As fibras serotonérgicas estão distribuídas em todos os núcleos da linha média/intralaminares, conforme avaliação de DOR e observação direta através de microscopia óptica de campo claro.
Encontramos três tipos de fibras serotonérgicas nos núcleos estudados, as quais foram denominadas de fibras rugosas, granulares e semi-granulares. As fibras rugosas caracterizam- se como relativamente espessas, apresentando um elevado número de varicosidades arredondadas e de grande volume; as fibras granulares apresentaram-se relativamente finas, com diversas e pequenas varicosidades distribuídas ao longo de seu eixo, semelhantemente a grânulos, e as fibras semi-granulares são semelhantes às granulares em espessura, entretanto, apresentam menor número de varicosidades irregularmente distribuídas ao longo de seu eixo.
Densidade Óptica Relativa (Média ± Desvio Padrão)
Núcleo Rostral Médio Caudal
Núcleos da linha média PV 37.459 ± 7.750 53.556 ± 4.896 50.160 ± 6.912 PT 20.321 ± 15.842 21.381 ± 7.590 27.685 ± 9.238 Re 52.005 ± 5.910 70.787 ± 5.242 57.382 ± 3.662 Rh 41.719 ± 2.791 49.827 ± 5.069 34.029 ± 4.466 IMD 44.186 ± 2.483 35.527 ± 10.961 30.425 ± 11.993 Núcleos intralaminares CM 16.619 ± 2.522 34.435 ± 4.230 30.438 ± 7.391 PC 16.733 ± 3.401 15.495 ± 7.975 13.243 ± 6.504 CL 54.512 ± 13.739 38.299 ± 8.093 30.425 ± 11.993 PF 37.374 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
46 5.3.1 Núcleos da linha Média
O PV está densamente preenchido por fibras e terminais serotonérgicos, conforme DOR. As fibras encontradas nesse núcleo foram predominantemente do tipo rugosa, com suas varicosidades se apresentando conspícuas, variando de 1 a 3 botões por fibra. Tais fibras apresentam orientação predominantemente dorsoventral, sendo relativamente curtas (Figura 11B).
O PT foi o núcleo com menor marcação de fibras serotonérgicas, conforme demonstrado pela DOR. A maioria das fibras encontradas nesse núcleo foi do tipo granular, apresentando comprimento relativamente maior em relação àquelas observadas no PV. A orientação das fibras no interior do PT é semelhante à observada no PV, ou seja, dorsoventral (Figura 11C).
O Re é o mais povoado núcleo da linha média em relação a fibras 5-HT-IR, conforme análise de DOR. Neste núcleo observamos fibras do tipo granular e semi-granular. Tais fibras apresentam seu maior eixo direcionado dorsoventralmente e uma menor parte com orientação horizontal; em geral, são relativamente curtas. Uma característica observada nas fibras serotonérgicas no Re é uma ampla ramificação (Figura 11D).
O Rh é povoado por terminais serotonérgicos com DOR próxima ao observado no PV e IMD. Suas fibras também se caracterizaram especialmente do tipo granular e semi-granular, estando orientadas predominantemente no eixo horizontal (Figura 12C).
A análise do IMD permitiu identificar presença de fibras serotonérgicas do tipo semi- granular. A orientação de tais fibras também se caracterizou dorsoventral, apresentando maior comprimento relativo (Figura 12B).
5.3.2 Núcleos Intralaminares
A análise qualitativa das fibras serotonérgicas nos núcleos intralaminares do tálamo do mocó revela fibras com predominância de orientação dorsoventral no PC e PF; no CM e CL a orientação das fibras é predominantemente horizontal. Nos núcleos PC e CM foram encontradas fibras granulares e semi-granulares (Figura 13); no CL e no PF sobressaíram fibras do tipo semi-granulares (Figuras 13D e 14). Aparentemente não existem muitas ramificações, entretanto, uma característica das fibras em todos os núcleos intralaminares do mocó é o grande comprimento quando comparadas àquelas observadas nos núcleos da linha média.
