- Identificar diferenças no processo espaço-temporal de hidrólise/formação de PIP2 e InsP3 respectivamente, entre as células PC12-wt e células PC12-NCS-1
estimuladas com carbacol (CCH).
-Verificar se os mecanismos de degradação/formação de PIP2 e InsP3
respectivamente, induzido por CCH nos dois tipos celulares são dependentes da da via de ativação muscarínica, PLC-β e ou PI4K; entrada do Ca2+ extracelular e/ou mobilização de Ca2+ de estoques intracelulares.
-Verificar alterações na dinâmica e nos níveis intracelulares de Ca2+ em células PC12-wt e PC12-NCS-1 submetidas ao estímulo com CCH.
- Comparar o padrão de liberação de glutamato entre as células PC12-wt e PC12-NCS-1 estimuladas com CCH e verificar a dependência da via de ativação muscarínica, entrada do Ca2+ extracelular e/ou mobilização do Ca2+ intracelular. Caracterizar origem da liberação de glutamato em células PC12.
Objetivos Melissa M. Guimarães
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-Verificar as possíveis diferenças no padrão de distribuição vesicular entre as células PC12-wt e PC12-NCS-1 e compará-las aos perfis de liberação de glutamato nos dois tipos celulares.
Introdução Melissa M. Guimarães
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Os íons cálcio são considerados um dos mensageiros intracelulares mais versáteis e indispensáveis para o ajuste fino da atividade celular (Berridge e Bootman, 2000; Berridge, 2006). Tais íons poderiam receber o título de “maestro orquestrador” já que exercem papel de integração de diversas vias de sinalização celular (ver ilustração abaixo). Diferentes funções celulares que são finamente controladas pelo Ca2+ incluem processos como contração/relaxamento, excitabilidade, secreção-exocitose, regulação da atividade protéica, expressão gênica, plasticidade, memória e crescimento, desenvolvimento e morte celular (Berridge e Bootman, 2000; Sabatine e cols., 2002, Augustine e cols., 2003; Gomez e Zheng, 2006).
Diferentes funções neuronais são reguladas por alterações na concentração intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i). A compreensão das vias de sinalização dependentes de
Ca2+ em neurônios não só aumenta o conhecimento de aspectos básicos da regulação neuronal, mas também possibilita o esclarecimento das anormalidades da sinalização intracelular presentes em condições patológicas.
Para que cada uma de suas funções seja garantida de maneira específica é importante notar que os sinais e [Ca2+]i são rigorosamente compartimentalizados em
microdomínios e obedecem uma grande variação temporal, indo de frações de milisegundos a horas, dias e até mesmo semanas (Sabatini e Regehr, 1996). Canais de Ca2+ dependentes de voltagem e/ou ligantes, bombas Ca2+-ATPase, trocadores Na+/Ca2+ e reservatórios intracelulares (como os retículos endoplasmático e nucleoplasmático, as mitocôndrias) compõem parte da maquinaria de controle da [Ca2+]i em condições
basais, que variam de 10-100 nM e que, em condições de estímulo atingem níveis superiores (Lohman e Wong, 2005).
Introdução Melissa M. Guimarães
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Figura 1: [Ca2+]i e o ajuste fino da atividade celular.
Controle da [Ca2+]i associado à diversidade de sinais
intracelulares. Baixos níveis intracelulares de Ca2+ são controlados por receptores ionotrópicos, canais iônicos dependentes de voltagem, canais iônicos presentes nas membranas de estoques intracelulares (retículos endoplasmático, nucleoplasmático e mitocôndia), canais iônicos regulados pelo estoque (SOC) e bombas Ca2+- ATPases presentes na membranas.
