Kültür için sınırlılıklar

 Legionellalar rifampine, makrolitlere (azitromisin, eritromisin) ve kinolonlara (ör., levofloksasin) duyarlıdırlar. Tedavi sırasında direnç geliĢimi de bildirilmemiĢtir. Bu nedenle ya da baĢka bir tedavi gerekçesi ile ―en iyi‖ antibiyotiğin seçimi için in-vitro antibiyotik duyarlılık testi yapılmasına gerek yoktur ve yapılmamalıdır (13).

 Legionellalar hücre-içi patojenlerdir ve antibiyotik tedavisinden haftalar sonra bile hücre içinde bulunmaya devam edebilirler. Bu nedenle kültür tedaviye yanıtı izlemek için kullanılmaz. Hastanın klinik yanıtı, tedaviye yanıtın en iyi göstergesi kabul edilir (13).

 Negatif kültürler hastalığı dıĢlamaz. Kültür tanıda en duyarlı araçlardan biri olsa da, duyarlılık; örnek alınmasındaki hatalar, floranın baskılayıcı etkisi, antimikrobiyal tedaviye baĢlanmıĢ olması gibi birçok faktörden etkilenebilir.

 F.tularensis, Bordetella pertussis ve Afipia‘lar BCYE‘de ürerler fakat kanlı agarda üremezler. Bu özellikleri nedeniyle legionellalarla

karıĢabilirlerse de F. tularensis ve B. pertussis hareketsiz olmaları ile ve sonuncusu da koloni görünümü ile ayırt edilebilirler.

 Rutin uygulama için mevcut kitlerin içeriğindeki antiserumlar bazı legionellaları tanımlamak için yeterli olmayabilir. Böyle Ģüpheli izolatlar tanımlanmak üzere Referans merkeze (bkz. Sayfa 22) gönderilmelidir.

5.7. Saklama, Referans merkeze gönderme

 Referans laboratuvar moleküler tiplendirme yöntemleri ile hastadan ve olası kaynaktan elde edilen Legionella izolatlarının epidemiyolojik iliĢkili olup olmadığını analiz edebilir, bir salgınla iliĢkileri olup olmadığını ortaya koyabilir. Bu incelemeler hem halk sağlığı önlemleri için ilgili otoritelere yol gösterici sonuçlar üretir; hem de -özellikle seyahat-ilişkili Lejyoner hastalığı vakalarında gündeme geldiği için önem

kazanmış olan- hukuki durumlarda sorunun çözümüne yönelik bilimsel veri sağlar. Bu nedenlerle mümkün olduğunca izolatlar ileride

epidemiyolojik amaçlarla kullanılabileceği düĢünülerek saklanmalıdır.

 Saklama için Legionella izolatlarının steril ‗skim-milk‘ veya gliserollü

Sayfa 20 / 29 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-06 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

buyyon içinde yoğun süspansiyonu yapılır ve derin dondurucuya kaldırılır (suĢ saklama prosedürü için bkz. UMS-B-TP-01).

 Örneklerin veya izolatların gönderilmesinde paketleme ve taşıma biyolojik materyal taĢıma kurallarına uygun olmalıdır (28) (ayrıca bkz.

UMS GEN-OY-01 Enfeksiyöz Maddelerin TaĢınması Rehberi).

 Pozitif bulunan klinik örnekler de -80°C‘de saklanmalıdır.

6 Tanıda diğer yöntemler

6.1. DFA

 Balgam ve diğer alt solunum yolu örnekleri Legionella bakterisinin bulunup bulunmadığını görmek için DFA ile doğrudan incelenebilir.

 DFA için Legionella türlerine ve serogruplarına karĢı tavĢanlarda elde edilmiĢ ve FITC ile iĢaretlenmiĢ antikorları içeren antiserumlar

(monovalan veya polivalan) kullanılır. Antikorlar örnekteki homolog Legionella türüne bağlandığında onları görünür hale getirir ve floresan mikroskopta UV ıĢık altında izlenirler. DeğiĢik ticari kitler mevcuttur.

Kit, üretici firmanın talimatı doğrultusunda kullanılmalıdır.

 DFA için klinik örnekler ―kültür‖ için örnek hazırlama tekniklerinde tarif edildiği gibi hazırlanabilirler (kitin talimatında aksi belirtilmiyorsa).

 DFA testi yapılırken kontrol lamları kesinlikle örnek lamlarından ayrı kaplarda yıkanmalıdır. Çünkü yıkama esnasında lamlar arasında madde geçiĢi olabilmekte; pozitif kontrol lamından kopan bakteriler örnek lamına yapıĢabildiği için sonuç yanlıĢlıkla pozitif okunabilmektedir.

 DFA hızlı bir yöntemdir; 2-3 saat içinde sonuç alınabilir. Ancak testin duyarlılığı ve özgüllüğü örnekteki Legionella sayısı, inceleyen kiĢinin deneyimi, diğer bakterilerle (Bacteroides fragilis, Pseudomonas sp, Flavobacterium sp, vb.) çapraz reaksiyon verme olasılığı gibi pek çok faktörden etkilendiği için DFA testi pozitif bulunmuĢ olan vaka olası vaka olarak kabul edilmektedir (bkz. Standart Vaka Tanımları Saha Rehberi). Bu durumda kesin tanı için vakanın baĢka bir test ile de incelenmesi gerekir (14).

 DFA kültür izolatlarının teyit edilmesinde kullanılan iyi bir araçtır.