47 .
51 6. DISCUSSÃO
No presente estudo, mostramos as características morfológicas dos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo do mocó, a partir da construção de esquemas baseados em secções coradas pelo método de Nissl. Além disso, através da utilização da técnica de imunoistoquímica foi possível caracterizar o padrão de distribuição dos terminais serotonérgicos em tais núcleos, bem como descrever os aspectos morfológicos associados às fibras examinadas. Verificamos, também, as diferenças relacionadas à densidade de fibras serotonérgicas entre os núcleos da linha média e intralaminares através da técnica de DOR. Os resultados revelaram que a organização deste complexo de núcleos é, em parte, similar ao que tem sido previamente descrito em outros mamíferos.
Em comparação à organização citoarquitetônica do rato (Paxinos e Watson, 2007), também identificamos, no mocó, os núcleos da linha média, do sentido rostral ao caudal: núcleos PV, PT, Re, Rh e IMD; e os intralaminares, no mesmo sentido: núcleos CM, PC, CL e PF.
A distribuição de fibras serotonérgicas através de núcleos talâmicos foi observada por Vertes et al. (2010) em ratos (Sprague-Dawley) a partir de imunoistoquímica para transportador de 5-HT. Visualmente os autores identificaram os núcleos da linha média e intralaminares do tálamo de rato como densamente marcados. Dentre os núcleos da linha média, classificaram o PV, Rh, Re e IMD como intensamente marcados, enquanto o PT como moderadamente marcado. Dentre os núcleos intralaminares, classificaram o CM e CL como intensamente marcados, enquanto que o PC e PF moderadamente marcados.
Cropper et al. (1984) também descreveram o padrão de distribuição de 5-HT em ratos albinos a partir da técnica de imunocitoquímica indireta usando um anticorpo contra um conjugado 5-HT-hemocianina em animais tratados com L-triptofano e MAO. Os autores identificaram os núcleos da linha média e intralaminares com elevada densidade de marcação, destacando-se, dentre os da linha média, os núcleos PV, Rh e Re; poucas fibras foram observadas no PT. Dentre os intralaminares relatou o CM como levemente marcado.
Em primatas, a distribuição de 5-HT foi descrita no tálamo de macacos-de-cheiro (Saimiri sciureus) a partir de imunoistoquímica contra a própria 5-HT. Dentre os núcleos que apresentaram maior densidade de inervação destacam-se os da linha média/intralaminares do tálamo; entre os da linha média ressaltam-se os núcleos PV, Re e o núcleo central, localizado
52 entre o PV e Re, região comparável ao núcleo IMD em ratos ou, conforme o nível observado, ao Rh. Dentre os intralaminares destaca-se o núcleo CM como intensamente marcado (Lavoie e Parent, 1991). Em outra espécie de primata, (Macaca Mulata), a distribuição de fibras serotonérgicas no PV é visivelmente maior em relação aos demais núcleos da linha média e intralaminares (Hsu e Price, 2009).
Em hamsters sírios (Mesocricetus auratus), a partir de imunoistoquímica para 5-HT, foi observada densa marcação nos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo. Especificamente, foi identificado que os núcleos PV e Re apresentaram-se intensamente marcados, seguidos do PT e IMD, este último considerado moderadamente marcado. Dentre os intralaminares, o CM foi considerado densamente marcado e o CL fracamente marcado; não houve relato do PC (Morin e Meyer-Bernstein, 1999).
