Ankara Üni" Vet Fak Derg, 48, 201-205,2001
Sığırlarda follikül büyüklüğünün oositlerin in vitro maturasyonu
üzerine etkisi
Şükrü KÜPLÜLÜ,
Mustafa
ÜN
Ankara Üniversitesi. Veteriner Fakiiltesi. Doğum ve linekoloji Anabilim Dalı. Ankara
Özet: Sunulan çalışmanın amacı. iıı viıro maLurasyonda kullanılacak sığır oosiLlerinin aspire edildikleri folliktillcrın btiytiklıiklcrınin, oosiLlerin maLııra.syon kapasiLesi tizerine eLkisinin araşLırılmasıdır. Oosit kaynağı olarak mCl.bah;ldan toplanan Loplam 30() sığır ovaryuınu kullanıldı. Ovaryum üzerindekı folliküller sayıldı ve hüyüklüklerine göre (Grup
ı.
1-3 mın: Grup IL. 3-6 mm ve Grupııı.
6-1(J ınm) gflıplandırıldı. rollikiillerin punksiyoıııı yapıldı ve aspire edilen oosİtler stereoııııkroskop allında morfolojik dUfllııılarına göre incelenip sınıflandırıldı. Yalnızca etrafları dört veya daha fazla eumulus hiiere katımmı ıle çevrıli ve kumlu bir oophızma görüntüsü veren oositler maıurasyon vasatlarına (TCM-199 +% iO ECS) aktarıldı. Maııırasyon külıiirti 39°C'de,°+5
CO: gaz aLmosferinde 24 saaL süreyle yapıldı. Maııırasyon sonunda oosiıler mikroskop altında ineelendi ve birinci kULUPhiıc-resilöi alan ınallı re oosiı sayıları kaydedildi. Çalışma gruplarında (Grup i. ii ve III) elde edilen maııırasyon yüzeleleri sırasıyla: %6ı.
°le76 ve 'h..74 olarak hulundu. Sonuç olarak, follikül büyükliiğünün, sığır oosiılerinin iııviıro maturasyon haşarısını belirgin iilçtide CL
kiledıği ve follikül büytikliiğü arttıkça maLurasy~n başarısının yükseldiği kanaaLine varıldı. Anahtar kelimeler: Follikiil hiiyükliiğü, in viıro nıaturasyon, mezbaha. oosit. sığır
The effecls of fo ilieie diameter
on the in vi/ro maturation
of bovine oocytes
Summııry: The aim of ıhıs sttıdy was Lo invesLigate the effeets of the follide diaıneter on ıhe ıııalllralıon cdpaclLy ol' ıhe hovınc oacyLe,;iııviıro. A total of 300 ovaries colleeıed from the slaughterhouse were used for ooeyLe aspiration. Follicles werc couıııed and groupped according to the diameter: Group i (1-3 mm), Group ii (3-6 mm) and Group III (6-
ı()
mııı). Follieles were pııncLured and aspiraıed oocytes were examined under stereomicroscope for Lheir morphological .staLus and selection. Only the oocyLcs sunoııııded with four or more cumulııs cell layers and sandy ooplasm were Lransferred LoLhe malliraLion medilim (TCM-199 + I()ok ECS). eUILure was conducLed at 39°C, wiıh 5°;', CO: gas aLmosphere for 24 h. In Lhe end of Lhe m;ıturaıion period oocyLcs werc exaıııincd under microscope and maturaLian raLes were recorded as Lhe vision of Lhe firsL polar hody. MaLuraıiolı rates raund LLLthe study groups (Group
ı.
II and III) were 61 %. 76% and 74%, respeeLively. As a result. it \Vas evidenL LhdLıhc follıele dıamcıer hıghly ınflııenccd Lhe malllraLiolı raLes of Lhe havine oocyLes, since Lhe folliele diameLer increased, maLuraLian raıe \\oas advaneed.Key worc..s: Bovıne. follicle diaıııeler. iııviıro ıııaıııration. ooeyte. slaughterhouse
Giriş
In virro embriyo üretimi çalışmalarında, önceleri tlushing yönıcmi ile toplanan in vivo mature olmuş
00-siLler kullanılırken (I). bu yönLem ile elde edilen oosit sa-yısının sınırlı kalması nedeniyle daha. büyük bir kaynak olan immalure oosiılerden faydalanılma fikri ortaya atıl-mıştır (9). İnıfılature oosiıler uIırasonografi rehberliğinde transvaginaI v':; laparoıomi-endoskopi yönıemi ile canlı hayvanların ovaryumlarındaki yüzeysel foIliküllerden as-pire edilebilirken (IO), anılan her iki leknikte de pahalı ekipmanların kullanılması. deneyim gerekıirmesi ve sı-nırlı bir kaynak olması nedeniyle son yıllarda mezhahada kesilen sığırların ovaryumları oosiı kaynağı olarak kul-lanılmaya başlanmıştır (9, i5.20).
