KÜRESEL DÜNYADA LĠDERLĠK

Para elucidar a estrutura cromossômica em que se encontra HINT, foram analisados três BACs provenientes de uma biblioteca genômica da cana-de-açúcar descritos como contendo a sequência pertencente à superfamília HIT. Estes foram inicialmente alinhados com o cDNA homólogo a HINT, mas apenas em dois cromossomos artificiais foram encontradas regiões correspondentes: BAC SHCRBA_011_I19 (90.754 pb) e SHCRBA_033_B15 (134.265 pb).

Com o mapeamento, no BAC SHCRBA_011_I19 além da sequência de ligante de zinco, foram encontradas sete sequências codantes presentes tanto em sorgo quanto em arroz (Tabela 5). Enquanto no o BAC SHCRBA_ 033_B15 foram obtidas apenas quatro sequências proteicas, além de HINT (Tabela 6). Apenas duas sequências de sorgo foram encontradas em comum entre os dois BACs (Sb01g036820.1 e Sb01g036830.1).

Tabela 5: Sequências encontradas no BAC SHCRBA_011_I19 Nº no

mapa LOC em S. bicolor

LOC em O. sativa Descrição comum 1 Sb01g022040.1: LOC_Os10g27470.

1: Proteína expressa com KH domain 2 LOC_Sb01g036

840.1 LOC_Os03g29580.1_GX4P Proteína expressa 3 LOC_Sb01g036 850.1 similar to Cytidine and deoxycytidylate deaminase zinc- binding LOC_Os03g20570. 1: tRNA-specific adenosine deaminase 2 ---- 4 Sb01g036860.1 Similar à ligase Lipoate-protein LOC_Os03g20560. 1: ligase biotin-- protein ---- 5 Sb01g036820.1 LOC_Os03g20640.

1 Similar à proteína expressa 6 Sb01g036870.1 LOC_Os03g20550.

1: WRKY55, expressa

7* LOC_Sb01g036

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Tabela 6: Sequências encontradas no BAC SHCRBA_ 033_B15 Nº no

mapa LOC em S. bicolor

LOC em O. sativa Descrição comum 1 Sb01g036810.1 LOC_Os03g20650.

1 Fator de transcrição contendo o domínio bZIP 2 Sb01g036820.1 LOC_Os03g20640. 1 Proteína expressa 3* Sb01g036830.1: similar to 14 kDa zinc-binding protein LOC_Os03g20630. 2: histidine triad family protein, putative, express HINT 4 Sb09g029295.1: similar à proteina OJ1268_B08.11 LOC_Os05g49920. 1: pentatricopeptide 5 Sb04g006710.1: Proteína não caracterizada LOC_Os02g10490. 1 Proteína expressa

Entre as sequências encontradas como coincidentes nos dois BACs estava a sequência que apresenta identidade com a sequência encontrada na biblioteca subtrativa de cana-de-açúcar: Sb01g036830.1. No banco de dados esta sequência é descrita como ligante de zinco, com 14kDa, e que apresenta o domínio HIT na (tabelas 5 e 6). Para a sequência gênica de arroz referente à proteína HINT foram preditas duas sequências proteicas distintas.

O alinhamento das sequências proteicas de HINT disponível no banco de dados do NCBI com a sequencia proteica proveniente do cDNA da biblioteca subtrativa mostrou uma grande conservação entre os aminoácidos, com apenas 3 aminoácidos de variação em relação à proteína prescrita para a região presente no BAC SHCRBA_011_I19.

Pelo programa BLASTp foram encontradas as sequências proteicas correspondentes ao cDNA de HINT de cada um dos cromossomos bacterianos

artificiais. Com o alinhamento da sequência do cDNA com a região codante de HINT foi observada uma identidade nucleotídica de 95% para o BAC SHCRBA_011_I19 e de 99% para o BAC SHCRBA_033_B15. Pelo alinhamento das sequencias proteicas correspondente à cada BAC disponíveis no BLAST com a sequência proteica obtida para o cDNA da biblioteca subtrativa foi encontrada uma identidade de 98% para a proteína do BAC SHCRBA_011_I19 (AGT16929.1) e de 100% para a sequência proteica do BAC SHCRBA_033_B15 (AGT16429.1).