Diferentemente dos autores supracitados, analisamos a distribuição de fibras serotonérgicas através dos núcleos da linha média/intralaminares a partir de uma técnica de DOR, o que permite a obtenção de dados numéricos na semi-quantificação dessas fibras. Até o presente, nenhum estudo havia empregado métodos para semi-quantificação de terminais serotonérgicos nos núcleos da linha média e intralaminares. Tais estudos têm como base a simples análise visual feita através de microscopia óptica. Considerando que a análise de DOR equivale à marcação do neurotransmissor analisado, identificamos, de maneira geral, uma intensidade de marcação de fibras serotonérgicas estatisticamente maior nos núcleos da linha média em relação aos intralaminares, esse dado corrobora com estudos realizados em ratos (Cropper, et al.,1984; Vertes, et al., 2010), primatas (Lavoie e Parent, 1991) e hamsters Morin e Meyer-Bernstein, 1999). Dentre os da linha média, nesta ordem, os núcleos Re, PV, Rh e IMD apresentaram maior intensidade de marcação. O PT foi o núcleo que apresentou menor marcação, semelhante ao observado em ratos e primatas (Lavoie e Parent, 1991; Vertes et al., 2010), diferentemente do observado em hamster que apresenta uma densa inervação serotonérgica nesse núcleo (Morin e Meyer-Bernstein, 1999).
Dentre os intralaminares foi identificada, através da DOR e análise estatística, intensa marcação no CL em relação aos núcleos CM, PC e PF que apresentaram baixa densidade de fibras 5-HT-IR. Tal padrão de distribuição contrasta com os resultados descritos em hamster (Morin e Meyer-Bernstein, 1999) e macaco (Lavoie e Parent, 1991) em que uma maior quantidade de fibras é encontrada no CM. No entanto, Vertes et al. (2010) destacaram o CL como intensamente marcado em ratos, corroborando com os resultados encontrados no mocó.
53 Na análise referente ao contínuo rostro-caudal, revelamos homogeneidade na distribuição de fibras serotonérgicas através dos núcleos da linha média/intralaminares do tálamo do mocó, semelhante ao observado por Vertes et al. (2010). No entanto, algumas particularidades podem ser destacadas: mostramos que o núcleo PV apresentou uma predominância quantitativa de fibras serotonérgicas nos níveis médios e caudais, o Re nos níveis médios, o Rh nos níveis rostrais e médios, o PT mostrou-se homogêneo por toda extensão rostro-caudal e o IMD predominou nos níveis rostrais. Vertes et al. (2010), diferentemente dos nossos resultados, mostraram, em ratos, que havia maior presença de fibras serotonérgicas em níveis mais rostrais do PV, Re e PT em detrimento dos níveis médios e caudais e que o IMD não apresentava variação na distribuição de fibras entre os níveis avaliados. Entre os intralaminares, no CM foi revelada uma maior DOR nos níveis médios e caudais, CL e PF nos níveis rostrais e o PC mostrou-se homogêneo (Tabela 2). Contrariamente aos dados apresentados por Vertes et al. (2010) que descrevem a inexistência de diferenças significativas da distribuição de fibras serotonérgicas entre os núcleos intralaminares do tálamo rato ao longo do eixo rostro-caudal.
Após análise dos resultados referentes à distribuição de fibras 5-HT-IR, em comparação aos dados apresentados na literatura, podemos constatar que a distribuição das fibras serotonérgicas através dos núcleos deste complexo nuclear talâmico, no mocó, é similar à encontrada em outras espécies de roedores, assim como em alguns primatas, com algumas variações. Por exemplo, nenhum artigo cita uma maior presença de terminais serotonérgicos no Re em relação ao PV ou aos demais núcleos da linha média. Tais diferenças descritivas podem estar associadas a não utilização de método dequantificação de fibras em trabalhos prévios.
