3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.2 Yöntem
3.2.1 Survey çalışmaları
Survey çalışmaları 2016 ve 2017 yılları üretim sezonunda nohut ekiminden yaklaşık 30-50 gün sonra gelişme durumuna bağlı olarak Uşak, Kütahya, Denizli ve Isparta olmak üzere 4 farklı ilde yapılmıştır (Çizelge 3.1, Şekil 3.1).
Çizelge 3.1 Survey yapılan illerde 2016-2017 yıllarına ait nohut verileri (Anonim 2019b)
İl Ekim alanı (da)* Üretim miktarı (ton) Verim (kg/da)
2016 2017 2016 2017 2016 2017
Uşak 297.093 286.016 35.898 30.542 121 107
Kütahya 177.068 136.605 20.368 10.837 116 93 Isparta 151.749 134.407 17.346 14.048 114 105
Denizli 86.573 90.579 8.620 7.615 100 84
*Ekim alanlarının % 0,5’i survey planına dahil edilmiştir.
54
Şekil 3.1 Survey çalışmalarının yapıldığı iller
Surveyler esnasında her ilin en yoğun olarak nohut tarımı yapılan bölgelerinde her 20 km’de bir durulmuş, yolun sağ ve solundaki tarlaların ortasına doğru “Z” şeklinde gezilerek hastalıklı bitkiler toplanmıştır. Gezilen tarlalarda sararmış, solgun, ölü görülen bitkiler hastalıklı olarak kabul edilmiştir (Şekil 3.2).
Şekil 3.2 Survey yapılan illerde hastalık belirtisi gözlenen nohut tarlasının genel görüntüsü (a), hastalıklı bitki örneklerinin toplanması (b), nohut bitkisindeki kuruma ve yaprak dökülmesi (c), hastalıklı bitki köklerindeki lezyonlar (d)
55
Tarlaların büyüklüğüne bağlı olarak her tarladan en az 5’er (10 da’a kadar 5, 10-20 da arası 10, 20-50 da arası 15, 50 da’dan büyük tarlalardan 20-30 adet) bitki toplanmıştır.
2016-2017 yıllarında yürütülen tüm survey çalışmaları sonucunda toplamda 2703 da alanındaki 97 farklı nohut tarlasından 1751 adet hastalıklı bitki toplanmıştır (Çizelge 3.2). Toplanan bitkiler kök boğazının yukarısından kesildikten sonra kese kağıtlarına konulmuş ve etiket bilgileri yazılarak laboratuvara getirilmiştir. Tüm örnekler fungal izolasyon çalışmalarına kadar +4°C’de buzdolabında saklanmıştır.
Çizelge 3.2 Survey yapılan il/ilçelerden alınan örnek sayıları İl İlçe Örnek alınan
56
3.2.2 İzolasyon ve teşhis çalışmalarında kullanılan besi ortamları ve çözeltiler Bitki dokularından Rhizoctonia türlerinin izolasyonunda Patates Dekstroz Agar (PDA, Merck), Su agarı (SA), teşhis aşamasında çekirdek boyamaları ve anastomosis gruplarını belirleme çalışmalarında yumuşak PDA ve Safranin O çözeltileri, moleküler çalışmalarda ise TAE buffer ve agaroz jel kullanılmıştır. Bunların hazırlanışı aşağıda verilmiştir:
- Patates Dekstroz Agar (PDA) 1000 ml. PDA besi ortamı için;
Hazır PDA (Merck)……….39 g Distile su……….1000 ml
Karıştırılan malzemeler 121°C de 20 dakika otoklavda steril edildikten sonra 50 mg Streptomycin sulfate (antibiyotik) eklenmiştir.
- Su agarı (SA)
1000 ml. %1.5’lik SA ortamı için;
Agar (Merck)………...15 g Distile su………. 1000 ml
Karıştırılan malzemeler daha sonra 121°C de 20 dakika otoklavda steril edilmiştir.
- Yumuşak Patates Dekstroz Agar (PDA) 1000 ml. %0.5’lik yumuşak PDA besi ortamı için;
Hazır PDA (Merck)……….5 g Distile su……….….1000 ml
Karıştırılan malzemeler daha sonra 121°C de 20 dakika otoklavda steril edilmiştir.
