Boğmaca bakterisinin kültürden izolasyonu

3.1. Kültürden izolasyon için genel akıĢ Ģeması

Şekil 1. Nazofarinks örneklerinden B. pertussis izolasyonu ve tanımlanması için akıĢ Ģeması

1 Pertussis bakterisinin primer izolasyonu için CSM de kullanılabilir. Bu besiyeri 6 ay kadar uzun bir raf ömrü olması nedeniyle özellikle kaynakları sınırlı laboratuvarlar için idealdir.

2 BGA‟nın majör avantajı hemolitik aktivitenin değerlendirilmesinin yanı sıra Bordetella fazlarının da değerlendirilmesine imkan vermesidir. B.pertussis‟in virülans karakterlerinin ekspresyonu istikrarlı değildir ve bu özellik iyi bilinmektedir. Virülan fenotipler çevresel Ģartlara bağlıdır ve geri dönüĢümlü olarak sıcaklıktan ya da kimyasallardan etkilenirler (fenotipik modülasyon).

− Virülans geninin ekspresyonu – Faz I

− Hemolizinlerin kaybı ile ara fazların meydana geliĢi – Faz II veya III

− Bütün virülans faktörlerinin kaybı – Faz IV ( BGA‟da hemolitik özelliğin kaybı ve koloni özelliklerinin değiĢmesi –parlaklığın kaybı vb.- ile izlenir)

Gram boyama, katalaz, oksidaz testleri

Biyotipleme - MacConkey agarda üreme, nitratı indirgeme, sitrat kullanımı, üreaz aktivitesi, CSM‟de kahverengileĢme

Serotipleme - B.pertussis faz I ve B.parapertussis antiserumları ile aglütinasyon, DFA

Moleküler epidemiyolojik tiplendirme - Referans laboratuvara gönder.

Antibiyotik duyarlılık testi yapılır (Ref lab) ġüpheli kolonilerden

(3 günlük inkübasyon sonrasında β-hemolizli, küçük, kompakt, parlak görünümde koloniler)

BGA‟nın yanı sıra KKA’da üreme

B.parapertussis veya B.bronchiseptica olabilir!

VAR

YOK B.pertussis yönünden değerlendir

İnoküle et (bkz. ġekil 2)

Paralel pasaj (bkz. ġekil 4)

Örnek (nazofaringeal sürüntü veya aspirat)

C-BGA¹

BGA² %5 KKA

37°C‟de 72 saat inkübe et

37°C‟de 24-72 saat inkübe et

Sayfa 12 / 30 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-01 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

3.2. Örneklerin kültür vasatlarına ekilmesi

Hazırlık

 Örnekler geciktirilmeden besiyerlerine ekilmelidir. Bunun için bütün örnekler çalıĢma formuna ve laboratuvar protokol defterine kaydedilir.

 B. pertussis‟in izolasyonu için gerekli asgari besiyerleri; BGA, C-BGA ve %5 koyun kanlı agardır (ġekil 1).

 Uygun sayıda C-BGA plağı buzdolabından çıkarılır. Oda ısısına gelmeleri sağlanır. Plakların üzerinde iĢlem protokol numarası, hasta adı, örnek tipi, ekim tarihi belirtilir.

 Bütün ekimler için tam plak yüzeyi kullanılır.

 Nazofaringeal sürüntü örnekleri - Casamino asit veya kömürlü Amies transport besiyerinde gelen örnek eküvyonu C-BGA plağının üst ¼ yüzeyine inoküle edilir. Ardından plakların geri kalan kısımlarına azaltma yöntemi ile yayılır (bkz. ġekil 2).

 Nazofaringeal aspirat örnekleri - Özel kateterle alınıp casamino asid solüsyonu içinde gelen örnekten steril Pastör pipeti kullanılarak iki damla örnek alınır; L öze ile C-BGA yüzeyine yayılır. Kömürlü Amies transport besiyerinde gelen örnekler nazofaringeal sürüntü örneğinde olduğu gibi inoküle edilir.

 Ġlk ekimler yapıldıktan sonra kalan orijinal örnekler laboratuvar sonucu çıkana kadar (ortalama 7-10 gün), 2-8°C‟de saklanmalıdır.

Şekil 2. Bordetella türlerinin izolasyonu için klinik örneklerin plaklara ekimi (20).

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 13 / 30 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

3.3. Kültür plaklarının inkübasyonu

 Ekim yapılmıĢ plaklar, 36°C‟de, nemli ortamda, aerob koĢullarda 72 saat inkübe edilir. Bazı durumlarda 7-10. güne kadar plakların takip edilmesi gerekebilir.

NOT: Uygun nem oranı etüv tabanına geniĢ bir cam tepsi ile distile su konarak elde edilir. Tepsinin kuru kalmasına izin verilmemeli, düzenli aralarla kontrol edilerek su eklenmelidir.