Os núcleos da linha média/intralaminares do tálamo podem ser classificados como integrantes do tálamo límbico em consequência de emitirem projeções para diversas estruturas relacionadas a funções cognitivas/afetivas. Van der Werf et al. (2002) analisaram diversos casos de injeção com traçadores anterógrados nos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo de 128 ratos Wistar, e assim propuseram a organização desse complexo nuclear em quatro grupamentos conforme suas eferências. Um grupo dorsal, composto pelo PV, PT e IMD, cujas saídas direcionam-se especialmente para o estriado ventral, destacando-se a parte medial do núcleo accumbens, córtices pré e infralímbico e a amígdala, podendo estar, portanto, relacionado a funções víscero-límbicas. Um grupo lateral, composto pelo PC, CL e a
54 porção anterior do CM, cujas fibras direcionam-se principalmente ao estriado dorsal e córtex cingulado, podendo estar associado a funções cognitivas. Um grupo ventral, cujos integrantes são o Re, Rh e a parte posterior do CM, projetando poucas fibras ao estriado e substanciais fibras às camadas superficiais e profundas da maioria das áreas corticais, além de emitir projeções a regiões não límbicas, como córtex gustatório, visceral, insular, auditivo e motor. O Re e provavelmente o Rh emitem projeções também ao hipocampo; sendo assim, o grupo lateral pode estar relacionado ao processamento sensorial multimodal; e o grupo posterior composto do PF, cujas eferências direcionam-se especialmente ao estriado, mas também ao córtex motor e sensorial, podendo estar, portanto, envolvido em funções motoras límbicas.
Pesquisas utilizando técnica de traçadores relataram forte entrada serotonérgica nos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo, as quais se originam principalmente dos núcleos DR e MnR (Vertes, 1991; Vertes et al., 1999). Sendo assim, pressupõe-se que esse neurotransmissor possui influência direta na modulação desses núcleos, estando relacionado provavelmente ao controle de funções límbicas.
Muitos pesquisadores têm concentrado seus esforços em entender o papel da 5-HT no tálamo, especificamente em núcleos envolvidos com o processamento da informação visual (Curtis e Davis 1962; Rogawski e Aghajanian 1980; Yoshida et al., 1984; Marks et al., 1987; Kayama et al., 1989; Monckton e McCormick, 2001). Todos estes estudos sugerem uma ação inibitória da 5-HT sobre o núcleo geniculado lateral dorsal do tálamo. Outros estudos intracelulares in vivo também apontam ação inibitória direta da 5-HT em neurônios tálamo- corticais devido ao aumento da condutância ao potássio (McCormick e Pape 1990; Lee e McCormick, 1996). Em contraste a sua ação direta nos neurônios tálamo-corticais, a 5-HT aplicada no núcleo reticular talâmico resulta em forte excitação nos neurônios GABAérgicos desse núcleo (McCormick e Wang 1991; Sanchez-Vives et al., 1996), sugerindo um mecanismo de ação indireta da 5-HT que pode inibir a entrada tálamo-cortical e, consequentemente, alterar o estado comportamental dos animais. Em um estudo in vivo utilizando o furão (Mustela putorius furo) (Monckton e McCormick, 2001), foi observado que a administração local de 5-HT promove uma hiperpolarização dos neurônios registrados eletrofisiologicamente nos núcleos CL e CM. O mesmo estudo sugere que os efeitos hiperpolarizantes da 5-HT nestes núcleos sejam mediados pelo receptor 5HT-1A devido ao fato da administração de antagonista desse receptor ter abolido tal resposta. Outros estudos propõem uma ação excitatória dos núcleos da linha média do tálamo sobre o prosencéfalo
55 límbico (Van der Werf et al., 2002; Vertes, 2006); com isso, fibras serotonérgicas podem, possivelmente, representar uma entrada excitatória aos núcleos da linha média ou, alternativamente, um portão que pode bloquear ou permitir o fluxo de informações desses núcleos a outras regiões límbicas (Vertes et al., 2006). Estudos mostraram, por exemplo, que as projeções do DR, relatadas em sua maioria serotonérgicas, ao PV exercem efeitos no estado de vigília; o PV é reciprocamente conectado com o núcleo supraquiasmático (Moga et al., 1995; Novak et al., 2000; Peng e Bentivoglio 2004; Li e Kirouac 2008; Vertes e Hoover, 2008) e com o núcleo dorsomedial do hipotálamo (Vertes e Hoover, 2008), área crítica no controle do ciclo sono e vigília. Além disso, as células do PV expressam elevado nível de c- fos quando em estado de vigília (Peng et al., 1995; Novak et al., 2000).
