Yadeller (1979) – Ferdi Tayfur

Os perfis cromatográficos das amostras das apitoxinas foram sobrepostos de acordo com as diferentes fontes alimentares (Figura 1).

Os picos 2 (tempo de retenção entre 39.70’e 39.94’) e 5 (tempo de retenção entre 51.70’e 52.36’), foram coletados para determinação da sequência N-terminal e identificados como fosfolipase A2 e melitina respectivamente (Tabela 1), obtendo 100% de identidade em comparação no UniProt.

Tabela 1 – Sequência peptídica obtida da apitoxina

RT (min) Sequência determinada Comparação (UniProt ref.)

52.36 _{GIGAVLKVLTTGLPALISWI Melitina de Apis mellifera (P01501)} 39.94 IIYPGTLWCGHGNKSSGPNE PLA2 de Apis mellifera (P00630)

RT: Tempo de retenção

Os picos 1, 3 e 4 (Figura 01) apresentam padrões de intensidade equivalentes a apamina, isoforma da fosfolipase A2 e isoforma da melitina, respectivamente.

Para as abelhas mantidas em cultura de laranja e vegetação silvestre associada a alimentação artificial foram encontrados em média 44 picos, 40 picos em vegetação silvestre e 33 picos na plantação de eucalipto.

Todas as amostras de apitoxina apresentaram em sua composição a melitina, fosfolipase, apamina, isoformas de melitina e de fosfolipase, com exceção das amostras obtidas das colmeias mantidas em cultura de laranja, onde não foi observada a isoforma da melitina (Tabela 02).

A alimentação proveniente da florada de laranjeira ocasionou a produção da apitoxina com maiores intensidade dos picos 1, 2, 3 e 5 e maior quantidade total de picos. A vegetação silvestre com alimentação artificial também apresentou maior quantidade de picos e a maior intensidade do pico 4, entre todas as amostras analisadas. A alimentação oriunda da vegetação silvestre não apresentou picos dominantes, apresentando intensidades intermediárias. Diferentemente, as abelhas mantidas em

vegetação de eucalipto apresentaram a apitoxina com os menores valores para os picos 1, 2, 3 e 4, e também menor quantidade total de picos (Tabela 02).

Na análise palinológica, para as colmeias instaladas em florada de eucalipto foram observadas a presença de 13 tipos polínicos, com predominância da família

Myrtaceae (que compreende o gênero Eucalyptus sp). Já para as colmeias da florada de

laranjeira verificou-se a presença de 20 tipos polínicos com predominância das famílias Myrtaceae e Poaceae, com presença da família Rustaceae, a qual, entre outras espécies, pertence o gênero Citrus sp. Nas colmeias alocadas na vegetação silvestre foram observados 29 tipos polínicos, com predominância de famílias Myrtaceae, Poaceae e

Asteraceae. Foram encontrados 18 tipos polínicos nas amostras das colmeias da

vegetação silvestre associada à alimentação artificial, com predominância daqueles que compõem a família Mimosaceae, e presença da família Myrtaceae e Poaceae.

Figura 01 – Sobreposição dos perfis cromatográficos obtidos por CLAE/FR de quatro amostras de apitoxina provenientes de abelhas Apis mellifera africanizadas mantidas em cultura de eucalipto (A), vegetação silvestre (B), vegetação silvestre com alimentação artificial (C) e cultura de laranja (D).

1 - apamina, 2 - fosfolipase, 3 – isoforma da fosfolipase, 4 – isoforma da melitina, 5- melitina

A

B

C

Tabela 02 – Intensidade (I), em mAU, dos picos 1 (apamina), 2 (fosfolipase), 3 (isoforma da fosfolipase), 4 (isoforma da melitina) e 5 (melitina) gerados por CLAE/FR da apitoxina de Apis mellifera africanizadas mantidas sob diferentes recursos florais.

Eucalipto Média±DV* 1 2 3 4 I pico 1 85,66 169,93 210,08 107,05 143,18±57,17 I pico 2 123,04 258,59 327,11 147,03 213,94±95,81 I pico 3 80,90 132,60 166,96 67,014 111,87±46,31 I pico 4 137,06 389,25 191,60 105,17 205,771±127,42 I pico 5 510,87 1079,86 1460,51 674,10 931,34±426,24 Silvestre Média±DV* 1 2 3 4 I pico 1 178,70 169,85 169,85 264,65 195,76±46,11 I pico 2 349,75 363,37 457,81 619,06 447,50±124,06 I pico 3 134,82 137,60 164,69 208,69 161,45±34,25 I pico 4 118,10 112,79 294,39 295,74 205,25±103,73 I pico 5 1460,24 1509,57 1591,39 1915,47 1619,17±204,81

