Kromatografiye Giriş

İlk kez 20. y.y. başlarında Rus botanikçi Michail Tswett tarafından kullanılan kromatografi, tüm bilim dallarında uygulaması bulunan güçlü bir ayırma ve tayin tekniğidir. Tswett yeşil yapraklardan elde ettiği çözel-tiyi, toz haline getirilmiş kalsiyum karbonatla doldurulmuş cam bir kolon-dan geçirerek çözeltide bulunan klorofil, ksantofil gibi renkli maddeleri (pigmentleri) kolonda ayrı tabakalar (halkalar) halinde ayırmayı başarmış-tır. Yunancada chroma “renk”, graphin de “yazma” anlamına geldiğinden, kolonda renkli bantlar şeklinde ayrılmalar gören Michail Tswett, bu tekniği

“chromagraphein” olarak adlandırmıştır (Ettre, 2003).

Kromatografi çok geniş ve verimli bir analitik yöntem olarak karşımı-za çıkmaktadır. Kromatografi alandaki araştırmalarından dolayı şimdiye kadar 12 bilim adamına Nobel ödülü verilmiştir. Hiçbir araştırma alanında bu kadar çok Nobel ödülü verilmemiş olması kromatografi tekniğinin üs-tünlüğünü ortaya koymaktadır.

Teknik bir tanım yapmak gerekirse; kromatografi, bir karışımda bulu-nan kimyasal bileşenlerin, hareketli (mobil) bir faz yardımıyla sabit (stati-onary) faz üzerinden değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanarak birbirinden ayrılmasını sağlayan ve ayrılan bileşenlerin miktarlarının çeşitli fiziksel ve kimyasal metotlarla belirlenmesine imkan veren bir ayırma ve tayin metodudur. Hareketli ve sabit fazlar, numune bileşenlerinin farklı oranlarda dağılmasını sağlayacak şekilde ve yapılacak analiz metoduna göre seçilebilmektedir. Sabit faz tarafından kuvvetli bir şekilde tutulan numune bileşenleri daha yavaş hareket ederken; zayıf tutu-lan numune bileşenleri ise hızlı hareket ederek birbirlerinden ayrılmakta-dırlar. Bu hareket hızının farklılığı sonucu, numunede bulunan bileşenler birbirlerinden kalitatif veya kantitatif olarak analiz edilebilen farklı bantlar veya bölgeler şeklinde konumlanmaktadırlar.

2.1. Kromatografinin Sınıflandırılması

Kromatografik teknikler, içerisinde bulunan farklı uygulama yöntem-lerine göre birden fazla başlık altında sınıflandırılabilmektedir. Bunlar;

Ayrılma mekanizmalarına göre;

• Adsorpsiyon kromatografisi

• Partisyon kromatografisi

• İyon değiştirme kromatografisi

• Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi

• İyon çifti kromatografisi

• Afinite kromatografisi Uygulama biçimine göre

• Düzlemsel kromatografi —Kâğıt kromatografisi

—İnce tabaka kromatografisi (TLC)

• Kolon kromatografisi

—Gaz kromatografisi (GC)

—Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)

Faz tiplerine göre

• Sıvı kromatografisi

—Sıvı-Katı kromatografisi

—Sıvı-Sıvı kromatografisi

• Gaz kromatografisi

—Gaz-Katı kromatografisi

—Gaz-Sıvı kromatografisi

• Süperkritik akışkanlı kromatografi

Çizelge 2.1. Kolon Kromatografisi Metotları (Saraç, 2009) Genel Sınıflandırma ^{Özel Metot Durgun Faz Denge Tipi}

Sıvı kromatografisi

Bağlı-sıvı faz Katı bir yüzeye bağlı organik

İyon değişimi İyon değiştirici

reçine İyon değişimi Boyut elemesi Polimer katının

yüzeyindeki

sıvı Partisyon/eleme

Gaz kromatografisi (hareketli faz; gaz)

Gaz-sıvı Bir katı üzerine absorplanmış sıvı

Gaz ve sıvı arasında partisyon Bağlı-gaz fazı Katı bir yüzeye

bağlı organik

Çizelge 2.1’in ilk sütununda gösterildiği gibi kromatografik metotlar sıvı, gaz veya süperkritik akışkan olmak üzere, hareketli fazın yapısına bağlı olarak üç sınıfta da verilebilmektedir. Bu tablonun ikinci sütununda

durgun fazın yapısına ve fazlar arası dengenin niteliğine bağlı olarak beş tür sıvı kromatografi, üç tür de gaz kromatografi tekniği bulunduğu görül-mektedir (Saraç, 2009).

