Hedef mikroorganizma

Neisseria meningitidis

2 Tanı için asgari laboratuvar koĢulları

2.1. Laboratuvar güvenliği

Neisseria meningitidis türü bakteriler Risk Grubu 2 organizmalardır ve çalıĢmalar, asgari BGD2 laboratuvar Ģartlarında gerçekleĢtirilmelidir. Bütün kültürler ve klinik örnekler enfeksiyöz kabul edilmeli ve daima standart önlemler uygulanmalıdır.

Epidemik menenjit veya invaziv N.meningitidis enfeksiyonu Ģüpheli örneklerin kültürden izolasyonu ve tanımlanması ile ilgili tüm laboratuvar çalıĢmaları sertifikalı bir sınıf-IIA BGK içinde yapılmalıdır. Önlemler risk değerlendirmesi ile desteklenmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi”).

N.meningitidis primer olarak solunum yolu (aerosol kaynağı olan iĢlemler) ile bulaĢır. Fatal seyirli laboratuvar kaynaklı enfeksiyonları rapor edilmiĢtir (20). Bu nedenle N. meningitidis kültürleri ile uğraĢan laboratuvar personeline dörtlü meningokok aĢısı (serogrup A,C,Y,W135 içeren) uygulanması tavsiye edilir.

2.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri

Eğer klinisyen epidemik menenjitten veya invaziv meningkokkal hastalıktan Ģüpheleniyorsa kültür için örnekleri laboratuvara göndermeden önce,

laboratuvarın gerekli hazırlığı yapabilmesi için laboratuvar ile iletiĢim kurmalı, haber vermelidir.

Örneklerin kabul edilmesinden sonucun raporlanmasına kadarki adımlarda görev alan tüm personel; (i) tekniklerin uygulanmasından önce amaçlanan bütün kullanımlar ile ilgili tam bir eğitim almıĢ olmalı; (ii) kullanılan tekniklere tüm

yönleriyle aĢina olmalı; (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.

Güvenlik önlemlerine uyumun sağlanmasından, tekniklerin standart prosedürlere uygun gerçekleĢtirilmesinden ve tanının doğruluğu ve güvenilirliğinden

Mikrobiyoloji Uzmanı sorumludur.

Sayfa 10 / 30 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 /Sürüm: 1.1 / B-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

2.3. Örnek, Reajen, Kit, Donanım

İnceleme örnekleri

Epidemik menenjit veya meningokoksik invaziv hastalık tanısında örneklerin alınması ve gönderilmesine iliĢkin detaylı bilgi “BulaĢıcı Hastalıkların Laboratuvar Tanısı için Saha Rehberi”nden edinilebilir.

Bakteriyel menenjitlerde veya majör bakteriyel menenjit patojenlerinin (meningokok, pnömokok ve H.influenzae) neden olduğu invaziv hastalık tanısında hemen hemen aynı örneklerden belli bir akıĢ Ģeması izlenerek tanıya gidildiği hatırlanmalıdır (27).

AĢağıda bazı önemli noktalara tekrar dikkat çekilmektedir:

 Örnekler mümkünse antibiyotik tedavisi baĢlanmadan önce alınmalıdır.

 BOS ve kan örnekleri tanıda ilk seçenektir. PeteĢiyal aspirat, biyopsi örneği, eklem sıvısı incelenebilecek diğer örneklerdir.

ÖNEMLĠ NOT: Bakteriyel menenjit veya invaziv enfeksiyon tanısı için alınan BOS ve kan örnekleri laboratuvarda iĢleme alınıncaya kadar geçen süre boyunca oda sıcaklığında taĢınmalı ve saklanmalıdır;

kesinlikle buzdolabına konmamalıdır (20,27).

 BOS‟da alınabilen örnek miktarı sonraki iĢlemleri belirler. Laboratuvara hemen ulaĢamayacaksa tüplerden birindeki BOS örneği (~1 ml)

tercihen bifazik T-I besiyeri içeren ĢiĢeye; yoksa bir pediyatrik kan kültür ĢiĢesine inoküle edilip gönderilmelidir. Hib Ģüphesi varsa ĢiĢelere (T-I, kan kültürü) Isovitalex veya Vitox eklenmelidir.

NOT: T-I, yatık agar ve sıvı olmak üzere iki fazlı bir besiyeridir (28).

 Kan kültürü besiyerlerinde bulunan antikoagülan SPS meningokokların besiyerinde üretilmesini etkileyebilir. Besiyerine steril jelatin (son konsantrasyonda %1 olacak Ģekilde) eklenerek ya da kan örneğinin lizis-santrifügasyonu ile bu etki önlenebilir.

 T-I veya kan kültürü ĢiĢelerine konan örnekler (pediyatrik olanlar dahil) bir gece 35°C‟de inkübe edildikten sonra ve/veya 24 saat içinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaĢtırılabilir. TaĢıma esnasında örneklerin aĢırı sıcaklık değerlerine (<18°C veya >37°C) maruz kalmasına kesinlikle izin verilmemelidir.

