H.influenza’nın kültürlerden izolasyonu

Besiyerlerine ekimler

 BOS ve steril vücut bölgesi örnekleri ÇA ve KKA‟ya inoküle edilir (bkz.

ġekil 3). Örnek <1 mL ise doğrudan; ≥1 mL ise santrifüj edildikten sonra çökeltiden KKA ve ÇA‟ya ekim yapılmalıdır (bkz. “3.3 Örneklerin incelemeye hazırlanması”).

 Ekim plakları 35°C‟da, %5-10 CO₂‟li ve yüksek nem oranına sahip atmosferde 48 saate kadar inkübe edilmelidir.

NOT: Yüksek nem oranı inkübatörün tabanına geniĢ bir cam tepsi ile distile su konarak elde edilir. Tepsinin kuru kalmasına izin verilmemeli, düzenli aralarla kontrol edilerek su eklenmelidir.

 18 saatten itibaren plaklar üreme varlığı açısından kontrol edilir.

Bakteriyel menenjit Ģüpheli örneklerin KKA ve ÇA‟daki ilk üremelerinin değerlendirilmesinde ön tanımlama için Tablo 1‟den yararlanılabilir.

 ÇA‟da konveks, düzgün yüzeyli, büyük, renksiz veya grimsi opak koloniler (ġekil 5) H.influenzae yönünden ileri incelemeye alınır.

NOT: KKA‟da üreme yoktur. Ancak her ihtimale karĢın eğer ilk ekim plaklarına satellit fenomeni için S.aureus inoküle edildiyse veya XV faktör dikleri konduysa S.aureus ekim çizgisi veya XV dikleri etrafında çok yüksek olasılıkla üreme gözlenmelidir (bkz. ġekil 6).

 Tanımlama için kolonilerden Gram boyanır ve ġekil 3‟de verilen adımlar takip edilir.

Kan kültürleri veya diğer bifazik besiyerlerine ekimler

 BOS (ya da steril vücut sıvıları) Ģehirlerarası mesafeden geliyorsa T-I besiyeri içine alınmıĢ ve taĢınmıĢ olması gerekir (ideal olarak oda sıcaklığında veya 35°C taĢınabilir inkübatörde; %5-10 CO₂‟li ortamda)

 Kan örnekleri ise H.influenzae Ģüphesinde;

(a) Ticari kan kültürü ĢiĢelerine veya TSB veya BHI kullanılarak hazırlanmıĢ geleneksel bifazik –ve IsoVitaleX veya Vitox ile desteklenmiĢ- kan kültürü ĢiĢesine; veya

(b) IsoVitaleX ya da Vitox ile desteklenmiĢ bifazik T-I besiyerine alınmıĢ ve gönderilmiĢ olabilir. Kan kültürü örnekleri eğer Ģehirlerarası mesafeden gönderiliyorlarsa ideal olarak oda sıcaklığında veya 35°C taĢınabilir inkübatörde, %5-10 CO2‟li ortamda taĢınmıĢ olmalıdırlar.

 Ticari kan kültürü ĢiĢeleri kendi inkübatöründe, 35°C‟da, %5-10 CO2‟li ve yüksek nem oranına sahip atmosferde inkübe edilirler.

 Bifazik geleneksel ĢiĢeler veya T-I ĢiĢeleri de 35°C‟da, %5-10 CO2‟li ve yüksek nem oranına sahip atmosferde inkübe edilirler.

 Üreme bulgusu ticari otomatik kan kültürü sistemlerinde üreme sinyali ile, diğerlerinde bulanıklık ile değerlendirilir.

 Üreme gözlenen ĢiĢelerden hemen KKA ve ÇA pasajları yapılmalıdır. Bu pasajlardaki üremeler yukarıda tarif edildiği gibi ve ġekil 3‟deki adımlar takip edilerek tanımlanırlar.

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 15 / 26 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

Şekil 4. BOS örneğinden direkt antijen saptama testi. Solda negatif, sağda ise pozitif reaksiyon izlenmektedir (3).

Tablo 1. Primer kültürlerden N. meningitidis, S. pneumoniae ve H. influenzae için ön tanımlama kriterleri (20 no.lu kaynaktan uyarlanmıĢtır.)

