A. O. Veteriner Fakültesi Biyokimya Kürsüsü Doç. Dr. E/hem Ersoy
NORMAL VE MUSCULAER DYSTROPIllE'Lİ
OGLAKLARıN KAN SERUMLARıNDA GLUTAMİK
OKZALASETİK TRANSAMİNAZ (GOT)
YÖNüNDEN ARAŞTffiMALAR
Ethenı Ersoy* Giriş
Kanda düşük konsantrasyonda çok sayıda enzim bulunur. Bu
enzimIerin konsantrasyonlarının artması bazı organ ve dokularda Patolojik değişikliklere bir işarettir. Klinik biyokimyasal teşhisIerde bu husustan faydalanılmaktadır (8). Kanda bulunan enzimlerden birisi Glutamik Okzalasetik transaminazdır. Genel olarak transa-minazlar amino gruplarının bir o( - aminokarbon asidinden bir
0(-ketokarbon asidine geçmesini sağlayan enzimlerdir. Koenzim olarak piridoksal fosfat'a ihtiyaç gösterirler (7). SGO-T aşağıdaki reaksiyonu reverzibl olarak katalize eder (I ı).
COOH COOH COOH CO OH
i
i
i
i
CHı CO CHı CHıi
i
i
ı
CHı+
CHı --+ H-C-NHı+
CHıH-f-NH,
i
i
600H COOH COOH COOHGlutamik asit Okzalasetik Aspartik asit O(-Ketoglutarik
asit asit
Blincoe ve Marble (3) ın bildirdiklerine göre, Kuttler ve arkaş-Iarı, SGO- T konsantrasyonu yükselmesini Musculaer Dystrophie'nin teşhisinde kullanmışlardır. Cornelius ve Kaneko (6) nın bildirdiklerine göre iskelet kasının, kalp kasırun, karaciğer paranchyma'sının
Oğlaklann Kan Seruınlannda Glutamik Okzalasetik Transaminaz 205
jik durumu çok miktarda SGO- T ın kana sızmasını müsaade eder. Comelius (5) köpeklerde, kedilerde, atlarda, sığırlarda, danalarda, domuzlarda ve tavuklarda normal SGO-T kıymetlerini, Kuttler ve
Marble (9) nQrmal ve Musculaer Dysrophie'li kuzularda SGO-T
kıymetlerini bildirmişlerdir. Fakat literatürde ne normal ve nede Mus-culaer Dystrophie'li oğlaklarda SGO- T değerlerine ait bir kayda raslayamadık. Tustin (I 3) bir Ankara keçisinde Musculaer Dystrop-hie'ye raslandığını bildirmi~se de bunun SGO- T durumuna değin-memiştir.
Grün ve arkadaşlarının (7) bildirdiklerine göre Lettow köpekler-de, Gürtler ve Richter atIarda ve sığırlarda yaptıkları araştırmalarda SGO-T aktivitesinin hayvanlarda yaşa ve cinsiyete bağlı olmadığını tespi t etmişlerdir.
Bu araştırmayı yapmaktan maksadımız memleketimiz
oğlak-larında mevcudiyeti ilk defa Baran (I) tarafından i96i yılında tespi t edilmiş olan ve önemli ekonomik kayıba sebep olan Musculaer Dys-trophie'de SGO- T kıymetlerini tespit etmek ve bundan hastalı~ın tqhisi ve tedavisinin takibi bakımından faydalanılıp faydalanılama-yacağını incelemektir.
Materyal ve Metot
Ara~tırmamızda kullandığımız Musculaer Dystrophie'li 7 oğlak Çankırı'nın- Mekiören köyünden, Lo normaloğlak ise Lalahan Zootek-ni Araştırma Enstitüsünden sağlanmıştır. Gerek normal, gerekse hasta oğlaklar ı-2 aylık idiler. Hasta oğlakların gösterdikleri klinik semptomlar Muth'un (ıo) Musculaer Dystrophie'li kuzular için, Baran (I) ın Musculaer Dystrophie'li oğlaklar için tarif ettiklerine uymakta idi. Kan, hayvanların V.
J
ugularislerinden alınmış, hemolize olmamasına dikkat edilmiş, pıhtılaştıktan sonra serum santrifüj tübüne aktarılıp santrifüj e edilerek seruma karışmış az sayıdaki eritrositler dibe çöktürüldükten sonra üstteki berrak serum buz dolabında (+ 40C de) i gece muhafaza edilmiş ve ertesi sabah SGO-T tayini yapılmıştır.Grün ve arkadaşları (7) hindi, tavuk, kaz ve ördek serumlarında yaptıkları araştırmada gerek buz dala bında (+ 5oc), gerekse oda ısısında (I 8-20°C) 5 gün bekletilen serumların SGO- T kıymetleri bakımından hiç bir değişiklik göstermediklerini bildirmektedirler.