Para entender a divergência entre as demais regiões dos dois BACs e contribuir com o entendimento cromossômico de cana-de-açúcar, realizamos a observação das regiões não codantes em busca fatores que Foi encontrada uma abundante presença de elementos transponíveis nos dois BACs. Os elementos transponíveis mais presentes no BAC SHCRBA_011_I19 foram os retrotransposons (21,39% da sequencia), Ty1/Copia (13,29%), Gypsy/DIRS1(6,38%), DNA transposons (1,22%) e Tourist/Harbinger (0,5%). No BAC SHCRBA_ 033_B15 mantem-se a predominância de retrotransposons (3,58%), Ty1/Copia (21,09%), Gypsy/DIRS1(16,48%) DNA transposons (1,02%).

Outro ponto analisado foi a região promotora do gene HINT presentes nesses dois BACs. Por meio desta análise foram encontrados possíveis elementos regulatórios na região cis. Durante essa observação motivos regulatórios encontrados estavam presentes nos dois BACs: elementos ligados ao aumento da transcrição; elementos relacionados ao promotor e enhancers; elementos relacionados à indução anaeróbia; elementos de resposta ao ácido abcísico; elementos de resposta ao ácido salicílico; elementos de resposta à auxina; elementos característicos de resposta à luz e elementos relacionados ao estresse térmico.

Apesar das sequências relacionadas aos reguladores comuns, foram vistas algumas relacionadas a respostas exclusivas de cada BAC. No SHCRBA_011_I19 elementos do tipo “fungal elicitor” (Box-W); elementos relacionados à ligação determinadas combinações de ácidos nucleicos (AT-rich); metabolismo de ZEIN (O2-site); elementos responsivos ao dano físico/ injúria (WUN-motif) e alguns sem

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funções definidas (W box; GCC box). Assim como no BAC SHCRBA_ 033_B15 temos como sequências regulatórias exclusivas as relacionadas ao estresse salino (MBS); elementos necessários para expressão das sementes (RY-element); alguns sem funções definidas (Unnamed__1; Unnamed__3; Unnamed__6); elementos cis relacionados na resposta para o metil-jasmonato/MeJA (CGTCA-motif; TATCCAT/C- motif; TGACG-motif) e no controle circadiano (CIRCADIAN). Portanto, foram encontradas diferenças entre as regiões cromossômicas em que as sequências referentes à HINT se encontram em cana-de-açúcar, desde as sequências adjacentes até as regiões regulatórias de cada um dos genes.

DISCUSSÃO

Este trabalho caracterizou o gene HINT, membro da superfamília HIT, de cana-de-açúcar quando demostrou suas possíveis relações filogenéticas com a mesma proteína de outros organismos, especialmente outras monocotiledôneas. Como também mostrou a presença de duas proteínas distintas relacionadas à HINT, que apresentam alta identidade com o cDNA de bibliotecas relacionadas à floração.

Ao analisar-se individualmente a proteína obtida in silico para HINT e compará-la com as sequências que representam os distintos reinos em que HINT1 foi encontrada a conservação do motivo característico da família HIT, que está envolvido na ligação com nucleotídeos e dos domínios proteicos adjacentes, conforme o publicado anteriormente por Wu e colaboradores (2011) para a mesma proteína de Z. mays. Além disto, pôde-se observar que a região C-terminal da proteína HINT de cana-de-açúcar, assim como a mesma região de HINT de milho, ao serem alinhadas a E.coli não mostraram conservação, o que poderia sugerir diferentes substratos de atuação já que esta região direciona a atividade catalítica da proteína (CHOU; WAGNER, 2007; BARDAWEEL et al, 2010). Esta conservação parcial foi demonstrada in vivo com a proteína HINT de humanos e de levedura que apesar da baixa identidade (34%) conseguem formar homodímeros funcionais. Além disso, HINT dos dois organismos interagem com proteínas para atividades de fosforilação de domínios C-terminais (CTD). No entanto, apenas HINT de humanos interage com proteínas formadoras de complexo ativantes de quinase (CAK) (KORSISAARI; MAKELA, 2000).