Silvestre + Artificial Média±DV*

1 2 3 4 I pico 1 296,38 216,67 229,63 331,18 268,46±54,47 I pico 2 693,19 441,95 564,17 679,02 594,58±117,01 I pico 3 230,6 162,61 177,57 224,41 198,78±33,80 I pico 4 461,89 468,98 139,76 210,64 320,32±170,07 I pico 5 2061,09 1374,59 1915,59 2153,04 1876,08±348,32 Laranja Média±DV* 1 2 3 4 I pico 1 464,49 277,45 313,46 347,02 350,60±81,06 I pico 2 965,03 667,15 696,26 827,47 788,98±136,52 I pico 3 307,06 223,15 233,28 274,22 259,43±38,67 I pico 4 _{- 156,07 222,76 - 189,41±112,70} I pico 5 2539,32 1976,81 2179,92 2272,48 2242,13±233,46 * DV = Desvio Padrão

4. DISCUSSÃO

Por meio da análise por CLAE/FR foram gerados picos que correspondem aos compostos presentes na apitoxina. Os dois maiores picos foram identificados como melitina e fosfolipase, e sugeriu-se que o terceiro maior pico seria apamina, concordando com outros estudos da literatura [21, 35, 36].

A apamina é constituída de 18 resíduos de aminoácidos, com aproximadamente 2 kDa, sendo o menor peptídeo neurotóxico conhecido. Ela representa 2% do peso seco da apitoxina e influencia nas membranas pós-sinápticas do sistema nervoso central e periférico [37].

A melitina correspondeu ao maior pico isolado (pico 5) encontrado no cromatograma, estando de acordo com outros estudos, pois a melitina, constituída de 26 resíduos de aminoácidos e peso molecular de 3 kDa, representa cerca de 50% do peso seco da apitoxina [12]. Ela atua como fator de dispersão, facilitando a entrada dos demais componentes no sistema circulatório da vítima da ferroada [38] e possui atividade hemolítica [39]. Uma isoforma da melitina, a melitina-S, que compreende um resíduo de Serina na décima posição, é secretada o ano todo mesmo em baixos níveis em alguns períodos, não tendo relação com a idade da abelha [40]. Neste estudo observamos a presença do pico 4, que pode representar uma isoforma da melitina.

A fosfolipase A2 (Api m 1) representa cerca de 12% do peso seco do veneno, contém 134 resíduos de aminoácidos [41] e causa a hidrólise dos fosfolipídeos presentes nas membranas plasmáticas, formando poros e causando a lise celular [42]. Possui três isoformas caracterizadas de pesos moleculares correspondentes a 16, 18 e 20 Kd, respectivamente [43]. Na presente pesquisa, foi identificado o pico 3 em todas as amostras, correspondente a uma possível isoforma da fosfolipase.

Observou-se a sincronização na intensidade dos picos de melitina e fosfolipase das quatro amostras estudadas para o mesmo recurso alimentar. Esta ocorrência foi bem visualizada na apitoxina obtida das abelhas instaladas em áreas de vegetação de laranjeiras e vegetação silvestre (com ou sem alimento artificial). Da mesma forma [20], verificaram sincronização dos picos de melitina e fosfolipase, sem apresentar correlação com parâmetros climáticos.

As diferenças encontradas nas médias da quantidade (44 em cultura de laranja e vegetação silvestre com alimentação artificial, 40 em vegetação silvestre e 33 em cultura de eucalipto) e intensidade dos picos relacionando as fontes alimentares sugerem a influência da alimentação na composição da apitoxina. Todas estas variações parecem estar associadas aos diferentes recursos florais disponíveis para as abelhas, conforme evidenciado pela análise palinológica das amostras de mel e pólen destas colmeias, que demonstrou diferentes famílias predominantes para cada fonte alimentar.

A abelha A. mellifera possui grande capacidade de adaptação e exploração de diversos ambientes, ao longo de várias zonas climáticas e vegetacionais [44] e é tida como generalista, ou seja, tem um comportamento de forrageio amplo, aproveitando o que está disponível na flora, como pode ser visto neste estudo devido a grande quantidade de tipos polínicos presentes em todas as análises palinológicas.

Porém, quando a reserva de alimento na colmeia é insuficiente, como em épocas de seca e ausência de floradas, muitos apicultores fornecem uma alimentação de manutenção, de forma a suprir as necessidades nutricionais das abelhas. Neste estudo foi fornecido xarope de açúcar associado a vegetação silvestre por ser um alimento artificial energético aceito pelas abelhas, de fácil manejo e comum na alimentação de subsistência.