SGO- T tayininde Cabaud ve arkadaşlarının (4) tarif ettikleri kolorimetrik metodun modifiye şekli kullanılmıştır. Bu metotta
tam-206 Ethcm Erso)'
pone edilmi~ aspartik-ketoglutarik substrat kan s~rumu ile ..inkube
edi1ir. Aspartik asidin enzimatik dezaminasyonu ıle te~e~~ul ed?n
okzalasetik asit piruvik aside çevrilir. Piruvik asit .de
2:~-dını~rofenıl-hidrazin ile muamele edilerek bir hidrazon te~kıl edılır. Hıdrazon
toluen ile ekstrakte edildikten sonra alkolik potasyum hidroksitle
muamele edilir; teşekkül eden renk 49° mfl. da spektrofotometre veya
kolorimetredeO ölçülür (I 2).
ı- Aspartik-Ketoglutarik Asit ~yıracı.
2.66 gr. dl-aspartik asit, 2 gr. Potasyum monobazik fosfat, ve 0.6
gr. tX- ketoglutarik asit 100 cc. distile suda critiidi ve ı N Potasyum
hidroksit ile pH sı 7.4 yapıldı. Bu eriyik 3 haftada bir taze
hazırlan-malıdır.
2--
%
ı00 Triklorasetik asit.100 gr. triklorasetik asit distile suda critiidi ve ı 00 cc.'e
tamam-landı.
3- Anitin sitrat.
5 cc. distile suda 5 gr. sitrik asit eritildi, üzerine 5 cc. anilin ila.ve
edildi. Bu eriyik renklenince atılmalıdır.
4-- DinitroJenilhidra;;;in.
ıoo mg. 2,4-dinitrofenilhidrazin 20 cc. konsantre klorhidrik
asitte eritildi ve üzerine 80 cc. distile su ilave edildi.
5- Toluen
6-
%
2,5 alkolik Potasyum hidroksit.i2.50 gr. Potasyum hidroksit 500 cc.
%
95'lik etil alkoldeeritile-rek hazırlandı. Yapılışı:
Muayene edilecek serumların her birisinden, 0,5 cc. alındı ve
cam kapaklı, konik birer santrifüj tübüne kondu. Bir diğer santrifüj
tübüne 0.5 cc. distile su kondu. İçerisine su konulan tüp blank vazifesi
gördü. Ba~lama saatinde tüplerin hepsine 0,5 cc.
Aspartik-Ketog-lutarik asit ayıracı ilave edildi. Hemen bunu takiben içerisine distile
su konulmu~ olan tübe ı damla triklorasetik asit ile i damla anilin
sitrat ilave edildi. Çalkandı ve oda ısısında durmaya bırakıldı.
İçe-risine serum konulmuş tüplere başlama saatinden 20 dakika sonra.
birer damla triklorasetik asit ile birer damla anilin sitrat ilave edildi.
Çalkandı ve en az 20 dakika durmaya terkedildi sonra her bir tü be
Oğlaklann Kan Serumlarında Glutamik Okzalasctik Transaminaz 207
durmaya terkedildi (bu süre 4,5 dakikadan az, 5,5 dakikadan fazla olmamalıdır.) Tüplerin her birisine 2 cc. toluen ilave edildi ve kuvvet-lice çalkandı. Takriben 5 dakika santrifüj c edildi. Santrifüj tüplerinin her birisinin üst kısmındaki berrak sıvıdan i cc. alındı ve birer kolori-metre tübüne kondu. Üzerlerine 7 cc. Potasyum hidroksit ilave edildi. Lumetron Model 40i-A da 49° m y. da blank' e karşı
%)
transmisyon-lan okundu. Okunan transmisyon kıymetlerinden kalibrasyon kur-vesi yardımiyle beher cc. serumdaki SGO- T ünitesi (y piruvik asit kıymeti) okundu. i y piruvik asit i Cabaud ünitesi serum glutamik okzalasetik transaminaz aktivitesine denktir.K alibrasyon' un yapılışı:
Hassas olarak i gr. piruvik asit taTtıldı. Bir litre distile suda eri-tildi. Bu suretle piruvik asidin
%
