuvarlar arası araştırmaya dört laboratuvar katılmıştır. Alınan toplam 78 sonuçtan 74 tanesi doğru olmuştur (% 95). Sonuçlar Tablo 9.5’de verilmiştir [24].

Tablo 9.5. Deneye tâbi tutulan bitki hücreleri için laboratuvarlar arası veriler (ışınlamadan

sonra 10 ay depolama için) [24]

Ürün Toplam örnek sayısı Örnek sayısı (geçerli sonuçlar)a Doğru teşhislerin sayısı Hatalı negatif teşhislerin sayısıb Hatalı pozitif teşhislerin sayısıc Işınlanmamış 32 31 29 0 2 Işınlanmış 48 47 45 2 0 Hepsi 80 78 74 2 2

a Parçalama şartlarında karşılaşılan problemlerden dolayı laboratuvarlardan biri soya

fasulyesine ilişkin sonuç vermemiştir.

b Hatalı negatif teşhisler, ışınlanmış numunelerin ışınlanmamış olarak teşhis edilmesidir. c Hatalı pozitif teşhisler, ışınlanmamış numunelerin ışınlanmış olarak teşhis edilmesidir.

Işınlama dozunun değerlendirilmesi, örneğin bilinen, farklı dozlarda ışınlanmış örneklerin kullanıldığı referans lamlarla karşılaştırılmasıyla yapılabilir. Bunlar, incelenmekte olan bilinen dozlarda ışınlamaya maruz kalmış gıdalardan hazırlanır. İdeal olarak bilinmeyen örnekler aynı koşulların sağlanması için referans lamlarla birlikte yürütülmelidir. Metodun bir tarama deneyi olarak işlev yaptığı ve DNA parçalanmasının diğer yollar ile de elde edilebilmesi mümkün olduğundan alınan sonuçların ışınlamaya özgü başka bir teknikle doğrulanması gerektiği bilinmelidir [24].

Hücre süspansiyonu hazırlanması komet deneyinin uygulanmasında önemli bir basamaktır. Çünkü bu aşama komet deneyinin uygulanması için ön koşuldur. Bazı gıda maddeleri örneğin, papayalar, tamarinler gibi birçok ham hücre kalıntısı komet şekilleriyle girişim yapar ve bundan dolayı uygun bir zemin elde edilmesi zorlaşır. Bu nedenle hücre süspansiyonlarının hazırlanmasında bazı ilâve basamaklar gerekir. Bazı sert kabuklu meyveler, baharat ve balıklar gibi ürünler için uygun hücrelerin elde edilmesi zor olabilir. Isıl işlem görmüş gıdalar da aşırı ısı tahribatı sebebiyle hücre elde edilemez. Haşlanmış karides ve pişmiş (mikrodalgada) tavukta uygun hücreler genellikle bulunmaz [24].

Taze etin depolanma koşullarına (sıcaklık ve hayvanın kesimi ile dondurma arasındaki süre) bağlı olarak, doğal enzimatik DNA bozulması gerçekleşir ve bu da DNA parçalanmasına yol açar. Bu durumdaki kometler değişik şekildedir. İleri düzeyde DNA bozulması gösteren çok sayıda hücrenin varlığı yalnızca yetersiz depolama şartlarının bir göstergesi olabilir. Ayrıca etin tekrarlanan dondurma çözme işlemi de ileri derecede DNA hasarına neden olur. Diğer bir kısıtlama, DNA parçalarının çekirdekten dışarı göçünü sağlayan membranları geçirgen yapmak için uygulanan hücre parçalanmalarının yetersiz olması olabilir [24]. Bazı bitki hücreleri için parçalanma süresinin artırılması zorunlu olmuştur. Örneğin bu süre soya fasulyesi ve greyfurt için 30-60 dakika dır.

Bazı sert kabuklu meyveler, tohumlar ve baharat gibi bazı gıdalar için hücre preparatları elde edilmiş ancak ışınlanmış ve ışınlanmamış numuneleri ayırt etmede zorluklar çıkmıştır. Zorluklar, aynı zamanda düşük ışınlama dozu ile ışınlanması gereken soğanlar ve patatesler gibi gıdalarda da gözlenmiştir. Muhtemelen ileri düzeyde görüntü analizi kullanımı teşhise yardımcı olabilir, ancak sadece görsel inceleme ile numunenin ışınlanıp ışınlanmadığı konusunda karar vermek zordur [24].