İmmature oosiıler fertilizasyon yeteneği olmayan, çekirdeğinde diploid sayıda (2n) kromozam taşıyan
00-sitler olup, fenilize olabilmeleri için bir malurasyon pe-riyodu geçirmeleri gerekmektedir. Oositlerin maturasyo-nu, kromozom sayılarını yarıya indirecek (n=60) iki mayoz höllinme (çekirdek maıurasyonu) ve bölünme
son-rası dönemde ihıiyacı olan enerjinin üreıimi için organel reorganizasyonunu (sitoplazma malurasyonu)
içerınekte-dir (15,18).
Herhangi bir zamanda ovaryumdaki preantral vc ant-ral folliküllerden aspire edilen bir oosit birinci mayol. bö-lünmenin profaz iaşamasında LH dalgasını beklemektc-dir (6). Lüteinleşıirici hormon dalgasından 4-X saal sonra gemlİnal vezikül yıkımlanır ve nukleus memhranı kay-halurken kromozom dekondenzasyonu şekillenir (6.JX.20) Oosit sırasıyla melafaz-I, anafaz-I ve telofaz-I aşamalarını geçirerek, hirinci kuıup hücresini aıarak oosil-II adını alır (6,18). Bu aşamada ovulasyonla alılan oosi!. bir sper-matozoidin zona pellucida'ya tulunması ilc ikinci kullıp hücresini atar ve ovum adını alarak çekirdek matur:ısyo-nunu ıamamlar (I 8,2 I).
Sitoplazma malUfasyonu sırasında önce granülsüı endoplazmik retikulum granüllü hale geçer, daha sonra ri-bozomlar sayıca artar ve ooplazmanın periferine doğru harekeı ederek kümeler oluştururlar (6). Bu süreçıe oop-lazma içerisindeki mRNA ve ıRNA aktiviıeleri artar (15).
---202 Ştikrti Küpitilii - Mustafa Cn
Sitnplazma matmasyonu LH dalgasını izleyen 1-2. saatte ha~lar ve Oüsitin fekondasyonundan sonra da devam eder
(21 ).
Sığır oositlerinin iıı vitm maturasyonu. in vivo
ma-tmasyonun daha hızlı seyreden bir taklitidir (9). Thomp-son (I 9). oositlerin aspire edildikleri folliküllerin bü-yüklüklerinin artmasının maturasyon ba~arısını olumlu cıkilediğini bildirmiş, Gordon (6) ise. hu durumu follikül hüyümesinc paralel olarak oositin de büyümesine bağ-lamı~lır. Sirard ve Blondin (16). 2 mm'den hiçük
00-siıierin mitol. karakteri kazanmadığını, 6 nun'den hüyük folliküllerde ise atreli dalgası görüldüğünü hildirmiş ve 2 mm'den küçük, 6 mnı'den hüyük folliküllerden elde edi-len oositlerin matmasyon başarısının düşük olduğunu vurgulaml~tır.
Bazı araştırıcılar (15.16.19.21) cumulus-oosit komp-kkslerinin morfolojisinin in vitro maturasyon üzerine ~ok etkili olduğunu bildirmi~ ve bu durunnın cumulus hüc-relerinin oosiıin besin köprüsü olmasına bağlanuşlardır. YOlll1is ve ark. (23) oositleri etranarındaki cumulus hücre katmanı sayısına göre slnıl1andırmışlar ve etranarı 4 ve daha fazla eumulus hücre katmanı ile çevrili oositlerin maımasyon yeteneklerinin çok iyi olduğunu vurgulamış-lardıL
Greve ve ark. (9) oosit maturasyonunda kullanılan vas~llların haşarı)'ı etkilediğini ve bu alanda sıklıkla tissue cuhure medium-199 (TCM-199). Meneza's 132, Tyrodc. Ham's FIO ve F12, Bristers' ve minimum esansiyel mc-di um (MEM) vasatlarının kullanıldığını bildirmcktcdir. Bu vasaılara maımasyon oranını arttırmak amacıyla canlı kiikenli (serumlar. hormonlar, protcinler ve peptidler) ve sentetik (inhibin. aktivin. oksitosin. EGr) vasat katkıları eklenmcktedir (19).