100 mg.lik standard eriyiği hazır-landı. 7 deney tübü alındı. Her birisine sıra ile 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, ve 5.0 cc. standard piruvik asit çözeltisi kondu. Her birisine sıra ile 9.8, 9.5, 9.0, 8.0, 7.0,6.0 ve 5.0 cc. distilc su ilave edildi. Bu suretle cc. de 20, 50, 100, 200, 300, 400 ve 500y piruvik asit çözeltileri elde edildi. Bu 7 tübün her birinden alınan 0,5 cc. diğer 7 deney tübüne kondu. Üzerine 0,5 cc. su ilave edildi. Sıfır konsantrasyon olarak (blank) kullanılmak üzere 8. deney tübünc i cc. distile su kondu. Başlama saatinde deney tüplerinin 8'ine de 0,5 cc. aspartik-Ketog-lutarik asit ilave edildi. Hemen bunu takriben yalınız blank ihtiva eden 8. tübe i damla triklorasetik asit ile i damla anilin sitrat kondu. Başlangıç saatından itibaren 20 dakikanın hemen bitiminde diğer 7 tüpten her birisine i damla triklorasetik asit ilc i damla anilin sitrat ilave edildi. Çalkandı ve asgarı 20 dakika durmaya terkedildi. 8 tübün her birisine 0,5 cc. dinitrofenilhidrazin ilave edildi. Çalkandı ve takriben 5 dakika bekletildi. (4,5 dakikadan az, 5,5 dakikadan fazla olmayacak). Üzerlerine 2 CC. toluen kondu. Kuvvetle çalkandı ve takriben 5 dakika santrifüje edildi. Her tüpten i cc. berrak üst sıvı ayrı ayrı kolorimetre tüplerine kondu. Üzerlerine 7 cc. potasyum hidroksit ilave edilip karıştırıldı. Lumetron Model 40ı-A da 490rn[L. da blank'e karşı numunelerin
%
transmisyonları akundu. Bunun için alet blank ile önce%
i00 transmisyona ayarlandı. Sonra diğer7 tübün transmisyonları okundu.
Lumentron Semi-Iog grafik kağıdında cc.de 0--500y piruvik aside karşı gelen transmisyonlar işaretlendi. Sonra bu noktalardan diğer kenara çizilen parelel çizgilerin kesiştikleri yerler noktalarndı. Bu noktaların aralan birleştirilmek suretiyle düz bir kurve elde edildi. Bu kurve yardımiyle her bir numune için okunan transmisyonların karşıtları olan SGO-T üniteleri grafik kağıdından okunmuştur.
208 Et.hem Ersoy
Sonuç
Lo Normal, 7 Musculacr Dystrophie'li oğlaktan elde ettiğimiz
SGO-T kıymetleri i CC. serumda Cabaud ünitesi olarak, aşağıda
cetvel halinde gösterilmiştir:
Cetvel: i NormalOğlaklarda SGO- T 1051 80
i
75 i 1001 Boi
1081 95i
1181 80i
85 75 - 118 92•6 :::::4.64 SGO-T Hudutlar Ortalama Hayvanıni
6 8i
lA sıra i 2 3 4 5 7 9 numarası ii
Cetvel: 2M usculaer Dystrophie'li Oğlaklarda SGO- T
405
i
495i
444i
230i
415 155i
300 155 - 495 349 :i: 41 .64 SGO-T Hudutlar Ortalama Hayvanıni
i
i
6 sıra i 2 4 4 5 7 numarasıi
i
i
TartışmaLiteratürde köpek, kedi, sığır, dana, domuz tavuk (5), ve kuzu-larda (9) SGO- T kıymetlerine raslandığı halde, oğlaklarda veya keçilerde transimanaz kıymeti hakkında bir yayın bulunamamıştır. Bu sebepten hasta oğlaklardan elde ettiğimiz kıymetleri ancak
kontrololarak kullandığımız normaloğlaklardan alınan
sonuç-larla mukayese etmek mümkün olmuştur. Hasta oğlaklarda SGO- T kıymetlerinin i cc. serumda 75 ile i i8 ünite arasında değiştiği ve ortalama kıymetin 92.6 :1:4.64 ünite olduğu, normaloğlaklarda ise i cc. serumdaki SGO- T değerlerinin i55 ile 495 üni tc arasında değiş-tiği vc ortalama kıymetin 349 :i: 41.64 olduğu tesbit edilmiştir. Bu rakamlar gösteriyor ki normal ve Musculacr Dystrophie'li oğlakların SGO- T kıymetlerinin gerek maksimal ve minimal hudutları, gerekse ortalama kıymetleri arasında önemli derecede fark vardır. Bu husus ayrıca istatistik metotlariylc dc teyid edilmiştir (2).