Üreme

Gram boyama Ön tanımlama

ÇA’da KKA’da

+ + Gram-negatif diplokoklar N. meningitidis

+ + Gram-positif diplokoklar S. pneumoniae

+ − Gram-negatif pleomorfik kokobasiller H. influenzae

Şekil 5. H.influenzae’nın çikolata agardaki kolonileri.

http://panji1102.blogspot.com/2009_11_30 _archive.html

Şekil 6. H.influenzae’nın stafilokok çizgi ekiminde satellit/uydu koloni Ģeklinde üremesi.

http://www.studyblue.com/notes/note/n/tes ts/deck/2488362

Sayfa 16 / 26 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

5.4. Tanımlama testleri

Gram boyama

 Üreme olan plaklardan yapılan Gram boyamada (UMS-B-TP-03) küçük, düzensiz yerleĢimli, gram negatif basil ve kokobasiller görülür (ġekil 7).

Oksidaz testi

 H.influenzae tanısında Kovaks oksidaz testi UMS-B-TP-16 belgesinde tanımlandığı gibi yapılır. Oksidaz testinin negatif olması H.influenzae’yı dıĢlar. H. influenzae ile birlikte diğer Haemophilus türleri de pozitif reaksiyon verebilir (ġekil 8).

 Testin kalite kontrolü mutlaka yapılmalıdır.

X ve V faktör gereksinimlerine göre tanımlama

 X faktör ve V faktör gereksinimlerinin değerlendirilmesi çalıĢması UMS-B-TP-23 belgesinde tanımlandığı gibi yapılır.

 H. influenzae diğer birçok Haemophilus türlerinden farklı olarak X ve V faktörlerinin ikisine birden gereksinim duyar (ġekil 8).

 Haemophilus türlerinin kanlı agardaki beta hemoliz özellikleri ile X faktör ve V faktör gereksinimlerine göre tanımlanması Tablo 2‟de özetlenmektedir.

Bulguların değerlendirilmesi, yorumlanması

 Buraya kadarki adımlarda Ģüpheli kolonilerin incelenmesi sonucunda oksidaz pozitif ve üremek için hem X faktöre hem de V faktöre gereksini olan gram negatif basil/kokobasil görünümünde izolatlar H.influenzae olarak tanımlanırlar. Ġnvaziv enfeksiyonlu vakalar için bu aĢamada bulgular “ön rapor” olarak hekime bildirilir.

 Ancak kesin tanı için mutlaka serotiplendirme yapılmalı ve “kesin rapor” ondan sonra verilmelidir!

ÖNEMLĠ: Bu nedenle serotiplendirme yapamayan klinik laboratuvarlar mutlaka izolatlarını Referans laboratuvara göndermelidirler!

Şekil 7.

H.influenzae‟nin Gram boyalı preparatta görünümü (23).

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 17 / 26 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

Şekil 8. Süzgeç kağıdında oksidaz pozitif ve negatif sonuçların görünümü (3,4).

Şekil 9. Üreme faktörleri gereksinimi: agar plakta bakteri ekim alanlarının üzerine yerleĢtirilmiĢ X, V ve XV faktör diskleri.

Üstteki izolat sadece XV diskinin etrafında üremiĢ olup H. influenzae ön tanısı konabilir (3,4).

Tablo 2. Üreme gereksinimlerine göre Haemophilus türlerinin tanımlanması (4).

Tür X ve V Faktör gereksinimi At veya tavşan kanlı agarda β-hemoliz

X V

H. influenzae + + -

H. haemolyticus + + +

H. parahaemolyticus - + +

H. aphrophilus + - -

H. parainfluenzae* - + -

H. paraphrophilus* - + -

*H. paraphrophilus ve H. parainfluenzae ornitin testi ile ayrılır; ilki negatif iken ikincisi pozitiftir.

Şekil 10. Lam aglütinasyon testinin değerlendirilmesi (23)

Sayfa 18 / 26 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

Serogruplandırma için lam aglütinayon testi

 Ġzolatlardan ayrıca serotiplendirme yapılması gereklidir.