Sunulan çalı~manın amacı. farklı hoyutlardaki rolliküllerden elde edilen sığır oositlerinin maturasyon ha~arılarının incelenmesi ve failikül büyüklüğü ile ma-ımasyon haşarısı arasındaki ilişkinin ortaya konmasıdır.
Materyal
ve Metot
Ovaryum toplanması ve transferi
Çalı~mada. mezbahada kesilen değişik ya~, ırk ve fizyolojik statiideki toplanı 300 sığır ovaryunıu kullanıldı. Ovaryumlar. kesimden hemen sonra karkastan ayrılarak, içerisine penisilin iDO lU/ml, streptomisin 50 mg/ml ve Amphoıericin-B SO mg!ınl katılmış, yakla~ık 30-37°C sıcaklıktaki serum fizyolojik içinde laboratuvara ula~-ıırıldı. Laboratuvarda iki kez taze vasatla yıkanan ovar-yumlar (k70' lik eıil alkolden geçirilerek kurumaya bı-rakıldı.
Oosit aspirasyonu ve seleksiyonu
Ovaryumdaki periferal folliküller bir kompas yar-dınııyla ülçülerek. çaplarına göre üç gruba ayrıldı (Grup i: 1-3 mm, Grup II: 3-6 mm ve Grup III: 6-
Lo
mm). Hergrupta yer alan folliküller sayıldı ve hu folliküllen: Fr)' ve ark. (5)' nın belirttiği yönteme göre (ucunda ISG iğne hu-lunan steril enjektörlerle) punksiyon yapıldı. Tnplanan faııiküler sıvı ve cumulus-oosit kompleksieri 13 mrlik stcril konik santrifüj tüplerine aktarılarak. iki keı SOO de-virde LOdakika santrifligasyon yapıldı (oosit yıkama) Yı-kama işlemi sonrası tüpün üstünde kalan folliküler sı'ı atıldı ve dipteki çöküntü. 4 ml steril senım fi/yoloıik ile sulandırılarak 6 mm'lik petri kutularına aktarıldı vc slc-reomikroskop altında incelemeye alındı. O()sit sclcksıyn-nu Fry ve ark. (S)'nın belirttiği yönıeme giin.' yapılarak. yalnızca elranarı 4 ve daha fazla cumulus hüne kaımam ilc sıkıca çevrili ve kumlu bir ooplal.lna görümüsü veren oositler maturasyon i~lcmi için ayrıldı.
Oosit maturasyonu
Matmasyon vasatı olarak ıissuc cultme medium (TCM-199) kuııanıldı. Matmasyonun desteklenmesı ama-cıyla içerisine (il LO lv/v) oranında ısıyla inaktivc edilmi~ (56°C' de 30 dakika) östrustaki sığır sertunu (ECS) ka-tıldı. Maturasyon için seçilen oositler 15-20'şı:rli gruplar halinde. içerisinde ımı vasat (TCM-199 +'Yıdi) ECS) hu lunan 40 mm'lik petri kutularına aktarılarak. vasaıların üzcrleri steril parafin ile kapatıldı ve etü,e yer1e~tirildi. Kültür. :WcC'de. %5 CO, gaz atmosferinde 2'1 saatle ger. ~:ekleştirildi .
Maturasyonun saptanması
Gositi çevreleyen eumulus hücrelerinin şişmesi ve gev~emesinin yanısıra birinci kutup hücresinin periviıel-lin boşlukta görülmesi matmasyon kriteri olarak kul-lanıldı.
İstatistiki değerlendirme
Çalışmanın sonuçlarının isıaıisıikı değerlendirnıesı Chikare (q2) metoduna göre yapıldı.