Besiyeri / Reaktif

 KKA – Triptik soya agar baz ile hazırlanmıĢ %5 koyun veya at kanlı agar idealdir. Piyasadan hazır temin edilebilir; laboratuvarda da

hazırlanabilir. N. meningitidis ve S.pneumoniae KKA‟da ürerler. KKA‟da H. influenzae üremesi için ise satellit fenomeninden (ekim bölgesini çaprazlayan Staphylococcus aureus inokülasyonu) yararlanılabilir ya da X ve V faktör diskleri kullanılır.

NOT: KKA yerine insan kanlı agar kullanımı kesinlikle önerilmez!

 Çikolata agar - Piyasadan hazır temin edilebileceği gibi laboratuvarda da hazırlanabilir. Her üç meningeal patojen de bu besiyerinde ürer.

 Triptik soya buyyon (TSB) veya beyin-kalp infüzyon buyyonu (BHI) – ticari kan kültürü ĢiĢesi mevcut değilse bu sıvı besiyerleri kullanılabilir.

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 11 / 30 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-03 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

NOT: Modifiye Thayer-Martin, New York City agar, Martin Lewis agar gibi özgül Neisseria besiyerleri baĢlıca flora içeren bölgelerden

izolasyonda tercih edilen besiyerleridir. Üretrit, proktit, orofarenjit gibi gonokokkal ve meningokokkal lokal enfeksiyonlardan Ģüpheleniliyorsa bu besiyerlerinden yararlanılabilir. Menenjit tanısında kullanılmaları önerilmez. Ticari olarak piyasadan temin edilerek kullanılabilir.

 Biyotiplendirme için reaktifler – oksidaz reaktifi, katalaz reaktifi (%3‟lük ve %30‟luk H₂O₂), Gram boya ve Loeffler‟in metilen mavisi reaktifleri, X, V ve XV diskleri veya Staphylococcus aureus suĢu (bkz.

“Ġlgili Diğer UMS Belgeleri”)

 CTA (Sistin triptikaz agar; %1 Ģeker içeren) – Ģeker kullanım (karbonhidrat utilizasyon) testi besiyeri

 Lam aglütinasyon testi – izole edilen N. meningitidis suĢunun serogruplandırılması için. Piyasada değiĢik ticari kitler mevcuttur.

 Direkt antijen arama testleri - BOS‟tan (veya diğer vücut sıvılarından) antijen aranmasında kullanılan testlerdir. Piyasada her üç meningeal patojen için değiĢik ticari kitler mevcuttur (opsiyonel).

Diğer gereç, donanım Besiyeri hazırlamak için

 Erlen (10 mL, 25 mL, 500 mL, 2 L)

 Manyetik karıĢtırıcı/ısıtıcı ve manyetik balıklar

 pH metre

 Petri kabı, steril, tek kullanımlık

 Pastör pipeti, steril pipetler; pipetleme ekipmanı

 Su banyosu (55°C„ye ayarlı)

 Tüpler steril, vida kapaklı

Kültür, mikroskopi ve diğer testler için

 Biyogüvenlik kabini, sınıf-IIA

 Koloni mikroskobu (stereomikroskop) – kültür plaklarını okumak için (opsiyonel)

 IĢık mikroskobu - 10 (düĢük), 40 (yüksek kuru), 100 (immersiyon) objektifleri ve 10 oküleri olan tercih edilir.

NOT: 5 oküler önerilmez! Daha az büyütme sağladığı için inceleme duyarlılığı düĢüktür. 10 oküler kullanılmalıdır (29).

 Ġnkübatör, 36°C, CO2‟li inkübatör veya mumlu jar

 Öze, steril, tek kullanımlık

 Rotator (opsiyonel)

 Santrifüj – 50 ml tüp santrifüjüne uygun

 Vorteks (tüp ataçmanlı)

 Zaman alarmı (timer)

Sayfa 12 / 30 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 /Sürüm: 1.1 / B-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

2.4. Kalite kontrol

 Kullanmadan önce besiyerlerinin son kullanma tarihi içinde olduğundan emin olunmalıdır. Son kullanma tarihi dolmamıĢ olsa da eğer

besiyerinde kuruma, çatlak v.b. gözlenirse, kullanılmamalıdır. Uzun süre depolanan besiyerlerinde nem kaybı sonucu içeriğindeki

maddelerin yoğunluğu artabilir ve besiyeri üremeyi baskılayıcı özellik kazanabilir.

 Besiyerlerinin kalite kontrolü için laboratuvarda standart suĢlar

bulunmalıdır ya da elde edilen bir izolat henüz pasajlanmamıĢ veya çok az pasajlanmıĢ iken kalite kontrol için saklamaya alınabilir.

 Kitler kullanılırken kontrol örnekleri de kitte verilen prosedüre göre teste dahil edilmelidir.

 Mikroskop ve diğer bütün donanımın kalibrasyonları düzenli aralıklarla yapılıyor olmalıdır.

 Bütün kalite kontrol sonuçları kaydedilmelidir.

3 Bakteriyel menenjitlerde tanı için genel akıĢ