Conference Paper
3rd International Mediterranean Science and Engineering Congress (IMSEC 2018)Çukurova University, Congress Center, October 24-26, 2018, Adana / TURKEY Pages: 1545-1548, Paper ID:569
1. GİRİŞ
Artan dünya nüfusu, gıdaların sürdürüleb l r tem n n (bü-yük ölçekte üret lerek uzun süre dayanıklı kalmasını) sağ-lama zorunluluğunu beraber nde get rm şt r. Bu kapsamda en kolay çözüm olarak görülen gıda raf ömrünün artırılma seçeneğ n n b r sonucu olarak, b yogüvenl ğ kuşkulu katkı maddeler yle kaçınılmaz şek lde karşılaşma r sk n berabe-r nde get berabe-rm şt berabe-r. İlaveten nüfus aberabe-rtışıyla paberabe-ralel olaberabe-rak ça-lışan sayısındak artış da beslenme alışkanlıklarının bar z şek lde değ şmes ne ve nsanların katkı maddeler çeren şlenm ş gıdalarla daha fazla beslenmes ne neden olmakta-dır. Günümüzde artan b r eğ l mle sağlıklı ve doğal gıdala-rın yer n daha prat k ve hemen ulaşılab l r, şlenm ş (hazır) gıdalar almaktadır. İşlenm ş gıdalar ne yazık k tatlandırıcı,
aroma artırıcı, koruyucu ve renklend r c g b çeş tl gıda katkı maddeler n çermekted r. Metabol k hassas yetler neden yle özell kle gebe kadınlar ve çocuklar tarafından r sk taşıyan bes n maddeler n n tüket m nde gerekl toplumsal b l nc n kazandırılması b r nc hedef olmalıdır. Gıda katkı maddeler nden r sk taşıdığı b l msel olarak saptananların bell prosedürler çerçeves nde yasaklandığı b l nmekted r. Ancak hâl hazırda hala r sk taşıdığı yönünde şüphel ver lere sah p katkıların kullanımında herhang b r kısıtlama gözlen-memekted r. Bu maddeler n b rçok b l m nsanı tarafından çeş tl uluslararası akred tasyona sah p deneylerle nsan sağ-lığına zararlı olduğu spatlanmıştır.
Katkı maddeler yönetmel ğ nde gıdaların şleme, depolama, paketleme ve dağıtımdan etk lenerek, görsel kabul ed leb
-Patent Blue V ( E131)’ n İnsan Per feral Lenfos tler nde n v tro
M kronukleus (MN) Oluşumu Üzer ne E tk ler n n Araştırılması
Mehmet Tah r Hüsunet
1*, R ma Çel k Mısırlı
2, Erman Sal h İst fl
1, Hasan Basr İla
11Çukurova Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji, Adana, Türkiye
2Kilis 7 Aralık Ünversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Kilis, Türkiye
Özet
Yaptığımız çalışmada, klastojen k ve anojen k etk (genotoks k) MN test le, s totoks k etk se nukleus bölünme indeksi (NBI) ile saptanmaya çalışılmıştır. Test maddesi 24 saatlik muamelede en yüksek konsantrasyon har ç b nukleuslu m kronukleus (BNMN) düzey nde herhang b r artışa neden olmazken, 48 saatl k PBV muameles BNMN’ler n artışında öneml derecede (50 ve 100 µg/ml dozlarda MMC kadar), etk l olmuştur. MN yüzdes ncelend ğ nde BNMN bulgularıyla korelasyon göstermektedir. PBV’n n muameleler NBI’de haf f düşüşlere neden olmakla b rl kte bu azalmaların stat st ksel olarak öneml olmadığı bulunmuştur.
Anahtar Kelimeler: Gıda Katkı Maddesi, Patent Blue V (E131), Mikronukleus Testi (MN), Nuklear Bölünme Indeksi (NBI)
Investigation of the Eff ects of Patent Blue V (E131) on Human Peripheral
Lymphocytes in In vitro Micronucleus (MN) Formation
Abstract
In our study, clastogenic and aneugenic eff ect (genotoxic) was indicated by the MN test, and the cytotoxic eff ect was determined by the nucleus division index (NDI). While the test substance did not cause any increase in binucleus micronucleus (BNMN) except for the highest concentration in 24 h treatment, 48 h PBV treatment was signi cantly (up to MMC, 50 and 100 µg/ml) eff ective in the increase of BNMNs. e percentage of MN was correlated with BNMN ndings. Although treatment of PBV caused slight decreases in NBI, it was found that these decreases were not statistically signi cant.
