Arazinin hazırlanması ve inşaat aşamasında farklı mesleki branşlardan olmak üzere

Como descrito no item 4 desta seção, após administração de cocaína 90 mg/kg, i.p. 100 % dos animais entram em convulsão seguida de estado de mal epiléptico e destes 40 % morrem durante o episódio convulsivo cerca de 10 a 15 min após a administração da droga. Partindo desta observação foi feita uma segmentação, onde o grupo de animais que convulsionou e entrou em estado de mal epiléptico recebeu a denominação de grupo estado

de mal epiléptico (EME) e os animais que morreram pela convulsão foram inseridos no grupo morte.

Sessenta minutos após a administração da overdose de cocaína os animais do grupo EME foram dissecados. Os animais que morreram após o tratamento foram prontamente dissecados. Os controles receberam solução salina e foram dissecados 60 min após a administração desta solução.

Neste estudo entende-se como animal em estado de mal epilético aquele que apresenta qualquer convulsão com duração acima de 5 min ou que apresente 2 ou mais episódios convulsivos entre os quais não ocorra recuperação da consciência neste intervalo de tempo (WARNER-SMITH, 2001). Embora esta seja a atual definição de Estado de Mal Epiléptico, os animais tratados com overdose de cocaína permaneceram em EME por no mínimo 30 min.

No capítulo 5 foi feita uma pequena modificação nos grupos experimentais, onde foram introduzidos novos grupos como: animais tratados com baixas doses de cocaína, pré- tratados com diazepam 10 mg/kg e submetidos à overdose de bupropiona (um inibidor da recaptação de NA e DA), visto que havia a necessidade de um estudo mais aprofundado sobre o envolvimento do estresse oxidativo (enzima catalase) nas convulsões e morte induzidas por cocaína. Para estes experimentos grupos diferentes de animais receberam cocaína em baixas doses, 10 e 30 mg/kg, i.p. e foram decapitados 1 h após o tratamento. Para a determinação do efeito do pré-tratamento com o diazepam na overdose de cocaína (90 mg/kg), os camundongos foram tratados com diazepam 10 mg/kg, i.p. e 30 min após foram administrados cocaína. Um outro grupo de animais recebeu apenas diazepam 10 mg/kg. Os animais foram sacrificados 1 h após a administração de cocaína, ou diazepam sozinho. Outro

grupo de animais foi tratado com bupropiona em alta dose (150 mg/kg) e foram decapitados 1 h após a administração de bupropiona. Após os intervalos de tempo descritos as áreas cerebrais corpo estriado e córtex pré-frontal foram dissecadas.

7 DISSECAÇÃO DAS ÁREAS CEREBRAIS (CORPO ESTRIADO E

CÓRTEX PRÉ-FRONTAL)

Após a convulsão os animais sobreviventes (grupo EME), bem como os animais controle (salina) foram mortos por estiramento cervical, os encéfalos foram retirados rapidamente e colocados sobre papel alumínio em uma placa de Petri com gelo. Os que morreram após a convulsão foram dissecados imediatamente após a morte.

Para a retirada do córtex pré-frontal (CPF), a porção anterior dos lobos frontais (em torno de 1,5 mm a partir do bulbo olfatório) foi removida e feita uma secção bilateral com o auxílio de uma tesoura de microdissecação (MACHADO, 1985) (Figura III-1).

Como as áreas corticais dos ratos/camundongos são geralmente menos evoluídas, menos diferenciadas e menos segregadas que o córtex cerebral de primatas, existia uma controvérsia na literatura se realmente primatas e roedores possuíam córtex frontal. A conclusão (UYLINGS et al., 2003) é que estes animais possuem um córtex frontal que pode ser definido anatomicamente e funcionalmente como córtex pré-frontal, o qual é subdividido em uma região orbital-símile e outra região que pode incluir as estruturas dorsolateral e anterior cingulado-símile.

Fonte: UYLINGS et al., 2003 Figura III-1 Representação da região anatômica no camundongo referente ao córtex pré-frontal. Nos roedores as áreas do cingulado anterior, pré-límbica e infralímbica

formam o córtex pré-frontal. PL-área cortical pré-límbica; IL- área infralímbica cortical; MO – áreas cortical orbital medial; ACV- área anterior do cingulado ventral.

Após a retirada do CPF, acompanhando a fissura sagital mediana, a camada cortical cerebral foi retirada das leptomeninges com o auxílio de uma pinça reta de microdissecação, a qual, progredindo delicada e tangencialmente aos ventrículos laterais, divulsionou o córtex em toda a sua extensão fronto-occiptal. O córtex já divulsionado foi rebatido para os lados, expondo parte do corpo estriado. O corpo estriado (CE) (Figura III-2) (caudado, putamen e núcleo accumbens) foi isolado das estruturas circunjacentes por divulsionamento com uma tesoura de microdissecação, sendo a sua retirada orientada pelo diâmetro da porção tuberosa visível desses núcleos, após o rebatimento lateral do córtex.

Terminada a dissecação, cada área (CPF e CE) foi colocada em papel alumínio sobre gelo devidamente identificada, pesada e conservada a -70 °C para uso posterior. Quando necessária a estocagem por um certo período de tempo (no máximo 6 meses a -70 °C) os tecidos foram considerados como tendo a mesma viabilidade para experimentação que os ensaiados imediatamente ou 24 h após a dissecação (BURKE & GREENBAUN, 1987).

Figura III-2 Dissecação do corpo estriado (CE).

8 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE MONOAMINAS E SEUS

METABÓLITOS COM HPLC

- Método

Para a determinação dos níveis de catecolaminas foi utilizado o equipamento de HPLC (Cromatografia líquida de alta performance). Na cromatografia líquida clássica um

adsorvente (alumina ou sílica) é empacotado em uma coluna e é eluído por um líquido ideal (fase móvel). Uma mistura para ser separada é introduzida na coluna e é carregada através da mesma por um líquido eluente. Se um composto da mistura (soluto) é adsorvido fracamente pela superfície da fase sólida estacionária, ele atravessará a coluna mais rapidamente que um outro soluto que seja mais rapidamente adsorvido. Então, a separação dos solutos é possível se existem diferenças na adsorção pelo sólido. Os detectores eletroquímicos medem a condutância do eluente, ou a corrente associada com a oxidação ou redução dos solutos. Para ser capaz de detectar no primeiro caso, os solutos devem ser iônicos e no segundo caso, os solutos devem ter a característica de serem relativamente fáceis de se oxidarem ou reduzirem. Detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou oxidação de solutos são chamados detectores amperométricos ou coulométricos. Neste estudo foi utilizado o tipo amperométrico que reage com uma quantidade muito menor de soluto, em torno de 1 %. Todas as técnicas eletroquímicas envolvem a aplicação de um potencial para um eletrodo (geralmente de carbono vítreo), oxidação da substância que está sendo estudada próximo à superfície do eletrodo seguindo a amplificação e medida da corrente produzida. As catecolaminas são oxidadas nos grupos de anel hidroxil para produzir um derivado ortoquinona com a liberação de dois elétrons.