Introdução Melissa M. Guimarães
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Além dessa maquinaria de controle da dinâmica intracelular das [Ca2+]i, existe
uma outra, capaz de detectar fina e precisamente, os diferentes níveis intracelulares de Ca2+ representada pelas proteínas ligantes de Ca2+ (ver figura 1). Tais proteínas apresentam estruturas com afinidades diferentes a este íon e por isso auxiliam na compartimentalização funcional do Ca2+ livre, já que interferem com sua concentração nos diferentes microdomínios (Burgoyne e cols., 2004). Assim, o processo de tradução espaço-temporal do sinal de Ca2+ em funções específicas se deve à interação molecular desse íon com proteínas denominadas ligantes de Ca2+ (Ca2+ binding proteins ou CBP) e/ou sensoras de cálcio (Ca2+ sensor proteins).
As primeiras, conhecidas como ligantes ou quelantes do Ca2+ intracelular compreendem proteínas como caldendrina (caldendrin), calbindin, parvalbumina e CBP 2, 3, 4 e 5, (Burgoyne e cols., 2004; Schawaller e cols., 2002; Mikhaylova, 2006). Já as proteínas sensoras de Ca2+ são capazes de responder a sinais específicos de Ca2+, traduzindo esta variedade de sinais em diferentes funções neuronais (O´Callaghan e Burgoyne, 2003; Hilfiker, 2003; Burgoyne, 2007). Três características clássicas definem a propriedade peculiar destas proteínas em determinar a transdução seletiva de sinais intracelulares:
1- a afinidade a íons Ca2+; 2- a cinética;
3- a localização nos diferentes compartimentos intracelulares.
A sinaptotagmina I é um exemplo de proteína sensora de Ca2+, que responde rapidamente a altas concentrações intracelulares de Ca2+ interferindo com a liberação de neurotransmissores (Koh e Bellen, 2003). A calmodulina é conhecida como arquétipo mais estudado entre as proteínas sensoras de Ca2+, que ao ser ativada por esse íon
Introdução Melissa M. Guimarães
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controla uma série de funções neuronais, como a de liberação de mediadores, processos de potenciação de longa duração (LTP), memória sináptica e comportamental (Chin e Means, 2000; Lisman e cols., 2002).
Uma grande família de proteínas sensoras de Ca2+, presente principalmente em neurônios, é denominada “proteínas neuronais sensoras de Ca2+ ou proteínas NCS (Neuronal Ca2+ Sensor) (ver tabela I adiante). Esta família de proteínas é codificada por 14 genes no genoma humano (http://www.liv.ac.uk/physiology/ncs/index.html) e, em alguns casos, a diversidade ainda é maior, pela existência de processamento alternativo (splices variantes). Todos os grupos da família NCS apresentam quatro domínios EF- hand, um dos domínios mais descrito e que aparecem em, pelo menos, 83 tipos de proteínas sensoras de Ca2+ codificadas pelo genoma humano (Venter e cols., 2001). O domínio EF-hand consiste em uma estrutura hélice-alça-hélice (helix-loop-helix) formada por 29 aminoácidos, no qual seis destes, presentes na alça, estão envolvidos na ligação de alta afinidade para o Ca2+ (Burgoyne e Weiss, 2001). Além desta região, a maioria das proteínas NCS apresenta uma cauda miristoil formada por uma cadeia apolar de 14 carbonos adicionados, de forma pós-traducional, na porção N-terminal e que podem funcionar como verdadeiras âncoras de apoio às membranas (Zozulya e Stryer, 1992).
A recoverina foi a primeira proteína NCS a ser caracterizada. Ela é expressa especificamente em células fotossensíveis da retina e age especialmente impedindo a inativação da rodopsina regulando a transdução do estímulo luminoso em sinal elétrico (Palczewski e cols., 2000; Sallese e cols., 2000). Outros exemplos de proteínas NCS estão mostrados na tabela 1. Estas proteínas possuem afinidades em ordens submicromolares / micromolar para íons cálcio, e sofrem alterações conformacionais capazes de determinar a interação e regulação de diversas proteínas, além de alterações