Bulgular
Çalışmada oosit kaynağı olarak kullanılan 300 ovar-yumda gruplara göre aspirasyon işlemi uygulanan follikül sayıları, bu folliküllerden elde edilen ortalama onsit sa-yıları, oositlerin morfolojik dağılımları ve maımasyon yüzdeleri Tablo I' de topluca sunulı11l1~lm
Tablonun incelenmesinden de anlaşılacağı gihi 1-3 mm'lik foııikül sayıları (Grup i) diğer gruplardan ((irup II ve III) yüksek ve istatİstiki olarak önunli hulundu (p<O.OI).
Grup ı ,e ırdeki maıurasyon oranları hirhirine hen-zer (p>O.OS) olmakla beraher, Grup II1'den helirgin hir ~ekilde yüksek bulundu (p<CL.05).
Maturasyon kültürü sonrası Grup r d': 'Ir 17. Grup ırde (lc7 ve Grup ıırde 'k9'luk hir oosiı lizisi i/kndi Li-zisc ek olarak Grup r de i1, Grup ll' de 9 ve Grup III' ele 5 oosiııe cumulus ekspansiyonu izlenmeıken kutup ci-simciğinin atıldığı tespit edildi.
Ankara Üniv Veı Fak Derg, 48,2001 20]
Şekıl I. Inımaıure oosıt hgllre I. Imımllure ooel'te.
Şekil 2. MatlIJT oO.sit Figııre 2. Mature ooeyte.
Tahlo I. Gnıphıra göre aspirasyon yöntemi ilc elde edilen oositlerin morfolojik da~ılımları ve maturasyon oranları. T~ıhle I. The morphologieal disperst and mallıration rates of ooeytes in sıııdy groups eolleeted hy aspiraıion.
Aspirasyon işl~mi uygulanan Collikiil sayısı (ort) Aspıre edilen oo,iı sayısı (ort)
Aspire edılen 'Josiılerİn morColoJık dağılımları (%) Maıurl' oC.silsayısı M~nurasyon yüzdesi 619 (34) Grup i (1.3 mm) 1860" (6.2) 1798' (5.9) ii III 516 41 i (28) (22) 377 "1r.611 IV 252 (14) 624 (52) Grupii (3.6 mm) i i 88h(3.9) 1188" (3,9) ii
ııı
322 161 (27) (13) 474 %76" IV 81 (7) 308 (57) Grup III (0.20 mnı) 54(j" (IS4) 527" (1.7) iiııı
149 4ô (29) (9) 228 %74' IV 24 (S),"".'d Aynı s;Hırd~ Carklı harflerle işaretlenmiş veriler hirbirinden helirgin oranda farklıdır (p<O.OI).
,'1Aynı satırda Carklı harflcık işareılenmiş veriler hirhirinden helirgin oranda farklıdır (pdUlS). I.i1.1ı1ve IV fry ve ark. (S)'na güre smıllandırına
Tartışma ve Sonuç
Hazcleger ve ark. (i i), J.3 mm'lik folliki.illerden as. pire ettikleri oositlerin TCM. 199 (+% iO ECS) vasatında maııırasyon başarılarını inceledikleri çalışmalarında 00.
,İılerin %63'üniin mctafaz II'yc ulaştığını, Greve ve Ma. dison (8) ise TCM.199 (+%20 FCS + LH + E) vasatını kullandıkları çalışmalarında maıurasyon oranını %79 ola. rak hildirınişlerdir. Sunulan çalışmada mezbahadan lop. Lıııan ovaryumhır i.izerindeki 1-3 mm'lik folliki.illerin as-pirasyonu ilc aspire edilen oosiılerin TCM-199 + %10 FCS vasatında nı aıurasyonları sonucu oosiılerin %6 i 'inin metafaz II'ye ulaşııkları tespit edilmiştir. Elde edilen bu sonuç Leibfried-Rutledge ve ark. (13 )'nın belirttiği so. nuca uyarken. Greve ve Madison (8)'ın sonuçlarından düşük bulunmuştur ve bu c1i.işi.ikli.iği.inanılan
araşıırıcıla-rın maıurasyon vasaılarına ekledikleri hormonlardan (FCS, LH ve E) kaynaklandığı düşi.inülmekıedir.