Para outras espécies, como serpentes, a variação na composição do veneno pode ser considerada uma adaptação aos diversos hábitos alimentares [45] e foi descrita por muitos autores, como no gênero Echis [46] e espécie Sistrurus m. barbouri [47]. Em um estudo sobre o veneno de espécies continentais e insulares da serpente Calloselas

marhodostoma, os autores detectaram variações nos perfis proteicos, que estariam

intrinsecamente relacionadas com a variação de dieta [45]. Uma correlação entre a letalidade do veneno e fonte alimentar em Bothrops alternatus e B. jararaca durante sua ontogênese também foi estabelecida [48]. A dieta, nestes casos, atua não como um fator diretamente modificador, mas selecionador de algumas características [22, 23, 24].

Dentro das mesmas condições alimentares, foram observadas diferenças na intensidade dos picos e ausência da isoforma de melitina em duas colmeias analisadas na florada de laranjeira, sugerindo a influência da genética dos enxames, uma vez que estas colmeias apresentaram espectro polínico semelhantes, sem a dominância de um tipo polínico diferente.

Alguns autores verificaram variabilidade na quantidade de fosfolipase e melitina do veneno de abelhas europeias e africanizadas [11] e diferenças quantitativas e qualitativas na composição da apitoxina de A. m. ligustica, A. m. adansonii e abelhas africanizadas [12]. Mais recentemente, a avaliação da composição da apitoxina de A. m.

ligustica e A. m. carnica e abelhas africanizadas, foram identificadas um total de 51

proteínas, sendo 42 comuns a todos os grupos, 4 proteínas exclusivas das africanizadas (major royal jelly protein 1, major royal jelly protein 5 precursor, alpha-glucosidase precursor, hypothetical protein LOC725114 isoform 1) e 1 exclusiva de A.m. ligustica (vitellogenin precursor) [3].

Neste trabalho, estudamos o perfil cromatográfico da apitoxina isolada de Apis

mellifera o qual resultou em compostos já descritos na literatura. Os 5 picos estudados

(apamina, fosfolipase, isoforma da fosfolipase, melitina, isoforma da melitina) apresentaram diferenças na intensidade, sugerindo, juntamente com a variação no número total de picos, a influência da fonte alimentar na composição qualitativa da apitoxina. As possíveis variações da apitoxina ainda precisam ser investigadas considerando diferentes recursos florais disponíveis em outras regiões, além de fatores sazonais, climáticos e genéticos. Estas informações podem contribuir para o futuro desenvolvimento de um soro antiveneno representativo, eficaz e seguro para o tratamento de acidentes em massa de Apis mellifera,

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IMPLICAÇÕES

Dentre todos os produtos que as abelhas podem oferecer, a apitoxina vem se destacando através de inúmeras descobertas sobre suas ações terapêuticas, farmacológicas e seus mecanismos de ação dentro do organismo humano. O destaque também ocorre pelo crescente número de acidentes envolvendo estes insetos, em que alternativas para o tratamento das vítimas precisam ser desenvolvidas.

Estudos que avaliem sua composição são extremamente importantes para sua caracterização e identificação de quais fatores e como eles atuam na alteração dos constituintes da apitoxina. Este trabalho demonstrou, pela primeira vez na literatura científica, que além de fatores observados por outros autores, como idade da abelha, época do ano e genética do enxame, a alimentação pode influenciar na composição da apitoxina, conforme o recurso floral disponível.

Espera-se que com este estudo pioneiro, novas pesquisas sejam realizadas, a fim de verificar como diversas fontes alimentares, em períodos maiores de consumo, podem alterar a composição qualitativa e quantitativa da apitoxina. Também se espera que este trabalho possa contribuir no desenvolvimento de um soro antiveneno representativo e eficaz para vítimas de ferroadas de abelhas.

ANEXO 1: Fotos dos tipos polínicos encontrados nas análises palinológicas das

colmeias alojadas em diferentes fontes de recursos alimentares (A: silvestre + açucar, E: eucalipto, L: laranja, S: silvestre).

Famílias encontradas e predominância: 1) Myrtaceae (A: 9%, E: 72%, L:38%, S: 7%) 2) Urticaceae (A: 6%, E: 27%) 3) Asteraceae (S: 25%) 4) Poaceae (A: 17%, L: 36%, S: 32%) 5) Mimosaceae (A: 64%) 6) Rutaceae (L: 17%). Aumento de 100 vezes.