3.4. Kültür plaklarının değerlendirilmesi

 Ġlk değerlendirme 72 saat inkübasyon ardından koloni mikroskobunda

×20 – ×50 büyütme ile yapılır. Koloni mikroskobu mevcut değilse kolonilerin incelenmesinde bir el büyüteci kullanılmalıdır.

 C-BGA plaklarının, kuĢkulu B. pertussis kolonilerinin varlığı açısından dikkatlice incelenmesi gerekir. Her ne kadar koloni görünümünden tanı koymak söz konusu değilse de sonraki tanımlama adımları için Ģüpheli kolonilerin belirlenmesi önemlidir (ġekil 3).

 Bordetella türlerinin C-BGA‟daki koloni görünümleri aĢağıdaki gibidir:

(a) B. pertussis - Düzgün kenarlı ve düz yüzeyli, yaklaĢık 1 mm çapında transparan, konveks kolonilerdir. Üç günü aĢan

inkübasyonun ardından koloni çevresinde dar bir beta hemoliz zonu oluĢabilir.

(b) B. parapertussis - B. pertussis kolonilerine benzer ancak daha büyük ve donukturlar; yakından incelendiklerinde kahverengimsi görünümleri dikkat çeker. B.pertussis kolonilerinden daha kısa sürede oluĢurlar.

(c) B. bronchiseptica - Pürüzlü yüzeye sahip dövülmüĢ metali

anımsatan küçük koloniler oluĢtururlar. Bir gecelik inkübasyonun ardından gözlenirler.

(a) (b)

Şekil 3. (a) koloni mikroskobunda plakların incelenmesi (Kaynak: Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı, Difteri-Boğmaca Referans Laboratuvarı Arşivi, Ankara, 2007) (b) B.pertussis‟in koloni görünümü

Sayfa 14 / 30 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-01 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji

3.5. ġüpheli kolonilerden paralel pasaj yapılması - tanımlama basamaklarına geçiĢ

 Sonraki tanımlama basamaklarında kullanılacak saf kültürleri elde etmek için, kuĢkulu kolonilerden mümkün olduğunca çok sayıda seçilerek, 4‟e bölünmüĢ BGA ve KKA plaklarına paralel pasaj yapılır (bkz. ġekil 4).

 Plaklar 36C‟de, nemli, aerob ortamda inkübe edilir ve 48-72 saat sonra değerlendirilirler.

 Değerlendirmeyi ġekil 1‟de özetlenen adımlar takip eder. Buna göre Ģüpheli koloniler eğer;

(a) hem KKA‟da hem BGA‟da üreme gösterirlerse - B. parapertussis veya B.bronchiseptica olabilir! Diğer adımlara geçilmelidir.

(b) sadece BGA‟da ürerlerse – B. pertussis olabilir! Diğer tanımlama adımlarına geçilmelidir.

Şekil 4. C-BGA‟daki kuĢkulu kolonilerin BGA‟ya ve KKA‟ya paralel pasajı (Şekil 21 no.lu kaynaktan alınarak uyarlanmıştır).

Boyanma özellikleri

 Bordetella türlerinin ortak mikroskopik özellikleri Ģöyle sıralanabilir:

 Küçük kokobasil yapısında Gram negatif bakterilerdir.

 Sefaleksinli besiyerinden yapılan Gram boyamalarda uçlara doğru incelen, düz veya hafifçe kıvrık pleomorfik çomaklar gözlenir.

 Hareketsizdirler.

 Spor yapmazlar.

 Aside dirençli boyanmazlar.

BGA KKA

C-BGA’da ilk üreme (primer kültür)

Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 15 / 30 Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015

 BGA pasajında üreyen kolonilerden Gram boyama yapılır (bkz. UMS-B-TP-03) ve özellikleri değerlendirilir.

Tarama testleri

 BGA pasajındaki saf üremelerden yapılması önerilen basit tarama testleri Tablo 2‟de verilmiĢtir.

 Özellikle BGA‟da 72. saatten sonra üreyen, oksidazı pozitif, koyun kanlı agarda üremeyen, üreyi hidrolize etmeyen bakteriler B. pertussis yönünden incelenmeye devam edilir. Bu bakteri izolatlarının kesin tanısı için B. pertussis faz I antiserumla lam aglütinasyonu

uygulanmalıdır.

Tablo 2. Bordetella türlerinin üreme ve biyokimyasal özellikleri

Özellik B.pertussis B.parapertussis B.bronchiseptica

BGA'da üreme 3–6 gün 1-3 gün 1-2 gün

Koyun kanlı agarda üreme - 1-3 gün 1-2 gün

MacConkey agarda üreme - - +

Nutrient agarda* veya CSM‟de

kahverengileĢme - + -

Oksidaz + - +

Üre hidrolizi - + (24 saat) + (4 saat)

Hareket - - +

Nitrat redüksiyonu - - +

Sitratın utilizasyonu - + +

* 1g/L tirozin içeren nutrient agar; (+) pozitif reaksiyon; (-) negatif reaksiyon