Keywords: Food Additives, Patent Blue V (E131), Mikronukleus Testi (MN), Nuclear Division Index (NDI)
*Corresponding authour Email: mthusunet@cu.edu.tr
3rd International Mediterranean Science and Engineering Congress (IMSEC 2018)
October 24-26, 2018, Adana / TURKEY, http://www.imsec.info
Patent Blue V ( E131)’in İnsan Periferal Lenfositlerinde in vitro Mikronukleus (MN) Oluşumu Üzerine Etkilerinin Araştırılması l rl ğ n n kötüleşmes durumunda gıdanın doğal
görünümü-nün ger kazandırılması, gıdanın görsel olarak daha caz p hale get r lmes ve renks z gıdaya renk ver lmes amacıyla renklend r c ler n gıdalarda kullanılab leceğ fade ed lm şt r. Dolayısıyla bu çalışma, gıdalarda yoğun olarak kullanılan en-düstr yel renklend r c Patent Blue V (E131)’n n genotoks k ve s totoks k etk ler n araştırmak amacıyla gerçekleşt r l-m şt r.
Tr fen lmetan a les ne üye olan Patent blue V boyası 1960’lı yıllardan ber lenfanj yograf de kullanılmaktadır [1].
Günümüzde ABD’de yasaklanan PBV, Avrupa B rl ğ nde (AB) hâlâ z nl d r: az m ktarlarda ve / veya nad ren tüke-t len gıdalarda kullanıldığı ç n tüke-toks s tüke-tes göz ardı edilebilir olarak kabul edilir. [2]. AB’de gıda katkı maddes olarak kullanılmasına z n ver len PBV b r tr ar lmetan boya maddes -d r. Şim-diye ka-dar Gı-da Katkı Ma-d-deleri Ortak FAO/WHO Uzman Kom tes (JECFA) Patent Blue V (E 131) ç n kabul ed leb l r günlük alım m ktarını (ADI) nüfusun tüm grupla-rı ç n maks mum 5 mg/kg v.a./gün olarak bel rlem şt r [3]. Ajan koyu mav ms -mor renkte sentet k kömür katranıdır. Çok yaygın kullanılmamakla beraber, İskoç yumurtası, bazı jöle tatlıları ve mav l körde kullanılmaktadır. Ajan çeş tl alerj k reaks yonlara neden olmaktadır ve çocukların tüket-mes öner lmemekted r. Ayrıca Avustralya, ABD ve Nor-veç’te de yasaklanmıştır.
2.MATERYAL VE METOD
Bu çalışma in vitro koşullarda yapılmıştır. T car olarak satın alınan Patent Blue V (E 131) (Sigma-Aldrich) test maddes olarak kullanılmıştır. Deney materyal olarak da s gara, alkol alışkanlığı olmayan ve herhang b r laç kullanmayan, yaşları b rb r ne yakın, sağlıklı ve gönüllü dört k ş den alınan hepa-r n ze ed lm ş pehepa-r fehepa-r k kan kullanılmıştıhepa-r.
2.1. M kronukleus (MN) Test ç n Hücre Kültürünün
Yapılması
M kronükleus test nde hücre kültürünün yapılması amacıy-la Rothfuss ve ark. [4] tarafından gel şt r len yöntem kulamacıy-la- kulla-nılmış olup, bazı mod f kasyonlar yapılmıştır. Donörlerden (sağlıklı ve gönüllü 4 ver c ) alınan 1/10 oranında hepar n ze ed lm ş kan örnekler 2.5 mL kromozom medyumuna ste-r l şaste-rtlaste-rda 6 damla (0.2 mL) ek lm şt ste-r [5]. Daha sonste-ra kan ek m yapılan hücre kültürü nkübatörde 37±0.5°C’de 68 saat boyunca nkübe ed lm şt r. PBV’n n genotoks k etk s n n-celemek ç n, daha önce bel rlenm ş olan konsantrasyonlar-dak (25, 50 ve 100 µg/ml) PBV kültür tüpler ne lave ed le-rek hücreler n 24 veya 48 saat boyunca muamele ed lmeler sağlanmıştır. İk nukleuslu hücre oluşumunu sağlamak ç n kültürün 44. saat nde her b r tüpe 6 μg/mL s tokalas n B la-ve ed lm şt r. Kültür süres b tt kten sonra (68. saat) kültür tüpler 2000 rpm’de 5 dk. santr füj ed lerek, süpernatant (üst faz) uzaklaştırılmıştır. D pte kalan ve hücreler çeren 0.5-0.7 mL’l k sıvı y ce karıştırıldıktan sonra ılık (37°C) h poton k çözelt den (%0.4’lük KCI) her tüpe (yaklaşık 10 mL) yavaş yavaş lave ed lerek 5 dk. süreyle 37°C nkübatörde beklet