57 - Safranin O
100 ml Safranin O çözeltisi için;
Safranin O (Sigma)…………6 ml KOH...10 ml Gliserin...5 ml
Distile su...79 ml
100 ml Safranin O çözeltisi hazırlamak için; bir erlenmayere saf su ile hazırlanmış
%0.5’lik Safranin O’dan 6 ml konulmuş ve üzerine yine saf su ile hazırlanmış 10 ml
%3’lük KOH çözeltisi, 5 ml gliserin ve 79 ml saf su ilave edilerek karıştırılmıştır (Sneh vd. 1994).
- TAE Buffer
1000 ml. 1X’lik TAE buffer için;
50X’lik TAE Buffer…………..20 ml Distile su………980 ml
Karıştırılan malzemeler oda sıcaklığında saklanmıştır.
- Agaroz Jel
100 ml. %1.5’lik Agaroz jel için;
Agaroz………...1.5 g 1X’lik TAE buffer………100 ml
Erlenmayerde karıştırılan malzemeler 2-3 dk. süreyle mikrodalga fırında kaynatılarak elektroforez tankına dökülmüş ve jel haline gelmesi beklenmiştir.
3.2.3 Rhizoctonia türlerinin bitki dokularından izolasyonu
Survey çalışmaları ile toplanan hastalıklı nohut bitkilerinin kökleri musluk suyu altında yıkanarak topraklarından arındırılmıştır. Daha sonra bitkilerin kök ve kök boğazından 0.2-0.5 cm boyundaki lezyonlu parçalar kesilerek yüzeysel dezenfeksiyon amacıyla
58
%1’lik sodyumhipoklorit (NaOCl) çözeltisinde 2 dakika tutulmuş ve bunu takiben 5 seri steril saf sudan geçirilmiştir. Daha sonra bitki parçaları steril filtre kağıtları arasında kurutularak PDA besi ortamı içeren petri kaplarına 5’er adet olacak şekilde konulmuştur (Şekil 3.3a). Bu petri kapları 24±1°C’de karanlık ortamda bir kaç gün inkübe edilmiştir. Gelişen hifler stereo-mikroskop altında incelenmiş ve Rhizoctonia benzeri fungusların hif uçları PDA ortamına aktarılarak saflaştırılmıştır (Şekil 3.3b).
İzolasyon işlemi sırasında Rhizoctonia benzeri funguslar izole edilmeye dikkat edilmiş, diğer fungus türleri saf dışı bırakılmıştır. Tüm izolatlar PDA besi ortamı içeren 6 cm çapındaki petri kaplarında +4°C’de (Şekil 3.3c), filtre kağıtlarında +4°C’de ve cam tüplerde buğday tohumlarına sardırılarak +4°C ve -20°C’de saklanmıştır (Şekil 3.3d).
Şekil 3.3 Fungal etmenlerin izolasyonu. Hastalıklı bitkilerin kök parçalarının PDA besi ortamına ekimi (a), saflaştırılan Rhizoctonia izolatı (b), izolatların PDA besi ortamında stoklanması (c), buğday tohumlarına sardırılarak stoklanmış izolatlar (d)
59 3.2.4 Rhizoctonia izolatlarının teşhisi
3.2.4.1 Klasik yöntemlerle tür teşhisi ve anastomosis gruplarının belirlenmesi Elde edilen fungusların ilk olarak cins düzeyinde teşhisleri yapılmıştır. Rhizoctonia spp.
(R. solani ya da binükleat Rhizoctonia) olduğu düşünülen fungusların ışık mikroskobu altında hif yapıları incelenmiş, sonrasında her bir hücredeki çekirdek sayıları dikkate alınarak izolatların multinükleat (MN) ve binükleat (BN) ayrımları yapılmıştır. Bunun için izolatlar lamelli su agarı ortamına transfer edilmiştir. Lamelli su agarı ortamı,
%95’lik etil alkole batırıldıktan sonra yakılarak steril edilen lamellerin, %0.5’lik yumuşak PDA ortamına daldırılıp %1.5’lik su agarı içeren petri kaplarına yerleştirilmesi ile hazırlanmıştır. Petriler 24±1°C’de karanlıkta 24-72 saat süreyle inkübe edilmiş ve inkübasyon süresi sonunda örnekler incelenmiştir. Bunun için bir lam üzerine bir damla
% 0.5’lik Safranin O çözeltisi damlatılmış, daha sonra lamelli su agarı ortamından alınan lamel, lamdaki çözelti üzerine yerleştirilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlarda hiflerdeki en az 15 hücrede çekirdek sayıları dikkate alınarak ışık mikroskobunda izolatların multinukleat ve binukleat ayrımları yapılmıştır (Bandoni 1979, Ogoshi vd. 1990, Carling ve Summer 1992, Karaca vd. 2002). Bu çalışma esnasında her bir izolat için üç petri kabı kullanılmıştır. R. bataticola (Sin:
Macrophomina phaseolina) izolatlarının ise kültürel gelişimleri gözlenerek ışık mikroskobu altında mikrosklerotları incelenmiş ve moleküler teşhis için saklanmıştır.