 H.influenzae kapsüler polisakkarid antijenlerine göre serogruplara ayrılır (testin yapılıĢı için bkz. Ek-1). Testler üretici firmanın önerileri doğrultusunda uygulanır ve değerlendirilir. Ürüne göre uygulamanın değiĢebileceği göz önünde bulundurulmalıdır.

 Test edilen izolatlar 2 dakika içerisinde 3+ veya daha büyük aglütinasyon reaksiyonu verirler (ġekil 10).

 Eğer klinik laboratuvar serotiplendirme yapamıyorsa izolat Referans laboratuvara gönderilmelidir.

 Serotiplendirme yapılırken tüm serotiplere ait antiserumların

kullanılması gerekmeyebilir. Serotiplendirme akıĢ diyagramına ülkede H.influenzae tip b aĢılamasının yapılıp yapılmadığına göre karar

verilmelidir. Hib aĢılaması rutin uygulanıyora tüm serotipler için

spesifik antiserumların test edilsi önerilir. Hib aĢılaması uygulanmayan popülasyonlarda H.influenzae invaziv enfeksiyonu Ģüphesinde

aglütinasyona tip b antiserumu ile baĢlanır, negatif bulunması durumunda diğer antiserumlarla serotiplendirmeye devam edilir.

 Elde edilen izolat hiçbir antiserumla aglütinasyon vermiyorsa

“tiplendirilemeyen” H.influenzae olabilir ya da H.influenzae

tanımlaması yanlıĢtır. Tanımlama basamakları tekar gözden geçirilir.

5.5. Antimikrobiyal duyarlılık

 Çoğunlukla H.influenzae için antimikrobiyal duyarlılık testi olarak beta-laktamaz testinin yapılması yeterlidir.

 β-laktamaz pozitif kökenler ampisilin ve amoksasiline dirençli kabul edilir, bu kökenlerin 128 mg/mL MIC değerleri olduğu kabul edilir.

BaĢka bir ifade ile β-laktamaz testinin negatif bulunması suĢun ampisiline duyarlı olduğu anlamına gelir. β-laktamazı negatif olup ampisilin dirençli olan kökenler olmakla beraber bu kökenler ile karĢılaĢılma oranlarının düĢük olması nedeniyle rutin olarak test edilmeleri önerilmemektedir. Eğer yapılacaksa ampisilin disk difüzyon testi veya MIK testi yapılabilir (13).

β-laktamaz testi

 β-laktamaz testi hızlı sonuç verdiğinden H. influenzae tanımlanır tanımlanmaz hemen çalıĢılmalıdır. Nitrosefin temelli β-laktamaz testi tercih edilmelidir. Testin kalite kontrolünde pozitif kontrol olarak Staphylococcus aureus ATCC 29213 ve negatif kontrol olarak Enterococcus faecalis ATCC 29212 kullanılır (8).

 Testin yapılıĢı için bkz. Ek-2.

Disk difüzyon testi

 Disk difüzyon testi için ideal besiyeri HTM besiyeridir. Plaklar 16-18 saat süreyle 35°C de %5-7 CO₂‟li ortamda inkübe edilir.

 MIK değerleri için yine “HTM buyyon” kullanılır.

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 19 / 26 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

 HTM‟nin kullanılamaması durumunda %3-5 oranında steril lize at kanı ve 10 mg/mL NAD eklenmiĢ Mueller-Hinton buyyon kullanılabilir (13).

 H.influenzae‟nın antimikrobiyal duyarlılığının araĢtırılmasında kullanılan diskler, disk içerikleri ve sonuçların yorumlanmasına yönelik CLSI kriterleri Tablo 3‟de, EUCAST kriterleri ise Tablo 4‟de özetlenmektedir.

Difüzyon gradient test

 Difüzyon gradient testler (ör., E-test) ile MIK değerlerinin saptanmasına iliĢkin veri oldukça kısıtlıdır.