l-m şt r. Süren n sonunda nkübatörden çıkarılan tüpler 10 dk. 1200 rpm’de santr füj ed l p hücreler çöktürülerek süperna-tant uzaklaştırılmıştır. Bu şlem n ardından her b r tüpe yak-laşık 10 mL soğuk f ksat f d kkatl b r şek lde (damla dam-la) yavaşça ve karıştırarak lave ed lm şt r. B r nc f ksat f; 1 hac m aset k as t 5 hac m met l alkol karışımının 1/1 ora-nında % 0.9 NaCl le seyrelt lmes yle hazırlanmıştır. B r nc f ksat f eklend kten sonra hücreler oda sıcaklığında 15 dk. bu f ksat e muamele ed lerek süre sonunda 1200 rpm’de 10 dk. santr füj ed lm ş ve süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra tüplere b r nc f ksat ften farklı k nc f ksat f (1 hac m ase-t k as ase-t 5 hac m mease-t l alkol) lave ed lerek f ksasyon şlem
k defa aynı şek lde tekrarlanmıştır. Her f ksat f laves nden sonra hücreler santr füj ed lerek üsttek sıvı atılmıştır. Son santr füjden sonra d pte 0.5-0.7 mL sıvı kalacak şek lde sü-pernatant atıldıktan sonra her b r tüpün d b nde toplanmış olan hücreler preparatları hazırlamak üzere resüspanse ed l-m şt r. Daha sonra hücre süspans yonu buzdolabında bekle-t len soğuk ve bekle-tem z lamlar üzer ne 10-20 cm yüksekl kbekle-ten damlatılarak preparatlar hazırlanmıştır.
2.2. Mikroskobik İnceleme
Preparatlar ncelen rken hazırlanan her b r preparattan 1000 adet k nukleuslu hücre olacak şek lde (4 k ş den toplam 4000 b nukleer) hücre ncelenm ş ve bunlardan m kronuk-leuslu hücreler bel rlenm şt r. M kronukkronuk-leuslu b nukleer hücre sayısı ncelenen toplam b nukleer (1000 adet) hücre sayısına oranlanarak m kronukleuslu b nukleer hücre yüz-des bulunmuştur. Ayrıca hazırlanan her b r preparattan 1000 adet hücre sayılarak, bu hücreler arasından b r, k , üç ve dört nukleuslu olan hücreler n sayıları tesp t ed lm şt r. Bu oran esas alınarak Nukleus Bölünme Indeks (NBI) he-saplanmıştır [6]. NBI hesaplanırken şlemler aşağıdak for-müle göre yapılmıştır;
NBI= (1xN1 + 2xN2 + 3xN3 + 4xN4) / N N1: B r nukleuslu hücre sayısı
N2: İk nukleuslu hücre sayısı N3: Üç nukleuslu hücre sayısı N4: Dört nukleuslu hücre sayısı N: Sayılan toplam hücre
3. BULGULAR VE TARTIŞMA
Yaptığımız çalışmada, kalstojen k ve anojen k (genotoks k) MN test le bel rt l rken, nukleus bölünme ndeks (s totok-s k etk ) NBI le totok-saptanmaya çalışılmıştır. Tetotok-st maddetotok-s 24 saatl k muamelede 100 µg/mL konsantrasyon (P<0.05) ha-r ç BNMN düzey nde heha-rhang b ha-r aha-rtışa neden olmazken, 48 saatl k PBV muameles BNMN’ler n artışında öneml derecede (50 ve 100 µg/mL MMC kadar,) etk l olmuştur. MN yüzdes ncelend ğ nde BNMN değerler yle örtüştüğü gözlenm şt r. Bu parametreye göre 24 saatl k muamelede en yüksek doz ((100 µg/mL) kontrole göre öneml derecede (P<0.05) artırmıştır. Aynı zamanda 48 saatl k muamelen n tüm dozları MN yüzdes n kontrole göre öneml derece
ar-3rd International Mediterranean Science and Engineering Congress (IMSEC 2018)
October 24-26, 2018, Adana / TURKEY, http://www.imsec.info
.
tırmıştır (50 ve 100 µg/ml, P<0.001). PBV’n n NBI’de her-hang b r değ ş kl ğe neden olmadığı tesp t ed lm şt r. Bu da PBV’n n genotoks k olduğu ancak s totoks k olmadığını göstermekted r.