2.2. Gaz Kromatografisi (GC)-Kütle spektrofotometresi (MS) Tekniği

Gaz kromatografisi (GC) uçucu olan ya da çeşitli türevlendirme me-totları ile uçucu hale getirilebilen numunelerin ayırma ve tayin analizle-rinde en çok kullanılan ayırma tekniğidir. GC ile ulaşılan ayırma seviyesi, doymuş ve doymamış yağ asitleri, trigliseritler, steroller ve birçok biyoak-tif türlerin başarılı bir şekilde tayin ve tespit edilmesine müsaade etmekte-dir. Gaz kromatografisinde genellikle hidrojen ve helyum gazları hareketli faz olarak kullanılmakta ve bu gazlar numune ile herhangi bir etkileşime girmediklerinden sadece numuneleri taşıma görevi üstlenmektedirler.

Gaz kromatografisinde ayrımı gerçekleştirilen türlerin tayini için çeşitli dedektörler kullanılmaktadır. Bunlardan en fazla tercih edileni, dü-şük maliyeti ve kolay kullanımı sebebiyle alev iyonlaşma detektörüdür (FID). Kapiler kolonun sonuna monte edilen FID dedektörü, kolondan çıkan her bir türün yakılması ile ortaya çıkan elektriksel iletkenlik farkı-nı ölçerek sinyal oluşturmaktadır. Gaz kromatografisi sergilediği yüksek ayırma potansiyeline karşın, ayırdığı türleri tayin etme noktasında sahip olduğu detektörlerden ziyade farklı tekniklerin dahil edilmesine ihtiyaç duymaktadır. Sahip olduğu FID ve diğer dedektörler, ayrımı yapılan bile-şenlerin türlerini tespit edememekte; içerdiği türler ve bu türlerin konsant-rasyonları tam olarak bilinen ticari standart karışımlar kullanılarak sadece miktarları hakkında bilgi verebilmektedirler.

Kütle spektrofotometresi (MS), moleküllerin iyon mertebelerinde ölçümlerini gerçekleştirdiğinden en hassas tayin sistemlerinden biri ola-rak karşımıza çıkmaktadır. Kütle spektrofotometrelerinin farklı analitik sistemlerde dedektör olarak kullanılması sonucu ICP-MS, GC-MS, HP-LC-MS gibi birleştirilmiş-teknikler olarak da adlandırılan günümüzün en hassas analiz teknikleri karşımıza çıkmaktadır. Kütle spektrofotometresi-nin temel prensibi, harici olarak oluşturulan bir elektrik ve / veya manyetik alanda hareket eden elektrik yüklü iyonların veya moleküllerin, farklı küt-le/yük (m/z) oranlarından faydalanarak tayin edilmeleri esasına dayanmak-tadır. Doğadaki her iyon veya molekülün kütle/yük oranı farklı olduğu için analiz sonucu elde edilen kütle/yük oranının mevcut veri tabanlarındaki kütle/yük oranları ile karşılaştırılması sonucu analiz edilen bileşenin türü tespit edilebilmektedir.

Gaz kromatografisi sisteminin dedektör kısmının sökülüp bu noktaya bir kütle spektrofotometresi bağlanması ile uçucu özellik gösteren

karışım-larda bulunan biyoaktif bileşenlerin hem ayrımı hem de türlerinin tayini GC-MS tekniği ile başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilmektedir. GC-MS tekniğinin diğer kütle spektrofotometresi içeren ayırma tekniklerinden en önemli üstünlüğü kompleks moleküllerin bile başarılı bir şekilde iyonlaştı-rılarak analiz edilebilmesidir (Pollard et al., 2007). Kütle spektrofotomet-resine sahip olan gaz kromatografisi sistemleri; kimya, petrol, çevre, ilaç, adli tıp, gıda ve kozmetik gibi alanlarda kullanım alanı bulduğu kadar, ar-keoloji ve arkeometrik çalışma alanlarında da büyük oranda uygulama ala-nı bulmakta ve sağladığı nitelikli veriler sonucu faydalı bir analitik tayin tekniği olarak karşımıza çıkmaktadır.

3. Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrofotometresi (GC-MS)