A referida dualidade funcional da 5-HT no tálamo está amplamente associada aos variados tipos de receptores presentes nos diversos campos receptivos destes axônios nesta região. Além disso, tais diferenças funcionais podem ainda estar relacionadas às variações de quantidade de fibras entre os núcleos, bem como aos diferentes padrões morfológicos das mesmas distribuídas nos núcleos da linha média e intralaminares. Este trabalho é o primeiro a descrever, com maior riqueza de detalhes, o padrão de distribuição de fibras serotonérgicas de forma quantitativa, levando em consideração as diferenças morfológicas, como espessura, comprimento e número de varicosidades das referidas fibras especificamente nos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo de um roedor. Em geral, as fibras que trazem informações sensoriais específicas para os diversos núcleos talâmicos apresentam uma maior quantidade de terminais, indicando um caráter controlador sobre os neurônios tálamo- corticais. As fibras serotonérgicas, em particular, atuam promovendo mudanças na condutância da membrana celular, alterando o limiar de excitação das células ou ativando sistemas de segundo-mensageiro intracelular, sendo geralmente descritas como fibras moduladoras devido a grande variabilidade de receptores distribuídos no tálamo (Pompeiano et al., 1994; Kia et al., 1996; Mengod et al., 1996; Lopez-Gimenez et al., 1998, 2001; Chapin e Andrade 2001a,b).
Nossos resultados mostram que as fibras observadas no complexo de núcleos da linha média/intralaminares podem ser classificadas em três tipos: fibras rugosas, granulares e semi- granulares. Em um estudo utilizando injeção de traçador anterógrado nos núcleos DR e MnR de rato (Kosofsky e Molliver, 1987) foram visualizadas fibras morfologicamente distintas no córtex cerebral. O estudo mostrou que as fibras originárias do núcleo MnR eram
56 relativamente espessas e com varicosidades de grande diâmetro, as quais foram chamadas de fibras do tipo M. A análise comparativa permite sugerir que as fibras rugosas observadas no mocó, devido às semelhanças morfológicas observadas com as fibras M descritas no rato também podem ter origem no MnR. Analogamente, as fibras com origem no DR foram classificadas como fibras do tipo D, sendo estas semelhantes morfologicamente às fibras granulares descritas no PT, Re, Rh, PC e CM no mocó. Entretanto, não existe analogia entre as fibras semi-granulares observadas no mocó e às fibras descritas no estudo de traçador anterógrado realizado no rato (Kosofsky e Molliver, 1987).
Em um trabalho realizado em coelho (Bjarkam et al., 2005), as fibras serotonérgicas que se projetam para as áreas retrohipocampais também foram caracterizadas morfologicamente. Os autores demonstraram a presença de fibras serotonérgicas com axônios de pequeno diâmetro e varicosidades pequenas, as quais foram classificadas como do tipo "finas". Essas fibras são semelhantes morfologicamente às fibras do tipo granulares observadas em nosso estudo. Outro tipo de fibra observada no coelho apresenta axônios de pequeno diâmetro e grandes varicosidades que foram chamadas de fibras "frisadas", semelhantes às fibras do tipo rugosa de nosso estudo. Um terceiro tipo de fibra foi descrita como do tipo "tronco", com axônios retos, de grande diâmetro e sem nenhuma varicosidade. De maneira geral, da mesma forma que o estudo em ratos (Kosofsky e Molliver, 1987), foram observadas semelhanças com as fibras do tipo rugosas e granulares, no entanto, nenhuma fibra vista em coelhos assemelha-se as do tipo semi-granulares. Assim, é possível inferir a presença de diferentes padrões de organização sináptica, consequentemente, diferentes mecanismos funcionais da 5-HT nos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo do mocó em consequência dessa variabilidade morfológica.