Oğlaklann Kan Serumlarınua Cll1ıamik Obalaseıik Transarnİnaz 209
Musculaer Dystroplıie'li hayvanlarda iskelet kasıarında ve kalp kasında bozukluklara raslanır. Kaslarda Zenker dejenerasyonu uzun zamandanberi tanınan genel bir semptomdur (10). Araştırmamızda hasta oğlaklarda yüksek SGO- T kıymetleri bulmamızın, Comelius ve Kanekonun (6) da belirttikleri üzere iskelet ve kalp kasında vukua gelen bozukluklar neticesi kana çok miktarda SGO- T geçmesinin bir neticesi olduğu ve SGO- T tayininin oğlaklarda Musculaer Dys-trophie'nin teşhisinde çok faydalı olduğu kanısındayız.
Özet
ıo Normaloğlak ile 7 Musculaer Dystrophie'li oğlakta Cabaud ve arkada~larının (4) modifiye edilmiş kolorimetrik metodu ile SGO-T ak-tivitesi tayin edilmiştir. ~ormallerde i cc. serumda GO- T aktivitesinin 75-118 ünite arasında değiştiği, ortalama kıymetin 92,6 ::l: 4.64 olduğu, Musculaer Dystrophie'li oğlaklarda ise yine ayın miktar serumda GO-T aktivitesinin 155-495 ünite arasında değiştiği orta-lama kıymetin 349:l: 41,64 olduğu tespit edilmiştir.
Z u s a m m e n fa s s u n g
Untersuchungen über die
Serum-Glutaminsaure-Oxales-sigsaure- Transaminase (SGO-T) von normalen und
muskular dystrophieschen Ziegenlammchen
Mit der modifizierten Methode von Cabaud et al (4) wurde die
SGOT von io normalen und 7 muskular dystrophieschen
Ziegen-lammchen bestimmt. Die SGOT-Werte von normalen
ZiegenHimm-chen schwankten zwischen 75 und 118 Cabaud-EjmL. und der Mit-telwert war 92, 6 +4.64 Cabaud-E.jmI. Die Schwankungsbreite der
SGOT -Werte von muskular dystrophischen Ziegenlammchen war
155-495 Cabaud-Ejml und der durchschnittliche SGOT-Gehalt
war 349 :l: 41.64 Cabaud-E jmI.
Literatür
1- Baran, S. (1966): Oğlaklarda Musculaer Dystroplzie ve Selenyum,
Vitamin E ve C'nin Rolü. A,Ü. Vet. Fak. Derg. XIII. 135-156.
2- Batu, S., Arıtürk, E. ve Kutsal, A. (I 957): Biometrik
210 Ethem Er.oy
3- Blincoe, C. and Marble, W. D. (I 960): Blood En;:yme Inter-relationships in White Muscle Disease. Am. J. V ct. Res. '2i, 84, 866-869'
4- Cabaud, P., Leeper, R. and Wroblewski, F. (1956): Am.J. Clin.Pat. '26, 1101-1105. (alınmıştır: Reference book clinical Tests. photovalt Corporation, 115 Broadway. New York. ıo, N.Y.
5- Cornelius, E. C. (I 960): Serum Transaminases in Veterinary Diag-nostics. California veterinarian 13, '23-'24.
6- Cornelius, E., C. and Kaneko,
J. J.
(1963): Clinical Bioche-mistry of Domestic Animals. '284. Academic Press. ~ew York and London.7-- Grün, E., Gürder, H. and Kolb, E. (I 96 i ): Glutamic oxalacetic
Transaminase in Serum and Wlıole Blood of Fowl, Goose and Duck.
Arch. exp. vet. Med. 15, 1'259-1'273.
8- Harvey, G. D. (1963): Biochemistry for Veyerinary Students. 96.
Blackwell Scientific publications Oxford.
9- Kutder, L. K. and Marble, W. D. (1958): Relationship of Se-rum Transaminase to Naturally Occuring and Artiji"ally Induced White Muscle Disease. Am.J.Vet.Res. 19, 7'2, 63'2-636.
10- Muth, H. O. (1960): Recent Findings Conceming the Cause of Muscle Disease. Western Veterinarian. VII. 69-75.
11- Oser. L. B. (1965): Hawk's physiological Chemistry 14. ed. 64'2.
The Blakiston Division McGra\v-Hill Book Company l'/ew
York, Toronto. Sydney, London.
1'2- Swingle, F. K., Young, S., Dandg, C. H. (1959): The Rela-tionship of Serum Glutamic Oxalacetic Transaminase to Nunitional Muscular Dystroph)' in Lambs. Am. J. Vet. Res. XX, 74, 75-77. 13- Tustin, R. G. (I 960): White Muscle Disease in Angora Goot.
J
.S.Afr.Vet.Med.Ass. 31, 469.