Mezbahadan ıopladıkları ovaryumbr üzerindeki 2-7 mm'lik folliki.illerden aspire etıikleri oositlerin TCM. i9<) içerisinde maturasyona tahi tutulduğu çalışmalarda ma. ıurasyon haşarılarını: Bois ve ark. (2) (TCM. iSlSl)'kSO.
Canılan ve ark. (3) (TCM-199
+
ECS) '/r,76, Farin ve ark. (4) (TCM.199+ LH + FSH + E2) 17<,76.93. .Jcwgwnow vt:ark. (12) (TCM.19Sl + BSA) %80, Oıoi ve ark. (14) (TCM- i99) %76, Sosnowski ve ark. (17) (TCM.
ı
Sl9 + FCS + BSA) ise %74 olarak bildirmişlerdir. Sunulan ça. lışmada, 3.6 mm büyüklüğündeki follikül1erdelı elde edi. len oosülerin maıurasyon başarısı %76 olarak buluıımuş. tur. Bu sonuç yukarıda bildirileıı araştırıcıların solıuc;ları. na henzerlik göstermektedir.204 Şükrü Kiipllilü - Mustafa Ün
Leibfried-Rutledge ve ark. (13) yaptıkları çalışmada 0-20 mm çapındaki folliküllerden aspire ettikleri
00-sitierin TCM- i99 içerisindeki maturasyon başarılarını
(Yı,R6 olarak hildirmiştir. Greve ve Madison (8) ise 5-8
mm'lik folliküllerden köken alan oositlerin yine TCM-199 içindeki maturasyon oranını o/c76 olarak bildirmiştir. Sunulan çalışmada 6- LO mm'lik folliküllerden aspire edi-len oositlerin %7i oranında mature oldukları bulunmuş-tur. Bu sonuç, yukarıda bildirilen araştırıcıların sonuçları-na uymaktadır.
Xu ve ark. (21) küçük preantral folliküller (1-3 mm) içerisindeki oositlerde protein sentez yeteneğinin iyi ol-duğunu ancak siklik-AMP zincirinin henüz böli.inmeyi destekleyecek RNA duyarlılığına sahip olmadığını ve bu nedenle bu folliküllerden alınan oositlerin mitoz ye-teneğinin yok edecek kadar az olduğunu hildirmişlerdir. Gordon (6) ise 1-3 mm arasındaki folliküllerden alınan oositlerin büyüklüklerini SO-RO ~m olarak bildirmekte ve diişiik mitoz yeteneğini buna bağlamaktadır. Thibault ve ark. (i R) oositi saran cumulus hücrelerinin diffuzyon ye-teneklcrinin salınan östrogen ve oosit hüyümesiyle ilgili olduğunu vurgularken. Gordon (6) corona radiata'yı saran granulosa hücrelerinin başkalaşım ve gelişimi için oositin kritik bir biiyükli.iğe ulaşması gerekliliğini bildirmiştir. Gordon ve Lu (7) ile Yang ve ark. (22) 2 mm'den küçük folliküllerde zona peııucida üzerinde LH rescptörlerinin yeıcrli sayı ve aktivasyonda olmadığını bildirirken. Gor-don (6) buna ek olarak cumulus hiicrclerinin LH'ya du-yarlılığının yetersiz olduğunu vurgulamıştır. Gordon (6) hu durumu. 2-7 mm arasındaki follikül içerisindeki
00-sitlcrin normal biiyükli.iklerinin %80'inine ulaşmasına. Xu ve ark. (21) ise bu dönemdeki oositlerin hormon ve diğer sellüler uyarımlara maksimum duyarlılık gös-termelerine bağlamaktadır. Yine Gordon (6) 2-7 mm'lik fol lik iillerdeki 1\TP sentczinin diğer tüm dönemlerden yiiksek olduğunu bildirmiş ve dominant follikül 1'ark-lılaşI~lasının bu döneme rastladığını vurgulamıştır. Gor-don (6) 1'olliküııer 7 mm iken atrezi dalgasının başladığını ve dominant follikül dışındaki tüm folliküllerde reg-resyonun başladığını bildirmiştir. Atrezi başlayan 1'01-likiillerde kiiltür süreci sonunda maturasyona benzeyen pseudoınaturasyon şekillenmckte ve bu nedenle ma-ıurasyon başarıları yiiksek olmaktadır (1 R). Sunulan ça-lışmada. gruplarda elde edilen maturasyon oranları kar-şılaştırıldığında. en düşük maturasyon başarısı Grup i'de (1-3 mm) elde edilirken. diğer iki grupta (Grup II ve III)
ulaşılan maturasyon sonuçları birbirine benzer bu-IUl1IlHIŞtur. Bu durum yukarıda açıklanan araştırıcı dü-şiincelerine uymaktadır. Ancak. in vüro embriyo üretimi tekniğinde maturasyon önemli bir aşama olmakla birlikte, gerçek anlamda maturasyonun ortaya konması 1'er-tilizasyon başarısı ve erkek pronukleusu geliştirebilme yetcneği ilc ilişkilidir. Bu nedenle, anılan hüyüklükler-deki folliküllerden elde edilen oositlerin
maturasyonları-nın incelenmesinde. hirinci kutup hücresinin atılması ve cumulus ekspansiyonu gibi morfolojik kriterler tek baş-larına yeterli görünmese de, periferal folliküllerden elde edilen oositlerin embriyo üretimi çalışmaları için iyi bir kaynak oluşturduğu kanaatine varıldı.