Na árvore filogenética da proteína HINT foi observado um agrupamento entre as monocotiledôneas com a manutenção de sua proximidade com dicotiledôneas e a separação das algas o que condiz com o descrito para a filogenia das angiospermas, pois monocotiledôneas e dicotiledôneas separam-se das algas formando o grupo das plantas terrestres (QIU et al, 2006). Essa árvore reflete um agrupamento entre as sequências que tem o mesmo direcionamento celular quando mostras as sequências proteicas monocotiledôneas próximas, pois para estas sequências foi encontrada por meio do PSORT a predição para permanência dessa

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proteína no citoplasma, entretanto, elas se separam em dois grupos que correspondem às plantas C3 (H. vulgare e arroz) e C4 (milho, sorgo e cana) conforme visto para proteínas relacionadas ao metabolismo de fixação de carboidratos desses organismos (PATERSON et al., 2009).

Além disso, a partir das interações apresentadas nos interatomas de HINT e da SUBTILASE, pode-se inferir que estas podem fazer o papel de ligante comum, anteriormente desenvolvido apenas pela PROTEIN KINASE C (PKC), e assim relacionar HINT com as proteínas 14-3-3. Anteriormente ambas foram descritas como inibidoras da PROTEIN KINASE C (AIKTEN, 2006) e agora são vistas em interações proteicas com SUBTILASES.

É importante ressaltar também que em cana-de-açúcar, através da investigação de cromossomos artificias bacterianos, foram encontradas duas proteínas relacionadas à HINT, ambas com predição para citoplasma, mas com organização gênica bem diferente. Enquanto em A. thaliana foram relatadas cinco proteínas demonstrando o domínio característico da família HIT, mas apenas uma foi caracterizada como ligante de nucleotídeo, por tanto, como homologa à HINT; no entanto essa proteína é encontrara na organela peroxissomo (REUMANN et al., 2007; REUMANN et al., 2009). Em arroz foi encontrado apenas uma única sequencia gênica com homologia com HINT e com duas sequências proteicas (por

splicing alternativo) com predições para localizações distintas no interior da célula.

Este resultado mostra que um evento de splicing alternativo pode estar relacionado à diferente localização em arroz como já foi observado para outras proteínas (DIXON et al., 2009).

Com a observação das sequências correspondentes à HINT nos BACs, houve a identificação de duas sequências gênicas distintas de HINT em cana-de-açúcar. Enquanto que na busca por homólogos em outros organismos, foi encontrada uma única sequência gênica de arroz, passível de splicing alternativo. Isto, aliado às diferenças nas regiões regulatórias, indicam que estes podem ser genes órtologos fruto da poliploidia e aneuploidia característica da geração dos cultivares de cana- de-açúcar (Saccharum ssp) pelo cruzamento entre plantas do gênero Saccharum

(D’HONT et al., 1996). O que também é evidenciada pelo mapeamento das demais sequências dos dois BACs. Demonstrando que tanto a superfamília HIT quanto os homólogos de HINT podem ter numero variado de cópias e localizações celulares de acordo com o organismo.

Ainda observando os BACs, as sequências identificadas estão relacionadas especialmente com o cromossomo 3 de Orysa sativa e o cromossomo 1 de Sorghum

bicolor e apesar de distintas entre si confirmam uma homologia entre estes

cromossomos (HERNANDEZ et al., 2012).

Outra observação foi a presença de elementos transponíveis (ET) encontrada nos dois BACs. É estimado que cerca de 50-80% do genoma das gramíneas seja composto por esses elementos transponíveis seja de DNA ou RNA (FESCHOTE et

al., 2002; WANG et al., 2010; FIGUEIRA et al., 2012). Foi observada ainda a

presença de um ET no íntron do gene HINT presente em um dos BACs, o que pode indicar alterações na funcionalidade desse gene, pois os ET podem estar relacionados com a evolução por serem fragmentos de DNA capazes de afetar a estrutura do genoma devido à de sua mudança de local que possibilita um rearranjo do genoma e a da estrutura de genes (BENNETZEM, 2000; FESCHOTE; JIANG; WESSLER,2002; DE ARAÚJO et al., 2005).