6.2. Seroloji

 Hastanın serum örneğinde antikor aranabilir. Bu amaçla IFA veya ELISA testi yapılabilir ve ticari kitler mevcuttur. Kitler üretici firmanın talimatı doğrultusunda kullanılır.

 IFA referans testtir. Ancak ELISA, otomatize cihazlarla uygulanabilmesi ve objektif değerlendirmeye uygun olması gibi nedenlerle giderek daha fazla laboratuvar tarafından tercih edilmektedir.

 Öte yandan, Lejyoner hastalığı tanısında serolojik incelemenin değeri sınırlıdır. ġüpheli olgularda akut dönemde serolojik inceleme ile elde edilecek sonuçlar tedaviye yön vermeye elveriĢli olmadığı için (çoğu

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 21 / 29 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

olguda antikor yanıtı 3. haftaya kadar, immün-baskılı kiĢilerde ise hemen hiç geliĢmez) bu testlerin rutin kullanımı önerilmez (13,14,29).

 Akut fazda yüksek titre tespit edilse bile, antikorlar belirtisiz bir önceki enfeksiyona bağlı olarak geliĢmiĢ olabileceğinden, tek baĢına tanı koydurucu kabul edilmez.

 Legionella türleri arasında ve diğer bakterilerle ortak antijenik yapılara bağlı çapraz reaksiyonlar olabileceği de hatırlanmalıdır.

 Sadece L. pneumophila SG1 için pnömonili bir olguda (1);

(a) tek serum örneğinde ≥1/256 titre olası tanı, ve

(b) çift serum örneğinde paralel incelemede 4 kat titre artıĢı kesin tanı kriteri kabul edilir.

 Yeterli titre artıĢını görebilmek için 2. serum örneği akut fazdan en az 6 hafta sonra alınmalıdır ki, bu da uygulamada bir diğer sorundur (14).

 L. pneumophila SG1 dıĢındaki serogrup ve türler için elde edilen sonuçların ise baĢka testlerle teyit edilmesi gerekir (1,14,30). Yine de serolojik testler, çift serum örneğinde antikor aramak kaydı ile tanıdan ziyade hastane- veya toplum-kaynaklı salgınların izlenmesinde iyi bir araç olabilir (13).

6.3. Moleküler

 Lejyoner hastalığı tanısında nükleik asit tabanlı testler geliĢtirilme aĢamasındadır. Henüz sorunları tam çözülmemiĢtir; piyasada geçerliliği kabul edilmiĢ (valide) ticari kitleri mevcut değildir (14). Halen dünyada daha çok referans ve araĢtırma laboratuvarları ile sınırlı ve öz-yapım tekniklerle çalıĢılmaktadır.

 Klinik örneklerden L. pneumophila‘nın saptanmasına yönelik baĢarılı PCR uygulamaları rapor edilmiĢtir. Özellikle tekrarlayan testler ile alt solunum yolu örneklerinde PCR‘ın duyarlılığı kültür ile eĢit veya daha yüksek bulunmuĢtur ve hastalığın hızlı tanısına duyulan ihtiyaç nedeniyle umut verici kabul edilmektedir.

 Ancak diğer klinik örneklerde duyarlılık belirgin düĢüktür. Alt solunum yolu örnekleri, serum ve idrar için test duyarlılıkları sırasıyla %80-100,

%30- 50 ve %50-90 olarak, özgüllükleri de >%90 tahmin edilmektedir (13,30).

 Duyarlılık, örneğin alındığı evreden de etkilenmekte; hastalık ilerledikçe duyarlılık belirgin düĢmektedir (Tablo 1). Geleneksel ve gerçek zamanlı PCR tekniklerinin her ikisi de kullanılır. Aynı anda diğer solunum yolu patojenlerini de saptamayı amaçlayan multipleks

teknikler geliĢtirilmiĢ olsa da üstünlüğü tartıĢmalıdır.

 Çoğu laboratuvar hedef olarak L. pneumophila‘ya özgü ‗macrophage infectivity protein‘ (mip) gen bölgesini tercih etmektedir. Legionella cinse özgü olarak da hedef gen bölgesi rRNA olup 16S ya da 23S dizileri kullanılır.

 Mevcut durumda klinik örneklerden PCR ile pozitif sonuç olası tanı kabul edilmektedir. Buna karĢın PCR kültürlerden elde edilmiĢ Ģüpheli izolatların doğrulanmasında iyi bir araçtır.

Sayfa 22 / 29 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-06 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

7 Bildirim

Lejyoner hastalığı bildirimi zorunlu bir hastalıktır! Üriner antijen ya da kültür ile elde edilen pozitif sonuçlar hemen (1,2,3);

 hastane-kaynaklı enfeksiyon olasılığında hem hastanın hekimi hem de enfeksiyon kontrol komitesine bildirilmelidir;

 seyahat-iliĢkili olsun veya olmasın, mevcut bildirim sistemine göre Ġl Halk Sağlığı Müdürlüğüne bildirilmelidir. Bildirim klinisyenin

sorumluluğudur. Bununla birlikte (Lejyoner hastalığının laboratuvardan bildirimi zorunlu olmasa da) pozitif sonuç elde edilir edilmez

laboratuvarın ilgili birimlere haber vermesi (ör., telefon ile) önerilir. Bu rutin yoldan gereken toplam süreyi kısaltacağı ve epidemiyolojik

incelemelerin erken baĢlatılmasını sağlayacağı için idealdir.