PDA besi ortamında geliştirilen tüm izolatlar, teşhis amacıyla kültürel özellikleri kaydedilerek morfolojik olarak incelenmiştir.
Multinükleat Rhizoctonia spp. izolatlarının anastomosis gruplarının belirlenmesi için, öncelikle test izolatları ve bu çalışma ile elde edilen izolatlar PDA besi ortamına aktarılıp 24±1°C’de karanlıkta inkübe edilmiştir. Bu şekilde aktifleştirilen test izolatları ve örnekler lamelli su agarı ortamına lamelin bir tarafında test izolatı, diğer tarafında ise örnek olacak şekilde inoküle edilmiştir (Şekil 3.4a, b). Petriler 24±1°C’de karanlıkta 24-72 saat süreyle inkübe edilmiş ve bu sürenin sonunda örnekler incelenmiştir (Şekil 3.4c). Bunun için, yine yukarıda bahsedildiği gibi, bir lam üzerine bir damla % 0.5’lik Safranin O çözeltisi damlatılmış, daha sonra lamelli su agarı ortamından alınan lamel, lamdaki çözelti üzerine yerleştirilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlarda hifler arasında anastomosis reaksiyonlarının (C0, C1, C2, C3) varlığı ışık mikroskobunda
60
incelenmiştir (Sneh vd. 1991, Sneh vd. 1996, Carling vd. 2002) (Şekil 3.4d). Bu çalışma esnasında her bir izolat için üç petri kabı kullanılmıştır. Binükleat Rhizoctonia izolatlarının klasik yöntemlerle anastomosis gruplarına ayırımı mümkün olmadığından bu izolatların teşhisi sadece moleküler yöntemler ile gerçekleştirilmiştir.
Şekil 3.4 Fungusların anastomosis gruplarının belirlenmesi çalışmaları. Lamelli su agarı ortamına fungus disklerinin yerleştirilmesi ve test izolatları ile karşılıklı ekim (a, b), fungus hiflerinin birbirine yaklaşması (c), anastomosis reaksiyonlarının mikroskop altında incelenmesi (d)
İzole edilen Rhizoctonia izolatlarının anastomosis gruplarının tespitinde kullanılan multinükleat Rhizoctonia anastomosis gruplarına ait test izolatları 3.1.1’de belirtilen kaynaklardan temin edilmiş olup test izolatları ile ilgili bilgileri içeren liste Çizelge 3.3’de verilmiştir.
61
Çizelge 3.3 Anastomosis gruplarının tespitinde kullanılan multinükleat Rhizoctonia test izolatlarının numaraları ve izole edildigi bölgeler
Anastomosis Grubu Intraspesifik Grup İzolat Numarası Cografi Kaynak
AG 1 IA CS-KA Japonya
AG 1 IB B-19 Japonya
AG 1 IC BV-7 Japonya
AG 2-1 PS-4 Japonya
AG 2-2 IIIB C-116 Japonya
AG 2-2 IV RI-64 Japonya
AG 2 tip 3 R6 Japonya
AG 2 t 2tR Japonya
AG 2 2III B CS-96 Japonya
AG 3 ST-11-6 Japonya
AG 4 HG I AH-1 Japonya
AG 4 HG II Rh-65 Japonya
AG 5 GM-10 Japonya
AG 6 GV NKN 2-1 Japonya
AG 6 HG I OHT 1-1 Japonya
AG 7-1 92PT Japonya
AG 7-2 91ST Japonya
AG 8 W 565 Japonya
AG 9 S 21 Japonya
AG 10 W 395 Japonya
AG 11 Roth 26 Japonya
AG 12 WDa Japonya
AG 13 Hud 2-1 Japonya
AG BI SN 2-1 Japonya
3.2.4.2 Moleküler yöntemlerle tür teşhisi
Klasik yöntemlerle anastomosis grupları düzeyinde yapılan teşhisi teyid etmek, bu anastomosis gruplarının alt gruplarını ve binükleat Rhizoctonia izolatlarının anastomosis gruplarını belirlemek, R. bataticola izolatlarının kesin tanısını yapmak, sekans
62
sonucunda elde edilen verileri NCBI veri tabanına işlemek ve mevcut veriler ile referans izolatları kıyaslayarak akrabalık derecelerini belirlemek gibi nedenlerden dolayı izolatların moleküler düzeyde tür teşhisleri yapılmıştır.