Çalışma sonucunda elde edilen verilerin ışığmda. maturasyona alınacak oasitlerin aspire edildikleri follikül-lerin büyüklüğü ilc maturasyon başarısı arasında pozitif bir konelasyon olduğu ve belirli bir büyiiklliğc ulaş mayan folliküllerden aspire edilen oositlcrin in viım fer tilizas-yonda kullanımlarının sınırlı kalacağı sonucuna \'a-rı ldı.
Kaynaklar
i. Havister BD, Rose-Hellekant TA, Pinyopummintr T (1992): Developmımt oj in I'ilm maıumtediin vilm fer-ıilized hovint' t'mhryos into 1I1Orıtlat' (l/ıd hluslocrsts III de-fiııed cullure media. Theriogenology, 37. 1'27-1.17. 2. 80ls PEJ, Van Soom A, Ysebaert
:vrr,
VandenheedeJMM, Kruif A (I 9(7): Efrects ot mpirutioıı vacuwl1 uııd /leedie diaıııeter mL cU/nulus oocytt' comple.\' morphologr a/ld del'elopmeııtal capaciı)' ol' boriııt' (Jl'crlt's. The-riogenology, 45. ]()() I-I Oı3.
3. Carolan C, Lonergan P, Monget P, Monniaux D, "ler-millod P (ı9(5): E/feet offolliCıt' si?t' uııd (llIIılit\' mı ıh" ahilit)' ol.!ollieulartluid lo support c)'ıoplusııuc malıml/lO/1 ofbOl'ilıe oocytes. Theriogenology. 43. 18'2-19'2.
4. Farin CE, Hasler .IF, Martus !'OS,Stokes ,tE (ı (1)7): A
comparisoıı of Ml'1Iems /32 aııd Tissue Culıurt' M"diUln-IY9 .iilI' iıı l'itro prodLletiOlI ol' hoviııt' hlustoc\'Sls The-riogenology. 48. 699-7()1).
5. Fry RC, Niall EM, Simpson TL, Squires '1'01. Reynolds ol (ı997): The coll"cıimı ol' ooertt's Fom /ıOI'/Ilt' (}\'wies. Thc-riogenology. 47. 977-987.
6. Gordon i (1994): Lahoruıor)' Pmduclloıı ol Caııle
I:'nıh-r)'os. Cahi Production. Philadelphia.
7. Gordon I, Lu KH (1990): PmdLlııiolı olemiıl"ros 1/1 vıım a/ld iıs ill1{Jacl on livestock pmdııctioıı. ThCl'logcnıılogy. 33. 77-87.
8. Greve T, Madison V(ı9(1): LLLI'itm fi'rtiliwtioıı iıı Cılılll" a rel'iew. Reprod Nutr Develop. 31. 147-157
9. Greve T, Madison V, Avery B, Callcsen H, HyteII P (1993): bı ı'itro prodLletiml ol' h(}\'i/1t' 1'1I11)l"l'Os'A flmgrI'SI reporl aııd tht' co/lseqllt'ııces 011 ıhe gl'/1t'ti,~' Upgrudıııg ol
ciliile populatio/1s. Anim Reprod Sel. 33. 51.6').
