pneumoniae invaziv enfeksiyonlarının kesin tanısı steril vücut sıvılarından etkenin izolasyonuna dayanır. BOS ve diğer normalde steril vücut bölgelerinden

klinik örneklerin direkt Gram boyaması tanıda yönlendiricidir, ancak,

organizmanın boyalı preparatta görülebilmesi için BOS veya kanda hayli yüksek konsantrasyonda (yaklaĢık 10⁴ bakteri/mL) olması gerekir (8).

Pnömokoklar sıklıkla üst solunum yollarında hastalığa neden olmaksızın kolonize olabildiğinden steril olmayan vücut bölgelerinden (ör., balgam, konjonktiva) organizmayı izole etmenin klinik değeri Ģüphelidir. Böyle durumlarda balgam kültürlerinin değerlendirilmesine Gram boyama yardımcı olabilir; balgamın Gram yaymasında gram pozitif diplokokların üstünlüğü ile birlikte her mikroskop

sahasında >25 lökosit ve <10 düz epitel hücresi gözlenmesi pnömokokkal pnömoni tanısını destekler (7). Ancak bu tanı, invaziv pnömokokkal hastalık vaka tanımına dahil etmek için yeterli değildir ve ulusal sürveyanslar açısından bildirime esas olarak kabul edilmemektedir (3,7).

S. pneumoniae‟nın mikrobiyolojik tanısında ayrıca pnömokokkal kapsüler antijen saptama testleri ve moleküler yöntemler de kullanılabilir.

Sayfa 6 / 24 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-05 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

Kültür

Kültür tanıda „altın standart‟tır. Pnömokoklar rutinde kullanılan KKA ve ÇA gibi besiyerlerinde kolay ürer. Üremek için özel atmosfer koĢullarına veya besleyici faktörler ile zenginleĢtirilmiĢ besiyerine ihtiyaç göstermezler. Bakterinin

izolasyonu gerçekleĢtiğinde, az sayıda fenotipik test ile tanımlanabilmesi bir avantajdır. Ayrıca kültür duyarlılık ve serotipleme iĢlemleri için de izolat elde edilmesini sağlaması ve sonucun kesin tanı kriteri olması nedeniyle geliĢen test tekniklerine rağmen tanıda halen öncelikle tercih edilen yöntemdir (5,6,9).

Antibiyotik duyarlılığının belirlenmesi ve epidemiyolojik çalıĢmalar için de etkenin kültürlerden izolasyonu önem taĢır. Kültürde üreyen pnömokok Ģüpheli kolonilere optokin duyarlılığı ve safrada erime testleri yapılarak bakteri tanımlanır (5,6,9).

Antijen testi

Ġnvaziv pnömokokkal hastalık tanısında bakterinin kapsüler antijenlerinin doğrudan steril vücut sıvılarında (idrar, BOS, serum vb.) aranmasına dayalı testler bulunmaktadır.

Bu testlerin tanı değeri enfeksiyon bölgesine ve konak özelliğine göre (yaĢ vb.) değiĢebilmektedir. Pozitif sonuçlar ampirik antimikrobiyal tedavisinin

spektrumunu daraltacağı için önemlidir (6,5,9).

Moleküler yöntemler

S. pneumoniae‟nin klinik örneklerde saptanması ve serotiplendirilmesi için PCR yöntemi kullanılabilir. Moleküler yöntemler kültür ile desteklenmelidir. Multipleks ve RT PCR yöntemleri için CDC kaynaklarından yararlanılabilir (5,11).

Teknik Bilgiler

1 Hedef mikroorganizma

Streptococcus pneumoniae

2 Tanı için asgari laboratuvar koĢulları

2.1. Laboratuvar güvenliği

S.pneumoniae Risk Grubu 2 organizmadır. Tüm laboratuvar iĢlemleri BGD2 laboratuvar koĢullarında gerçekleĢtirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve standart güvenlik önlemleri alınmalıdır. Menenjit veya invaziv enfeksiyon Ģüpheli örneklerden kültürler ve etkenin tanımlanması ile ilgili tüm laboratuvar iĢlemleri sınıf-IIA biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.