Bu amaçla, ilk olarak PDA besi ortamında geliştirilen 5-7 günlük kültür ortamlarından alınan yaklaşık 300 mg’lık miselyumlar petri kaplarından nazik bir şekilde (Şekil 3.5a) kazınarak 1.5 ml’lik steril eppendorf tüplere aktarılmıştır (Şekil 3.5b). Daha sonra genomik DNA, Plant/Fungi DNA izolasyon kiti (Norgen, Biotek) kullanılarak üretici firmanın protokolüne göre ekstrakte edilmiş ve kullanılıncaya kadar -20°C’de saklanmıştır.
Norgen genomik DNA Plant/Fungi DNA izolasyon kitinin protokolü modifiye edilerek aşağıda belirtilen şekilde uygulanmıştır:
1. İzolatların miselyumlarını içeren eppendorf tüplerin içerisine 550 µl lysis buffer eklenmiştir (Şekil 3.5c). Tüpler vorteks cihazında karıştırılarak sıvının dokuya işlemesi sağlanmıştır (Şekil 3.5d).
2. Eppendorf tüpler 65°C’de 15 dakika inkübasyona bırakılmıştır (Şekil 3.5e). Bu süre içerisinde tüpler ters düz edilerek homojenlik sağlanmıştır.
3. Tüpler 2000 rpm’de 1 dakika süreyle santrifüj edilmiştir (Şekil 3.5f). Üstte biriken sıvı (supernate) otomatik mikropipet yardımıyla temiz eppendorf tüplere aktarılmıştır.
4. Her bir eppendorf tüpe 100 µl binding buffer eklenmiştir. Bu aşamada tüpler 5 dakika süreyle buz üzerinde bekletilmiştir.
5. Tüplerdeki tüm sıvı otomatik mikropipet ile çekilerek Clear oring filtre içeren tüplere aktarılmıştır.
6. Tüpler 14 000 rpm’de 2 dakika süreyle santrifüj edilmiştir.
7. Clear oring filtre atılarak, altta biriken sıvı üzerine 150 µl %70’lik etanol eklenmiştir. İyice karışmasını sağlamak için otomatik mikropipet ile al-ver işlemi yapılmıştır.
8. Tüp içerisindeki tüm sıvı otomatik mikropipet ile çekilerek Grey oring filtre içeren tüplere aktarılmıştır.
9. Tüpler 10 000 rpm’de 1 dakika süreyle santrifüj edilmiştir.
10. Altta biriken sıvı dökülerek, aynı filtre üzerine 500µl Solution WN eklenmiştir.
63
11. Tüpler 14 000 rpm’de 1 dakika süreyle santrifüj edilmiştir.
12. Altta biriken sıvı dökülerek yine aynı filtre üzerine 500µl Wash Solution A eklenmiştir.
13. Tüpler 14 000 rpm’de 1 dakika süreyle santrifüj edilmiştir.
14. Üstteki filtreler alınarak temiz Collection tüplerin üzerine yerleştirilmiştir.
