Tenâsüb Ġlmine Dikkat Çekilmesi

2.1. JUSTIFICATIVA

Enquanto a última década testemunhou importantes avanços na biologia do DENV, incluindo as determinações estruturais da partícula viral e as proteínas-chave envolvidas, as análises dos mecanismos de tradução e replicação viral, além da caracterização funcional das proteínas virais, a patogênese do dengue permanece pouco elucidada, onde a complexa inter-relação entre os fatores virais e do hospedeiro ainda não são bem conhecidos. As observações clínicas da doença têm fornecido algumas informações a respeito da patogênese da infecção pelos DENV, principalmente no que diz respeito a mediadores inflamatórios como quimiocinas e citocinas, além de populações celulares envolvidas nesta resposta, como DCs e células T CD4+. Entretanto, a ausência de modelo animal adequado, imunocompetente, tem atrasado as pesquisas acerca da fisiopatologia da doença, principalmente os mecanismos celulares e moleculares que medeiam o seu agravamento e possíveis interações sistêmicas, mecanismos chave na lesão tecidual e no mau prognóstico da doença.

Com um modelo animal reprodutível e capaz de mimetizar a doença e seus sintomas assim como observados em humanos, tornou-se possível o estudo de moléculas chave na doença. A maioria já é relatada na clinica e possuem notável associação com eventos observados em quadros de FHD, como os elevados níveis de quimiocinas da família CC. Além do mais, populações celulares com importante função na resposta imune, e que participam de uma complexa rede de ativação celular e produção de mediadores inflamatórios, como as células NKT invariantes (iNKT), se tornam um importante alvo de estudo em infecções virais. Uma possível relação entre quimiocinas CC e células iNKT na infecção pela dengue pode trazer novas abordagens e estratégias para o estudo da fisiopatologia da infecção pelo vírus, além de abrir possibilidades para o estudo de alvos terapêuticos. A escassez de literatura envolvendo modelos experimentais de infecções por flavivírus e sua resposta inflamatória sistêmica, o que inclui choque e hemorragia, acaba também por validar o objeto de trabalho.

2. 2. Objetivos

O presente trabalho de tese foi baseado em dois objetivos principais de estudo, consistindo em se investigar o papel dos receptores de quimiocinas CCR1, CCR2 e CCR4 na patogênese da dengue experimental em camundongos (Objetivo 1) além de se avaliar também o papel deletério das células NKT invariantes (iNKT) na patogênese da infecção pelo vírus da dengue, utilizando-se o mesmo modelo experimental (Objetivo 2).

2.1.1. Objetivos específicos 1

1. Investigar se os receptores para quimiocinas CC, respectivamente CCR1, CCR2 e CCR4, são importantes para a mortalidade e perda de peso associada à infecção pelo DENV-2 em camundongos WT ou geneticamente deficientes para estes receptores (KO).

2. Investigar se os receptores CCR1, CCR2 e CCR4 são importantes para o clearance viral no fígado e se também participariam das alterações hematológicas associadas à infecção pelo DENV-2 no presente modelo experimental, incluindo analise de plaquetas, hematócrito e granulócitos em camundongos WT ou geneticamente deficientes para estes receptores (KO) no dia 6 pós-infecção.

3. Investigar a participação dos receptores CCR1, CCR2 e CCR4 na lesão hepática associada à infecção experimental pelo DENV-2, avaliando-se por ELISA os níveis de citocinas (IL-6 e IFN-γ) e quimiocinas (CCL2/JE, CCL3/MIP-1α e CCL5/RANTES) no fígado, além do acúmulo neutrofílico por MPO, analise histopatológica e dosagem de transaminases hepáticas no soro de camundongos WT ou geneticamente deficientes para estes receptores (KO) no dia 6 pós-infecção.

4. Investigar a participação dos receptores CCR1, CCR2 e CCR4 na resposta inflamatória sistêmica associada à infecção experimental pelo DENV-2,

avaliando-se por ELISA os níveis de citocinas (TNF-α, IL-6, IFN-γ) e/ou quimiocinas (CCL2/JE, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES e CCL17/TARC) no soro e baço, além do acúmulo neutrofílico por MPO no baço de camundongos WT ou geneticamente deficientes para estes receptores (KO) no dia 6 pós-infecção.

5. Investigar por citometria de fluxo a freqüência e perfil geral de ativação de células T CD4+, T CD8+ NKT (CD3+ DX5+), NK (CD3-, DX5+), neutrófilos (CD11b+ Ly6G+), e macrófagos (CD11b+ F4/80+) no baço de animais WT e deficientes para os receptores CCR1, CCR2 e CCR4 após a infecção pelo DENV-2, a fim de se avaliar a contribuição destes receptores para o trafego e ativação de tipos celulares relevantes para a infecção no dia 6 pós-infecção.

2.1.2. Objetivos específicos 2

1. Investigar por citometria de fluxo a participação, cinética de ativação (CD69) e produção de IFN-γ por células iNKT após infecção pelo DENV-2 em animais WT entre os dias 3 e 5 pós-infecção.

2. Investigar se células iNKT participam da mortalidade e perda de peso associada a infecção pelo DENV-2 em camundongos WT, Jα18-/- e CD1d-/- .Investigar também se a transferência de células iNKT purificadas do fígado (CD5+ NK1.1+) de animais WT para animais Jα18-/- é capaz de reverter o fenótipo observado.

3. Investigar se células iNKT participam do clearance viral em órgãos alvo (baço e fígado) e também das alterações hematológicas e inflamatórias associadas a infecção pelo DENV-2 no presente modelo experimental, incluindo analise de plaquetas, hematócrito, monócitos e linfócitos, lesão hepática por analise histológica, além da produção de citocinas (IL-1β, IL- 6, IFN-γ, TNF-α e IL-12p40) e/ou quimiocinas (CXCL1/KC), por ELISA, no

soro, baço e/ou fígado de animais WT e Jα18-/- entre os dias 4 e 6 pós- infecção.

4. Investigar por citometria de fluxo o perfil geral de ativação de células NK (CD3- NK1.1+), neutrófilos (CD11c+ Ly6G+), células T CD4+ e T CD8+ após a infecção pelo DENV-2 em animais WT e Jα18-/-, utilizando-se marcadores de ativação e/ou produção de IFN-γ afim de se avaliar a colaboração entre células iNKT e estas populações no presente modelo no dia 5 pós-infecção.

5. Investigar a ativação de células iNKT utilizando estratégias de pré- tratamento e pós-tratamento com o glicolípide αGalCer em animais WT durante a infecção experimental pelo DENV-2, afim de se investigar o efeito da ativação desta população sobre a mortalidade, perda de peso e alterações hematológicas (plaquetas, hematócrito e granulócitos) e carga viral em órgãos alvo (baço e fígado) no dia 6 pós-infecção.