Tablo 3. H. influenzae için CLSI tarafından önerilen disk difüzyon zon çapları ile MIC değerlendirme standartları (24)

Antimikrobiyal Etken/Sınıf

Disk içeriği

Zon çapı (mm) MIK değerlendirme standardı (µg/mL)

S I R S I R

PENĠSĠLĠNLER

Ampisilin¹ 10 µg ≥ 22 19-21 ≤ 18 ≤ 1 2 ≥ 4

SEFEMLER

Sefotaksim² 30 µg ≥ 26 - - ≤ 2 - -

Seftriakson² 30 µg ≥ 26 - - ≤ 2 - -

FENĠKOLLER

Kloramfenikol 30 µg ≥ 29 26-28 ≤ 25 ≤ 2 4 ≥ 8

1 Çoğu vakada, ampisilin ve amoksisilin direnci direk beta laktamaz testi ile hızlı bir Ģekilde saptanabilir.

Ampisilin ve amoksisiline dirençli H.influenzae izolatlarının çoğunluğu TEM tipi beta laktamaz üretir.

2 Bazı antimikrobiyallere dirençli suĢların olmayıĢı veya direncin seyrek gözlenmesi nedeniyle “duyarlı” dıĢındaki kategorilerin tanımlanması güçleĢir.

Tablo 4. H. influenzae için EUCAST tarafından önerilen disk difüzyon zon çapları ile MIC değerlendirme standartları (25)

Antimikrobiyal

Etken/Sınıf Disk

içeriği Zon çapı (mm) MIK değerlendirme

standardı (µg/mL)

S R S R

PENĠSĠLĠNLER

Ampisilin^1,2 2 µg ≥16 ≤16 ≤1 >1

SEFEMLER

Sefotaksim³ 5 µg ≥22 <22 ≤0.125 -

Seftriakson³ 30 µg ≥27 <27 ≤0.125 -

FENĠKOLLER

Kloramfenikol 30 µg ≥30 ≤26 ≤1 >2

1 Beta laktamaz pozitif izolatlar, beta laktamaz inhibitörsüz penisilinlere karĢı dirençli rapor edilir.

2 Breakpoint‟ler yalnızca beta laktamaz negatif kökenlerle iliĢkilidir. SuĢlar, penisilin bağlayan proteinlerdeki değiĢiklikler nedeniyle penisilinlere, aminopenisilinlere, sefolosporinlere ve/veya karbepenemlere dirençli olabilirler.

3 Bu antimikrobiyaller için klinik baĢarısızlık veya direnç rapor edilmemiĢtir.

Sayfa 20 / 26 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

5.6. Saklama, Referans merkeze gönderme

 Menenjit veya invaziv enfeksiyon vakalarından izole edilen suĢlar; ileri tanımlama, moleküler epidemiyolojik analiz ve antimikrobiyal duyarlılık çalıĢmaları için Ulusal Referans Laboratuvara gönderilir (26).

 Örneklerin veya izolatların gönderilmesinde paketleme ve taşıma biyolojik materyal taĢıma kurallarına uygun olmalıdır (27) (ayrıca bkz.

UMS GEN-OY-01 Enfeksiyöz Maddelerin TaĢınması Rehberi).

 Laboratuvarlar kendi araĢtırma, eğitim ve kalite kontrol amaçları için de izolatlarını saklayabilmelidirler. Dolayısı ile kısa ve uzun dönem saklama yöntemlerine ihtiyaç duyulur.

Kısa süreli saklama

 H. influenzae izolatlarının bir haftadan kısa süre ile korunması için vida kapaklı tüpte yatık ÇA‟nın yatık kısmına ekim yapılır, %5 CO2‟li

ortamda, 35°C'de bir gece inkübe edilir. Bu tüp 1 haftaya kadar, kapağı sıkıca kapalı halde (nem kaybı önlenerek) +4°C‟de tutulabilir.

 Ġzolatlar, silika jel içeren paket veya tüp içinde +4°C‟de 2 hafta, oda sıcaklığında daha kısa süre saklanabilirler.

 Dorset yatık taĢıma besiyerinde ise; yatık kısma ekim yapılıp, bir gece 35°C'de, %5CO₂‟li ortamda inkübe edilir; oda sıcaklığında 3 hafta süre ile canlılıklarını korurlar.

 Bu ortamlar bilhassa izolatların Referans laboratuvara gönderilmesi süresince korunması sağlamak bakımından kullanıĢlıdırlar.

