Türkiye Geneli Manyetik Rezonans ve Bilgisayarlı Tomograf

4.1.6.1 Dosagem de fluoretono plasma

Para a análise do F- _{no plasma foi feita uma pré-difusão, pois, por se tratar de}

um fluído biológico, o plasma contém CO2, que deve ser eliminado. Para tanto, a

amostra de plasma foi colocada em placa de Petri (Falcon 1007) e sobre ela foi colocado o ácido sulfúrico saturado com hexametildisiloxano (HMDS), num volume que corresponde a 20% do volume da amostra de plasma. Este ácido sulfúrico (chamado de ácido aquecido) foi previamente aquecido até que o seu volume fosse reduzido pela metade, a fim de eliminar qualquer F- residual que pudesse contaminar a amostra. Após a adição do ácido aquecido, as placas foram deixadas abertas por 15 minutos para a saída do CO2, o volume das mesmas foi completado para 2 mL

com água deionizada e então a difusão seguiu como descrito por Taves (1968) e modificado por Whitford (1996). Na tampa destas placas, foram colocados 50 L de NaOH 0,05 M, distribuídos em 3 gotas. As placas foram então fechadas, seladas com vaselina, e por um orifício feito previamente na tampa foi colocado HMDS (Aldrich, 2,0 mL em ácido sulfúrico 3 M). O orifício foi imediatamente selado com vaselina e parafilme. As placas foram colocadas então numa mesa agitadora orbital plana (Nova Técnica, modelo NT 145) em velocidade 2-3, durante a noite.

No dia seguinte, as tampas foram removidas, invertidas e as gotas de NaOH foram combinadas numa única gota. O NaOH foi tamponado pela adição de 25 L de ácido acético 0,2 M. O volume total foi então ajustado para 75 L com água deionizada, usando uma pipeta. A gota, contendo todo o F- foi analisada com o eletrodo Orion 9409 e um micro-eletrodo de referência calomelano (Accumet, número de catálogo #13-620-79), ambos acoplados ao potenciômetro Orion EA 940. Durante a leitura, os dois eletrodos foram mantidos unidos através de bandas de borracha e colocados em contato com a gota na parte interna da tampa da placa.

A técnica de difusão facilitada por HMDS apresenta as vantagens de separar o F- _{da amostra, eliminando interferentes, e ao mesmo tempo concentrá-la, o que}

incrementa o limite de detecção do F- _{pelo eletrodo sensível, que é de 0,02 g/mL,}

conforme consta no manual do fabricante. Uma vez que nossa amostra tem um volume final de 0,075 mL, após a difusão facilitada por HMDS, podemos detectar quantidades de F- _{acima de 0,0015 g. Considerando que os níveis de F}-

plasmáticos geralmente giram em torno de 0,5-1,0 mol/L (0,0095-0,019 g/mL), utilizando-se 1 mL de plasma para análise (antes da difusão facilitada por HMDS) teríamos uma quantidade de F- de 0,0095-0,019 g, portanto bem acima do limite de detecção do eletrodo.

Para validação da análise de F-, as soluções-padrão (contendo 0,00475, 0,0095, 0,019, 0,095 e 0,19 g F) empregadas na realização da curva de calibração foram preparadas por diluição seriada de um estoque-padrão contendo 0,1 M F (Orion) e difundidas em triplicata, em concomitância com as amostras de plasma a serem analisadas. Foi feita uma primeira leitura antes de se começar a ler as amostras de plasma, a segunda quando a metade das amostras já tinha sido lida e a terceira após o término da leitura das amostras.

As leituras obtidas em milivoltagem (mV) foram convertidas para g de F-_,

através do Programa Excel (Microsoft). A média das leituras obtidas a partir dos padrões foi inserida na planilha, e então foi calculada a porcentagem de variação entre a quantidade de F- _{medida e a esperada pelos padrões. Somente curvas de}

calibração com porcentagem de variação de até 5% para todos os padrões e r 0,99 foram aceitas, contemplando a exatidão do método.

Além disto, padrões que não sofreram difusão foram preparados usando-se as mesmas soluções (NaOH 0,05 M e ácido acético 0,20 M) que foram usadas para se preparar os padrões e amostras que sofreram difusão. Estes padrões não difundidos foram feitos de modo a ter exatamente a mesma concentração de F- que os padrões que sofreram difusão. A comparação das leituras de mV mostrou que o F- nos padrões difundidos foi completamente captado e analisado.

Foi feita também uma sequência de padrões que sofreram adição do ácido aquecido de maneira que as amostras e as leituras de mV foram as mesmas tanto para os padrões que não sofrerem adição de ácido aquecido, quanto para aqueles que sofrerem, assim como também para os que não sofrerem difusão.

4.1.6.2 Dosagem de fluoreto nas fezes

As fezes foram secas em estufa ( 38°C) e pesadas para se determinar o peso seco das amostras. As amostras foram colocadas em tubos plásticos e adicionaram-se volumes de água deionizada que variaram de acordo com o volume das fezes (em média 3 mL por g de fezes). As amostras foram então homogeneizadas (Homogenizador Marconi, modelo MA 102) até que adquirissem consistência pastosa. A análise foi feita em duplicata, por difusão facilitada por HMDS, como realizada para o plasma, com exceção da pré-difusão. As figuras 3, 4, 5 e 6 demonstram a dosagem de F- nas fezes por esse método.

Figura 3 - Placa de Petri vaselinada.

Adição das amostras de fezes.

Figura 4 - Adição de 2 mL de água

deionizada e 50 L de NaOH 0,05 M na tampa da placa de Petri.

Figura 5 - Fechamento das placas e

adição de 2 mL de HMDS.

Figura 6 - Eletrodo Orion 9409 e um

micro eletrodo calomelano de referência

4.1.6.3 Dosagem de fluoretono fêmur

Os fêmures foram pesados e levados para calcinação em um forno tipo mufla a 600°C overnight. As cinzas foram pesadas e pulverizadas com pistilo. Após virarem pó, foram pesadas alíquotas de 4-5 mg para análise do F- _{pelo método de}

difusão facilitada por HMDS, conforme descrito para o plasma, exceto pela pré- difusão e pelos padrões empregados na realização da curva de calibração (1,9; 3,8; 19 e 38 g F).

4.1.6.4 Dosagem de fluoretono rim

Após pesado, o rim foi homogeneizado em água deionizada, utilizando o Homogenizador Marconi, modelo MA 102. A homogenização foi conduzida por 2 minutos. Para análise de F- no rim, foi utilizado um volume da amostra correspondente a 100 mg de tecido renal. Esse volume foi pipetado em uma placa de Petri (Falcon 1007) e submetido à difusão facilitada por HMDS. A curva de calibração foi feita com 1,0 mL de soluções-padrão contendo 0,00475, 0,0095, 0,019, 0,095 e 0,19 µg F.

4.1.6.5 Dosagem de fluoreto na urina e na água

A concentração de F- presente na urina e na água de beber foram determinadas em duplicata, usando-se o eletrodo Orion 9609 após serem tamponadas com um volume idêntico de TISAB II (Tampão de ajuste da força iônica total), contendo CDTA (ácido ciclo-hexano diamino tetracético) 0,4%, pH 5,0. As amostras de urina foram deixadas à temperatura ambiente para descongelar durante a noite anterior à dosagem.

A curva de calibração foi realizada com os mesmos cuidados descritos para a validação da análise de F- _{no plasma. Foi feita uma curva de calibração com 1,0 mL}