Önlemler risk değerlendirmesi ile desteklenmelidir. BGD2 düzey, çalıĢma koĢulları ve dikkat edilmesi gereken bütün konular için ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar Güvenlik Rehberi”.

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 7 / 24 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-05 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

2.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri

Eğer klinisyen menenjit veya invaziv pnömokokkal hastalıktan Ģüpheleniyorsa kültür için örnekleri laboratuvara göndermeden önce, laboratuvarın gerekli hazırlığı yapabilmesi için laboratuvar ile iletiĢim kurmalı, haber vermelidir.

Örneklerin kabul edilmesinden sonucun raporlanmasına kadarki adımlarda görev alan tüm personel; (i) tekniklerin uygulanmasından önce amaçlanan bütün kullanımlar ile ilgili tam bir eğitim almıĢ olmalı; (ii) kullanılan tekniklere tüm

yönleriyle aĢina olmalı; (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.

Güvenlik önlemlerine uyumun sağlanmasından, tekniklerin standart prosedürlere uygun gerçekleĢtirilmesinden ve tanının doğruluğu ve güvenilirliğinden

Mikrobiyoloji Uzmanı sorumludur.

2.3. Örnek, Reaktif, Kit, Donanım

İnceleme örnekleri

Bakteriyel menenjitlerde veya majör bakteriyel menenjit patojenlerinin (meningokok, pnömokok ve H. influenzae) neden olduğu invaziv hastalık tanısında hemen hemen aynı örneklerden belli bir akıĢ Ģeması izlenerek tanıya gidildiği hatırlanmalıdır (12).

İnvaziv pnömokok hastalığı veya menenjiti tanısında örneklerin alınması ve gönderilmesine iliĢkin detaylı bilgi “BulaĢıcı Hastalıkların Laboratuvar Tanısı için Saha Rehberi”nden ve “Klinik Örnekten Sonuç Raporuna Uygulama Rehberleri”nden edinilebilir (13). AĢağıda bazı önemli noktalara tekrar dikkat çekilmektedir:

 BOS ve kan örnekleri tanıda ilk seçenektir. Plevra, perikard, peteĢiyal aspirat ve eklem sıvısı incelenebilecek diğer örneklerdir.

ÖNEMLĠ NOT: Bakteriyel menenjit veya invaziv enfeksiyon tanısı için alınan BOS, kan veya diğer klinik örnekler laboratuvarda iĢleme alınıncaya kadar geçen süre boyunca oda sıcaklığında veya 35°C‟de taĢınmalı ve saklanmalıdır; kesinlikle buzdolabına konmamalıdır (1,12,). Ancak, pnömokokların otolizin üretimi nedeniyle örneklerin oda ısında da uzun süre beklemesi sakıncalıdır!

 Kan - Kültür için aseptik koĢullarda alınır; kan kültürü ĢiĢesine aktarılır ve yumuĢakça çevrilerek karıĢması sağlanır. Kan kültürü örnek

yönetimi için bkz. Kaynak 14.

 BOS - Alınabilen örnek miktarı sonraki iĢlemleri belirler. Laboratuvara hemen ulaĢamayacaksa tüplerden birindeki BOS örneği (~1 ml) tercihen bifazik T-I besiyeri içeren ĢiĢeye; yoksa bir pediatrik kan kültür ĢiĢesine inoküle edilip gönderilmelidir.

 Steril vücut sıvısı örnekleri de BOS gibi iĢlem görmeli, örnek steril bir tüpe aktarılarak hemen laboratuvara gönderilmelidir. Bu mümkün değilse bifazik T-I besiyerine; T-I besiyeri yoksa bir pediatrik kan kültürü ĢiĢesine asepsiye dikkat edilerek inoküle edilir (13).