Tablo 2. Türk Gıda Kodeks n n bel rled ğ ürünler ve PBV kullanım m ktarı
E 131 Patent blue V (PBV)* M ktar
Alkolsüz aromalı İçecekler 100 mg/l
Meyve ve sebze şekerlemeler 200 mg/kg
Korunmuş kırmızı meyveler 200 mg/kg
Şekerlemeler 300 mg/kg
Süsleme ve kaplama maddeler 500 mg/kg
Haf f fırıncılık ürünler 200 mg/kg
Yen leb l r buzlar 150 mg/kg
Aromalandırılmış işlenmiş peynir 100 mg/kg
Aromalandırılmış süt ürünleri dah l tatlılar 150 mg/kg
Soslar .baharatlar 500 mg/kg
Hardal 300 mg/kg
Balıkların ve kabuklu su ürünler n n ve yumuşakçaların
ezmeler 100 mg/kg
Ön pişirme yapılmış kabuklu su ürünleri, yumuşakçalar 250 mg/kg
Somon balığı benzerler 500 mg/kg
Sur m 500 mg/kg
Balık yumurtası 300 mg/kg
Füme balık 100 mg/kg
Kuru patates , hububat veya n şasta bazlı çerezler
-Patlamış veya hac mlend r lm ş çerezler 200 mg/kg
-D ğer çerezler 100 mg/kg
Peyn rler n yen leb len kabukları ve kılıfl arı GMP(QS) K lo kontrolü amaçlı komple formüller 50 mg/kg Tıbb kontrol altında kullanılan komple formüller ve ek
gıdalar 50 mg/kg
Ek sıvı gıdalar,d yet tamamlayıcılar 100 mg/l Ek katı gıdalar .d yet tamamlayıcılar 300 mg/kg
Çorbalar 50 mg/kg
B tk sel prote n bazlı et ve balık analoglan 100 mg/kg Alkollü çecekler (B ra .v sk har ç.) 200 mg/l
Meyve şarapları (durgun ve köpüren ) 200 mg/l
*T.C. Resmi Gazete, Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği [8]
PBV ile yapılan diğer çalışmalar incelendiğinde, tıbbi görüntüme amacıyla kullanılan PBV’nin potansiyel olarak genel popülasyonu alerjik duyarlılaşma riskine maruz bırak-tığı tespit edilmiştir. PBV boyası enjeksiyonundan sonraki yan etkiler, derece I (ürtiker (kurdeşen), kaşıntı veya genel döküntü), derece II (geçici hipotansiyon / bronkospazm /
laringospazm), derece III (vazopressör desteği gerektiren ciddi hipotansiyon ve / veya planlanan prosedürün değiştir-ilmesi / terk eddeğiştir-ilmesi) olarak tanımlanmıştır (Barthelmes ve ark. 2010).
PBV’nin de dâhil olduğu mavi boyalarla birlikte lenfatik haritalama ve sentinel lenf nodu biyopsisi, meme kanseri ve diğer malign tümörleri olan hastaların evrelemesinde rutin olarak kullanılmaktadır [7].
PBV kullanımı gen ş alanlara yayılmaktadır. PBV’n n toks s -tes de, genotoks k veya ekotoks k özell kler serg leyen d ğer boyalar g b çevresel sorunlardan b r d r (Des mon ve ark. 2005).
B rçok çalışmada PBV’n n toks k, alerj k, çevresel veya sağ-lık sorunlarına neden olduğu rapor ed lm şt r. Bu yönüyle yaptığımız çalışmanın sonuçları d ğer çalışmalar le para-lell k göstermekted r. Gıda katkı maddes olarak kullanılan PBV’n n kullanımı ülkem zde yasaklanmamıştır.
4. SONUÇ
Yaptığımız çalışma sonucunda PBV’n n n v tro nsan pere -feral lenfos tler nde MN oluşumu ve k nukleuslu MN çeren hücre yüzdes n kontrole göre zamana ve doza bağlı olarak öneml derecede artırdığı tesp t ed lm şt r. PBV’n n nuklear bölünme ndeks n değ şt rmed ğ görülmüştür. Bu sonuçlar değerlend r ld ğ nde PBV’n n genotoks k olduğu ancak s to-toks k olmadığı sonucuna varılmıştır. Çalışma sonuçlarımız ve l teratürdek d ğer çalışmalar göz önüne alındığında daha fazla ve özell kle de n v vo çalışmaların sonuçları d kkate alı-narak karar merc ler tarafından PBV’n n gıda katı maddes olarak kullanımına a t durumun tekrar değerlend rmes n n uygun olacağı kanaat ndey z.