15. Etanolün tamamen temizlenmesi için 14 000 rpm’de 1 dakika süreyle santrifüj edilmiştir.
16. Filtreler temiz eppendorf tüplere yerleştirilerek her birinin üzerine 50’şer µl Elution buffer eklenmiştir.
17. Tüpler 14 000 rpm’de 1 dakika süreyle santrifüj edilmiştir.
18. Tüm örnekler -20°C’de stoklanmıştır.
Şekil 3.5 Fungusların genomik DNA izolasyonu. Fungus hiflerinin kazınması (a), kazınan hiflerin eppendorf tüplere alınması (b), miselyum içeren tüplere lysis buffer eklenmesi (c), tüplerin vorteks cihazı ile karıştırılması (d), tüplerin inkübasyonu (e), tüplerin santrifüj edilmesi (f)
64
Elde edilen genomik DNA’ların ITS bölgelerinin amplifikasyonu için, ITS-1 (5’ TCC GTA GGT GAA CCT GCGG 3’) ve ITS-4 (5’ TCC TCC GCT TAT TGA TATGC 3’) (White vd. 1990) primerleri kullanılmıştır. PCR amplifikasyon reaksiyonunda bütün bileşenleri içeren PCR Mix (Norgen, Biotek) kullanılmıştır. Son hacmi 50 µl olacak şekilde PCR reaksiyon karışımı; 25 µl PCR Mix, 10 µM’lik her bir primerden 2 µl, 16 µl çift distile saf su ve 5 µl DNA örneği bileşimlerinden oluşmuştur. PCR amplifikasyon işlemi, thermal cycler cihazında aşağıdaki döngüler kullanılarak yapılmıştır.
95 °C 2 dk.
95 °C 20 sn
55 °C 30sn 35 döngü 72 °C 45 sn.
72 °C 5 dk.
PCR ürünleri %1,5’luk agaroz jelde GelRed ile boyanarak 100 volt’ta bir saat süreyle koşturulmuş (Şekil 3.6), sonrasında UV ışık altında incelenmiştir. LowRanger 100 bp DNA ladder (Norgen, Biotek) kullanılmıştır.
Şekil 3.6 PCR ürünlerinin agaroz jelde koşturulması
65
PCR ürünleri hizmet alımı olarak Altıgenbio Life Science (İzmir, Türkiye) firmasınca sekansa tabi tutulmuştur. Örneklere ait DNA sekansları NCBI’de (National Center for Biotechnology Information) Blast analizine tabi tutularak diğer Rhizoctonia türlerine ait DNA sekanslarıyla karşılaştırılmıştır.
3.2.5 Rhizoctonia izolatlarının patojenisite testleri
Patojenisite testlerinde kullanılacak olan hassas nohut tohumlarının (ILC482) yüksek oranda çimlenebilmesini sağlamak amacıyla öncelikle çimlenme testi uygulanmıştır.
3.2.5.1 Nohut tohumlarının çimlenme testi
Tohumların yüzeysel dezenfeksiyonunda kullanılacak uygun NaOCl oranı ve bekletme süresinin belirlenmesi için tohumlara 2 farklı NaOCl oranı (%1 ve %2) ve 3 farklı süre (1, 3 ve 5 dk.) uygulanmıştır. Tohumlar her muameleden sonra 3 defa steril saf sudan geçirilerek %2’lik su agarı içeren 2 petri kabına 10’ar adet olacak şekilde yerleştirilmiştir. Kontrol olarak ise tohumlar NaOCl’ye batırılmadan steril saf suda 3 dk.
bekletilerek 2 petriye yine 10’ar tohum olacak şekilde ekilmiştir. Petriler parafilm ile sarılarak 24±2°C’de 12 saat aydınlık 12 saat karanlık periyotta 6-7 gün süreyle inkübasyona bırakılmıştır. Kontrol petrilerinde herhangi bir kontaminasyon ve çimlenme sorunu oluşmadığı için tüm petrilerdeki tohumlar değerlendirilmiştir.
Çimlenen ve çimlenmeyen tohumlar sayılarak yüzde olarak hesaplanmıştır. Sonraki çalışmalarda nohut tohumlarında en yüksek çimlenme oranının tespit edildiği yüzeysel dezenfeksiyon uygulaması esas alınmıştır.
3.2.5.2 Rhizoctonia izolatlarının in vitro patojenisite testleri
In vitro patojenisite testi, bitkide hipokotil enfeksiyonunun esas alındığı, petri kaplarında uygulanan ve kısa sürede çok sayıda izolatın testlenmesine imkan veren bir testleme yöntemi olduğu için tercih edilmiştir.
Patojenisite testlerinin sağlıklı sonuçlar vermesi için genç fungus kültürü gerektiğinden, ilk olarak stok kültürlerden yeniden PDA içeren petri kaplarına ekim yapılmıştır.