NOT: T-I, yatık agar ve sıvı olmak üzere iki fazlı bir besiyeridir (15).

Hib Ģüphesi varsa örnek (BOS, kan, steril vücut sıvısı) Isovitalex veya Vitox eklenmiĢ ĢiĢelere (T-I, kan kültürü) aktarılmalıdır.

Sayfa 8 / 24 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-05 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

 Plevral sıvı ÇA veya ve triptikaz soya bazlı KKA‟ya doğrudan ekilmelidir.

Kan kültürü ĢiĢesine alınması önerilmez.

 Örnekler mümkünse antibiyotik tedavisi baĢlanmadan önce alınmalıdır.

 T-I veya kan kültürü ĢiĢelerine konan örnekler (pediatrik olanlar dâhil) bir gece 35°C‟de inkübe edildikten sonra ve/veya 24 saat içinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaĢtırılabilir. TaĢıma esnasında örneklerin aĢırı sıcaklık değerlerine (<18°C veya >37°C) maruz kalmasına kesinlikle izin verilmemelidir.

 Pnömokoklar rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında tanısı mümkün olan mikroorganizmalardır. Klinik örnekten bakterinin izolasyonu klinik mikrobiyoloji uzmanı olan tüm laboratuvarlarda yapılabilir. Ancak serotipleme veya moleküler testler için referans laboratuvarlara örnek göndermek gerekebilir. Örnekler referans laboratuvara gönderilecekse, uygun paketleme sağlanmalı ve yasal düzenlemelere uyulmalıdır (16).

Besiyeri / Reaktif

 KKA – Triptik soya agar baz ile hazırlanmıĢ %5 koyun veya at kanlı agar idealdir. Piyasadan hazır temin edilebilir; laboratuvarda da

hazırlanabilir. N. meningitidis ve S.pneumoniae KKA‟da ürerler. KKA‟da Hib üremesi için ise satellit fenomeninden (ekim bölgesini çaprazlayan Staphylococcus aureus inokülasyonu) yararlanılabilir ya da X ve V faktör diskleri kullanılır.

NOT: KKA yerine insan kanlı agar kullanımı kesinlikle önerilmez!

 Çikolata agar - Piyasadan hazır temin edilebileceği gibi laboratuvarda da hazırlanabilir. Her üç meningeal patojen de bu besiyerinde ürer. X/V faktör (Isovitalex vb) içeren ticari besiyerleri de kullanılabilir.

 Haemophilus test medium (HTM) – antibiyotik duyarlılık testi için

 Triptik soya buyyon (TSB) veya beyin-kalp infüzyon buyyonu (BHI) – ticari kan kültürü ĢiĢesi mevcut değilse bu sıvı besiyerleri kullanılabilir.

 Biyotiplendirme için – katalaz reaktifi, Gram boya ve Loeffler‟in metilen mavisi reaktifleri, optokin diski, safrada erime deneyi reaktifleri, X, V ve XV diskleri veya S. aureus suĢu (bkz. “Ġlgili Diğer UMS Belgeleri”)

 Serotiplendirme için pnömokok antiserumları

 Antimikrobiyal duyarlılık diskleri/stripleri Diğer gereç, donanım

Besiyeri hazırlamak için

 Erlen (10 mL, 25 mL, 500 mL, 2 L)

 Manyetik karıĢtırıcı/ısıtıcı ve manyetik balıklar

 pH metre

 Petri kabı, steril, tek kullanımlık

 Pastör pipeti, steril pipetler; pipetleme ekipmanı

 Su banyosu (55°C„ye ayarlı)

 Tüpler steril, vida kapaklı

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 9 / 24 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-05 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

Kültür, mikroskopi ve diğer testler için

 Biyogüvenlik kabini, sınıf-IIA

 Koloni mikroskobu (stereomikroskop) – kültür plaklarını okumak için (opsiyonel)

 IĢık mikroskobu - 10 (düĢük), 40 (yüksek kuru), 100 (immersiyon) objektifleri ve 10 oküleri olan tercih edilir.