Mas um ponto interessante foi a comparação entre as regiões regulatórias das duas sequencias do gene HINT encontrada nos dois BACs. Foi observado que a possível região promotora apresenta sequências que indicam resposta à luz e a vias de estresses relacionados à via autônoma por meio do ácido absicísico, ácido salicílico e auxinas, mas apenas uma das sequências foi encontrados elementos cis exclusivos relacionados com metil-jasmonato, estresse salino, a seca e o ciclo circadiano. Havendo assim a indicação de que pode haver a sua influência no processo de floração dependente da alteração da sua expressão associada ao estresse e a mudanças nas condições de luz, além do acúmulo de ácido salicílico, conforme visto por Martinez e colaboradores (2004).

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As regiões regulatórias do gene HINT mostram que ele deva ser um gene de integração entre as vias de três fito-hormônios, considerados sinalizadores altamente relacionados com as respostas das plantas aos estímulos exógenos, em especial aos fatores de estresse biótico (patógenos e herbivoria) e abióticos (estresse salino, hídrico, temperatura, UV), tendo o próprio gene HINT regiões consideradas diretamente responsivas para esses estresses (SUN, 2010; THALER

et al., 2012). Então, sendo esse gene responsivo às condições climáticas presentes

na região Nordeste (alta luminosidade e baixa pluviosidade), é possível entender como é desencadeado o aumento da expressão de HINT no inicio da floração em cultivares expostos à estas condições.

Ao retomarmos a rede de informações que relaciona HINT e SUBTILASES, foi visto que esta interação também pode estar relacionada ao desenvolvimento das sementes. Tendo em vista que HINT apresenta região regulatória relacionada à elementos necessários à expressão do endosperma e da semente, enquanto a SUBTILASE encontrada no interatoma foi vista como um ligante da proteína GRF10 (14-3-3 Ɛ), uma proteína com alta expressão durante o desenvolvimento da semente de A. thaliana (SWATEK et al., 2011). Esta mesma proteína da família 14-3-3 tem a capacidade de se interagir à BZR1 (BRASSINAZOLE RESISTANT1) e assim modular sua distribuição celular, encaminhando-o para o citoplasma. Esta ligação 14-3-3/BZR1 também é requerida para que a proteína BIN-2 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE2) realize também essa exportação (GAMPALA et al., 2007; RYU et

al., 2007). Por outro lado, a proteína BIN2 pode atuar na resposta positiva à auxina

(IAA) e servir de integração entre as vias de IAA e BR durante a germinação e pós- desenvolvimento (HU; YU, 2014). Portanto, a possível interação da proteína HINT com a proteína SUBTILASE pode estar relacionada também aos fatores presentes na região regulatória de HINT.

Por outro lado, HINT e outras proteínas da família HIT seriam responsáveis pela produção de moléculas de ácido sulfídrico (H2S) como produto de sua ação enzimática. Este ácido, em quantidade moderada, é benéfico para o desenvolvimento vegetal levando a diminuição no tempo de germinação, acúmulo de biomassa, acréscimo no tamanho da planta (raiz, caule e folhas), mas em excesso tem papel fitotóxico podendo levar assim a planta à morte (GURANOWSKI et al.,

2010; DOOLEY; NAIR; WARD., 2013). Isto seria coerente com o descrito para proteína HINT de coelhos, mostrado como uma sulfohidrolase que hidrolisa _5’-O- phosphorothioates (S-pNs) para a formação de 5’-NMP (pN) e com a liberação de H2S como produto de sua interação com nucleotídeos sulfatados (OZGA, et al., 2010). Portanto, a expressão de HINT pode levar à produção dessa molécula no ápice meristemático e esta, por sua vez, servir de sinalizadora para inibição da floração.

Na biblioteca subtrativa de cana-de-açúcar foram encontrados também dados que indicam uma expressão diferencial para duas isoformas de 14-3-3 em cultivares com distintos períodos de indução floral, os cultivares que possuem um período de floração tardio apresentam um incremento da expressão dessas isoformas; o mesmo é observado na expressão de HINT1 (FURTADO, 2007; SILVA, 2011). Isso indica que a via de atuação de HINT pode estar interligada às vias já conhecidas que envolvem as proteínas 14-3-3 e corrobora os achados desse trabalho para seu envolvimento no metabolismo de resposta à luz e vias de estresse.

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