Os dados relativos à distribuição de fibras serotonérgicas no tálamo descritos na literatura, em sua maioria, são baseados em observações diretas através de microscopia óptica. Em nenhum deles foram empregados métodos adequados para quantificar as fibras serotonérgicas em nível talâmico. Assim, a partir de tal quantificação, bem como das variadas características morfológicas das fibras serotonérgicas encontradas, é possível sugerir diferentes influências modulatórias desse neurotransmissor, concordando com o seu grande repertório funcional exercido em nível talâmico para controlar a atividade cortical. As funções serotonérgicas estão especialmente associadas aos seus receptores; no tálamo de ratos e primatas, diversos receptores de 5-HT foram encontrados distribuídos heterogeneamente. Na
57 maioria das espécies, o principal tipo de receptor observado a nível talâmico é o subtipo 5- HT1 (Glennon, 1990). Em primatas não-humanos, altos níveis do subtipo 5-HT1 foram
observados nos núcleos da linha média, bem como núcleo PF (Stuart, et. al., 1986). No tálamo de humanos, especialmente o receptor 5-HT1A tem sido identificado (Pazos et al., 1987a).
Receptores 5-HT1A podem estar relacionados a uma série de funções como comportamento
sexual (Larsson e Ahlenius, 1999), termoregulação (Goodwin, et al., 1985) e comportamento alimentar, além disso, pessoas que apresentaram doenças como depressão ou Azheimer revelaram alteração na distribuição desses receptores (Meltzer, 1990; Nordberg, 1992). Um pequeno número de receptores do tipo 5HT2 foi visualizado no tálamo, exceto no núcleo PF
onde uma intermediária concentração desse receptor pode ser mostrada em ratos e humanos (Pazos et al., 1985, 1987b). Os níveis de receptores 5HT3 foram considerados baixos nos
núcleos talâmicos (Kilpatrick et al., 1987; Waeber et al., 1988). Receptores 5HT7 foram
identificados em elevada concentração nos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo (Gustafson et al., 1996; Vizuete et al., 1997); a funcionalidade desse receptor, identificado recentemente, ainda está sendo mais aprofundada, no entanto sabe-se que gera importante modulação da atividade neuronal, podendo, portanto, ser importante em estratégias terapêuticas para doenças psiquiátricas (Goaillard e Vicent, 2002). Estudo em um paciente com lesão talâmica, especialmente, nos núcleos CL, PV e CM revelou deficiência em funções de atenção e de execução de atividades (Edelstyn et al., 2012). Nesse sentido, é possível sugerir que as projeções serotonérgicas variadas em quantificação e caracterização morfológica podem exercer nos núcleos da linha média e intralaminares diversas funções, especialmente associadas à cognição.
Nessa perspectiva, comparando nossos resultados com a literatura analisada, é visto que a ordem Rodentia, apesar das variações de fenótipo, história de vida e tamanho cerebral não reflete grandes alterações da organização nuclear do complexo da linha média/intralaminares do tálamo, bem como da distribuição serotonérgica nesses núcleos, reforçando a sugestão de que o sistema serotoninérgico é um sistema de neurotransmissores antigo e evolutivamente bem conservado (Parent, 1981). Com isso, o presente trabalho fornece importantes contribuições para compreender a filogenia do sistema serotonérgico.
58 7. CONCLUSÕES
Os resultados do presente trabalho nos permitem chegar às seguintes conclusões com relação aos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo do mocó e às fibras serotonérgicas neles encontradas:
1. A técnica de Nissl foi eficiente no que tange a delimitação e caracterização citoarquitetônica dos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo do mocó, assim como a imunoistoquímica contra 5-HT para marcação de fibras serotononérgicas presentes nesses núcleos.
2. O complexo nuclear linha média/intralaminares do tálamo do mocó evidenciou- se semelhante ao observado em outros roedores sendo os da linha média compostos pelos núcleos PV, PT, Re, Rh e IMD e os intralaminares pelos núcleos CM, PC, CL e PF.
3. A imunorreatividade contra 5-HT mostrou-se presente em fibras/terminais por toda a região de núcleos da linha média/intralaminares com variação através dos núcleos. A partir da DOR visualizamos maior marcação de fibras nos núcleos da