NOT: 5 oküler önerilmez! Daha az büyütme sağladığı için inceleme duyarlılığı düĢüktür. 10 oküler kullanılmalıdır (17).

 Ġnkübatör, 36°C, CO2‟li inkübatör veya mumlu jar

 Öze, steril, tek kullanımlık

 Rotator (opsiyonel)

 Santrifüj – 50 ml tüp santrifüjüne uygun

 Vorteks (tüp ataçmanlı)

 Zaman alarmı (timer)

2.4. Kalite kontrol

 Kullanmadan önce besiyerlerinin son kullanma tarihi içinde olduğundan emin olunmalıdır. Son kullanma tarihi dolmamıĢ olsa da eğer besiyeri plaklarında kuruma, çatlak vb. gözlenirse, kullanılmamalıdır.

 Uzun süre depolanan besiyerlerinde nem kaybı sonucu içeriğindeki maddelerin yoğunluğu artabilir ve besiyeri üremeyi baskılayıcı özellik kazanabilir.

 Besiyerlerinin kalite kontrolü için laboratuvarda standart suĢlar

bulunmalıdır ya da elde edilen bir izolat henüz pasajlanmamıĢ veya çok az pasajlanmıĢ iken kalite kontrol için saklamaya alınabilir.

 Besiyerlerinin kalite kontrolü baĢlıca sterilite ve üreme (ve besiyeri seçici ise seçici özellik) kontrolünü kapsar.

(a) Sterilite kontrolü için; yeni hazırlanmıĢ her besiyeri lotundan 1 litre besiyeri baĢına 2-3 plak seçilir; 35°C‟de 3 gün inkübe edilir.

(b) Üremenin kontrol edilmesinde S. pneumoniae ATCC 49619 kullanılır.

 Antimikrobiyal duyarlılık ve tanımlama testlerinde kalite kontrol izolatı olarak da S. pneumoniae ATCC 49619 kullanılır.

 Kitler kullanılırken kontrol örnekleri de kitte verilen prosedüre göre teste dâhil edilmelidir.

 Mikroskop ve diğer bütün ekipman kalibrasyonları düzenli aralıklarla yapılıyor olmalıdır.

 Bütün kalite kontrol sonuçları, kullanılan kitin/besiyerinin lot numarası, tarih ve diğer bilgilerle birlikte kalite kontrol kayıt defterine veya

kartlarına kaydedilmelidir.

Sayfa 10 / 24 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-05 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

3 Ġnvaziv pnömokokkal hastalık tanısı için genel yaklaĢım

 Ġnvaziv pnömokok enfeksiyonlarının tanısında baĢlıca kan ve BOS örnekleri kullanılır (18).

 Kan, BOS ve diğer klinik örneklerinin incelemeye alınmasında belli baĢlı adımlara iliĢkin akıĢ Ģeması ġekil 1‟de verilmektedir.

 BOS örnekleri için ön iĢlem gerekirken kan kültürleri için ön iĢleme gerek yoktur (bkz. ġekil 1).

 BOS örneklerinin iĢlenmesi örnek miktarına göre değiĢiklik gösterir.

BOS örneğinin iĢlenmesine iliĢkin akıĢ çizelgesi de ġekil 2‟de verilmiĢtir.

3.1. ĠPH Ģüphesinde laboratuvar iĢ akıĢ Ģeması

Şekil 1. S.pneumoniae invaziv enfeksiyonu olasılığında klinik örneklerden mikrobiyoloijk tanı için laboratuvarın genel iĢ akıĢı Ģeması

 Tanımlama testleri için saf kültürden çalıĢılması önemlidir. KKA‟daki pnömokok Ģüpheli kolonilere ġekil 3‟de özetlenen testler uygulanır.

 S. pneumoniae Ģüpheli kolonilerin tanımlanmasında Gram boyama,

Belgede Ulusal Mikrobiyoloji Standartları (sayfa 149-154)