5. TEŞEKKÜR BÖLÜMÜ
Çalışmamız Çukurova Ün vers tes B l msel Araştırma Pro-jeler B r m tarafından FBA-2017-8378’nolu proje kapsa-mında desteklenm şt r.
REFERANSLAR
[1] Barthelmes, L., Goyal, A., Newcombe, R.G., Mcne ll, F., Mansel, R.E. (2010) “Adverse react ons to patent blue V dye - e NEW START
Tablo 1. PBV le 24 ve 48 saat muamele ed len nsan per feral lenfos tler nde m kronukleuslu b nuklear (MNBN) hücre yüzdes , m kronukleus (MN) yüzde-s ve nukleuyüzde-s bölünme ndekyüzde-s (NBI)
Test maddes
Muamele MN çeren
k nukleuslu
hücre %’si MN %’s
Nukleus sayısına göre hücreler n
dağılımı NBI±SH Süre (saat) (µg/mL)Kons. Kontrol - - 0,01±0,01 0,02±0,02 2841 698 286 175 1,44±0,07 MMC 24 0.25 0,58±0,06 1,35±0,11 3000 742 134 124 1,34±0,05 PBV 24 25 50 100 0,10±0,04 b3 0,08±0,02 b3 0,20±0,03 a1b3 0,15±0,05 b3 0,20±0,05 b3 0,47±0,07 a1b3 3207 625 120 48 1,25±0,08 1,34±0,09 1,35±0,03 2982 750 171 97 3021 672 192 115 MMC 48 0.25 1,41±0,10 3,15±0,23 3499 405 69 27 1,15±0,01 PBV 48 25 50 100 0,30±0,04 a2b2 0,53±0,07 a3 0,70±0,10 a3 0,62±0,07 a2b2 1,12±0,14 a3 1,42±0,20 a3 2952 799 157 92 1,34±0,08 1,28±0,07 1,25±0,06 3114 681 137 68 3249 551 124 76
*: Toplam 4000 adet binükleer interfaz değerlendirilmiştir.
3rd International Mediterranean Science and Engineering Congress (IMSEC 2018)
October 24-26, 2018, Adana / TURKEY, http://www.imsec.info
Patent Blue V ( E131)’in İnsan Periferal Lenfositlerinde in vitro Mikronukleus (MN) Oluşumu Üzerine Etkilerinin Araştırılması and ALMANAC exper ence”. European Journal of Surg cal
Onco-logy, WB Saunders, 2010, 36 (4), pp.399.
[2] Des mon E., Brunett B. And Vos o M.C. (2006) “Determ nat on of Patent Blue V (E131) at a Naf on-Mod f ed Glassy Carbon Electrode “. Electroanalys s 18, No. 3, 231 – 235.
[3] Add t ves, E. P. o. F. and Nutr ent Sources added to, F. (2013) “Sc en-t f c Op n on on en-the re-evaluaen-t on of Paen-tenen-t Blue V (E 131) as a food add t ve”, EFSA Journal, 11(3), 2818-n/a.
[4] Rothfuss, A., Schutz, P., Bochum, S., Volm, T., Elberhard, E., Kreınberg, R., Vogel, V. And Speıt, G., (2000) “Induced m cronucleus frequen-c es n per pheral lymphofrequen-cytes as a sfrequen-creen ng test for frequen-carr es of a BRCA1 mutat on n breast cancer fam l es”, Cancer Res., 60:390-394. [5] Rencüzoğullar , E. And Topaktaş, M. (1991) “ e relat onsh p
between quant t es of bromodeoxyur d ne and human per pheral blood w th determ nat on of the best d ff erent al sta n ng of s ster chromat ds us ng Chromosome Med um-B”, Fen ve Mühend sl k B l mler Derg s , 5(3): 19-24.
[6] Fenech, M., (2000) “ e n v tro M cronucleus Techn que”, Mutat. Res., 455:81-95.
[7] Andreas J., B rcher, M.D. (2006), “Blue dyes n med c ne – a confu-s ng term nology”, Contact Dermat t confu-s 2006: 54: 231–232.