ı
O. Hashimoto S, Takakura R, Kishi M. Sudo '1', Minami K, Yamada M (1999): UltrusoUlıd-guidt'd fol!ıcll' (/Ipımıio/1 The colleeti()lı ot l)(Jviııe cwnıılus-ooc\'tl' ı:omplexn FO//1 ovarin o{slaul(htt'l't'd or liı,t' o\'(/rin. Theriogenology. 51. 757-765.i
ı.
Hazelcger NL, Hill DJ, Stuhhings RB. Walton ,lS(ı(95): Rt'latiolı ot //1orphologr aııd lollu:ıılur Ilınd 1'11-vinmmt'IlI ot hOl'ilıe ooc)'It'S ıo ıheir dnelolJlI1t'1I1II1 i)()-ıeıılial iııviım. Theriogenology. 43.509 522
12. Jewgwnow K, Hecrdegen B, Müller K (1991)) 1/1 I'/ım
developmeııt ol' indil'idually IIlI/tııruled /ınviııe (Joc"les /Il
relatio/l to/ııllicular wall Mresia. Theriogenology. 51. 745-756.
Ankara Üniv Vet Fak Dcrg. 48. 200 i 205
13. Lcihfricd-Rutlcdgc ML, Cristcr ES, Parrish U, First :'III. (1989): Iıı I'iıro ma/ll/"{/ıioıı aııd ./i'rtiliwıion oL hovine oocyıe.l. Thcriügenology. 31, 61-74.
14. Oloi T, Yamamoto K, Koyama N, Taehikawa S, Suzuki T (I 997). Boııine oocyıe dimneıer in re/aliOlI lO de-velopmenu/ compeıence. Theriogenology. 48. 769-774. 15. Shamsuddin M, Larsson H, Rodriguez-Martincz H
(1993): Maıuraıion-re/aled chaııges in hovine oocyles Lllıder difl;'reııı cu/ıure coııdiıiollS. Anİm Reprod Sei. 31'
49-60.
16. Sirard MA, Blondin P (I 996): Ooc.\'ıe malımilion and IVF in mil/e. Anim Reprod Sei. 42. 4i7-426.
17. Sosnowski .l, Switonski M, Lcehniak D, Molinski K (1996): Cvlogenelic evafıwıion oL in vilm maluraıed
ho-1'11/(' oocyl,'s colleeted ji'om ovaries of individua/ donors.
Theriogenc,!ogy. 45. 865-872.
18. Thihault C, Sziilliisi D, Gerard M (1987): Mammalian
oocrle I1wlııraıion. Reprod Nutr Develor. 27. 865-896.
19. Thompson.lG (1997): Comparisoıı between in in-I'ivo
de-rivet! aııd iıı I'iıro-producf'd pre-e/ongatiri/l embryos from doml!sıic I'IUJliIıWI/S.Reprod Fertil De\'. 9. 341-354.
20. Trounson A (1992): The prodLletion of rLlmiııwl/ I-'mhriros
in viıro. Anim Reprod Sei. 2ll. 125-137.
21. Xu KP, Greve T, Smith S, Hytcll P (1986) Chrn-n%gica/ changes of hoııiııe .tollicu/ar ooeTl1-' I1wlwwiolı iii
viıro. Aeta Vet Seand. 27. 505-519.
22. Yang X, Jiang S, Footc RH (1993) Rm'inl-' oOCYle dl-'-ve/opmeıııfol!owing dillerenı oocyıe malıtmlion and spenn capaci!aıion procedures. Mo! Reprod Dev. 34. 94-100. 23. Younis AI, BraekcU BG, Fayrer-Hosken RA ( 1989) liır
/uence olserum and horıııoııes 011hoviııe (iocvle /1wlıır{[liolı lIIıdferlilizaliolı in viıro. Garııeıe Res. 23. 189-20 I. Geli,ç !arihi. 27.2.2001/ Ka/nt/ıarihi. 14.3200} Yazışma adresi:
Prof Dr. Şükrü Küplü/ü
Ankara Üniversilesi Veıeriner Fakü/ıesi Doifum ve Jinekolr~ii Anahilim Dali 061/0 Dı,çkapı. Aııkara