Uzun süreli koruma

 Uzun süreli saklama için H. influenzae izolatlarının steril „skim-milk‟ ya da gliserol içeren sıvı besiyeri içinde yoğun süspansiyonu da yapılabilir (yöntem uygulaması için bkz. UMS, B-TP-01).

 Yoğun H. influenzae süspansiyonu -80°C derin dondurucuda veya daha düĢük sıcaklıkta (likit nitrojen tankında, -120°C) yıllarca saklanabilir.

Bir -20°C derin dondurucu da kullanılabilir; ancak canlılık kaybı hızlıdır ve birkaç hafta ya da aylık saklamalar için elveriĢli olabilir (26).

 Bazı laboratuvarlar izolatlarını liyofilize ederek saklayabilmektedirler.

Liyofilizasyon için ise „skim milk‟, serum temelli bir besiyeri veya polivinil-pirolidon kullanılır.

 Pozitif bulunan klinik örnekler de -80°C„de saklanmalıdır (26).

6 Tanıda diğer yöntemler

6.1. Moleküler yöntemler

 Tüm H. influenzae‟larda bulunan ve bakterinin yüzey lipoproteini olan protein D „yi kodlayan hpd geni oldukça korunan bir gen bölgesi olup tanıda birçok moleküler test için hedef bölge olarak kullanılmaktadır.

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 21 / 26 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

 Yakın zamanda geliĢtirilen ve valide edilen HPD gerçek zamanlı PCR testi H.influenzae‟nın 6 serotipi (a-f) ve NTHi türler için yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir (13).

7 Raporlama ve bildirim

 İnvaziv H.influenzae enfeksiyonlarında; BOS, kan veya diğer steril vücut sıvılarının kültüründe etken bakterinin izolasyonu, steril vücut sıvılarında lateks aglütinasyon, immünelektroforez vb yöntemlerden biri ile özgül antijenlerin gösterilmesi, steril vücut sıvılarında nükleik asit saptama teknikleri ile özgül genetik materyalin saptanması “kesin tanı” koydurucudur (6,7).

 Ġnvaziv H. influenzae enfeksiyonlarının bildirimi zorunludur (6,7). Halk Sağlığı Müdürlüğüne bildirim yapılması gerekmektedir. Bildirim

klinisyenin sorumluluğudur. Bununla birlikte (laboratuvardan bildirimi zorunlu olmasa da) pozitif sonuç elde edilir edilmez laboratuvarın ilgili birime haber vermesi (ör., telefon ile) önerilir.

8 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

 H.influnzae, dıĢ ortam koĢullarına oldukça duyarlı bir bakteridir. Bu nedenle BOS örneği alınır alınmaz besiyerlerine ekilmesi gereklidir. Bu mümkün değilse BOS örneğinin mutlaka T-I besiyerine veya pediatrik kan kültür ĢiĢesine alınması gerekir.

 Bakteri, üremek için X ve V faktörlerine gereksinim duyar.

 Bakterinin en kısa sürede tanımlanması ve antibiyotik duyarlılık çalıĢmalarının yapılması gerekir.

9 Referans Laboratuvar

Adres

Türkiye Halk Sağlığı Kurumu,

Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları Daire BaĢkanlığı

Ulusal Solunum Yolu Patojenleri Referans Laboratuvarı

Refik Saydam YerleĢkesi, Sağlık Mahallesi, Adnan Saygun Caddesi, No: 55 06100 – Sıhhiye/ANKARA

www.thsk.gov.tr; e-posta: usyprl@saglik.gov.tr Tel: 0312 565 5508

Görev çerçevesi

Kontrol programı kapsamında klinik örneklerden bakteriyel menenjit etkenlerinin (N.meningitidis, S.pneumoniae ve H.influenzae) tanı,

doğrulama, serotiplendirme ve moleküler epidemiyolojik tiplendirmelerinin yapılması; antibiyotik duyarlılıklarının araĢtırılması; bölgesel laboratuvarlara dıĢ kalite örneklerinin hazırlanması ve uygulanması.

Sayfa 22 / 26 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

Ekler

Belgede Ulusal Mikrobiyoloji Standartları (sayfa 132-140)