Karanlık ortamda 25±2°C’de 7-10 gün süreyle inkübasyona bırakıldıktan sonra farklı izolatları içeren her petriden 4 mm çapındaki mantar delici yardımıyla 3’er parça
66
alınmıştır. Her bir parça %2’lik su agarı içeren petri kaplarının ortasına konularak 48 saat süreyle 24±1°C’de inkübasyona bırakılmıştır. Nohut tohumları (ILC482), lekesiz ve sağlam olmasına dikkat edilerek seçilmiş ve yüzeysel dezenfeksiyon amacıyla %1’lik NaOCl’de 5 dk. tutularak 3 defa steril saf sudan geçirilmiştir. Daha sonra bu tohumlar her bir petriye 7’şer adet olacak şekilde fungus parçasının etrafına eşit uzaklıkta yerleştirilmiştir (Şekil 3.7a). Her fungus için, 3’er petri kabı kullanılmış ve her petride 7’şer tohum olmak üzere toplamda 21 adet tohum yerleştirilmiştir. Kontrol olarak ise, her bir deneme için yine 3 adet petri kabının ortasına fungus içermeyen, sadece su agarı parçası yerleştirilmiş ve bunun etrafına yine dezenfekte edilen 7’şer adet tohum konulmuştur. Tüm petriler parafilm ile sarılarak 24±1°C’de (12 saat aydınlık, 12 saat karanlık) inkübasyona bırakılmıştır (Şekil 3.7b).
Şekil 3.7 In vitro patojenisite testinde fungus diskinin etrafına yerleştirilen nohut tohumları (a), inkübasyona bırakılan petri kapları (b)
İnkübasyonun 10-12. günü sonunda petrilerin değerlendirilmesine geçilmiştir. Bunun için, çimlenen tohumların hipokotilleri incelenerek, Ichielevich-Auster vd.’nin (1985) hipokotildeki nekrotik alan büyüklüğünün esas alındığı 0-5 skalasına (Çizelge 3.4, Şekil 3.8) göre hastalık değerlendirmesi yapılmıştır.
67
Çizelge 3.4 Rhizoctonia izolatlarının in vitro patojenisite testinde hastalık değerlendirmesinde kullanılan 0-5 skalası (Ichielevich-Auster vd.1985)
Skala Değeri Tanı
0 Sağlıklı bitki
1 %1-10 hipokotil enfeksiyonu 2 %11-30 hipokotil enfeksiyonu 3 %31-50 hipokotil enfeksiyonu 4 %51-80 hipokotil enfeksiyonu
5 Ölü bitki (tamamen hipokotil enfeksiyonu)
Şekil 3.8 Rhizoctonia izolatlarının in vitro patojenisite testi hastalık değerlendirmesinde kullanılan 0-5 skalası
3.2.5.3 Rhizoctonia izolatlarının in vivo patojenisite testleri
In vitro patojenisite testleri sonucunda patojen olarak tespit edilen Rhizoctonia tür ve farklı anastomosis gruplarına ait izolatlar arasından seçilen, virülensliği en yüksek izolatlar ile saksı denemesi şeklinde in vivo patojenisite testleri uygulanmıştır. Bunun için R. solani AG-4’ü temsilen U12, R. solani AG-5’i temsilen IS23, binükleat Rhizoctonia AG-K’yı temsilen IS18 ve R. bataticola’yı temsilen D33 nolu izolatlar seçilmiştir.
İnokulum hazırlanmasında Sneh vd.’nin (1991) buğday tohumuna sardırma metodu kullanılmıştır. Buna göre, buğday tohumları 1 mg/ml oranında kloramfenikol antibiyotiği içeren saf suda kaynatılıp bu çözelti içerisinde bir gece bekletilmiştir (Şekil 3.9a, b). Daha sonra süzülen tohumlar kapaklı cam tüpler içerisine alınarak, peş peşe iki gün 121°C’de 1 saat süreyle otoklav cihazında steril edilmiştir (Şekil 3.9c, d, e). Ertesi gün bu tüpler içerisine daha önceden PDA besi ortamında 5-6 gün süreyle geliştirilen
68
Rhizoctonia izolatlarının hif uçlarından alınan 5 mm çaplı agar diskleri yerleştirilerek 24±1°C’de 15 -20 gün inkübasyona bırakılmış ve hiflerin buğday tohumlarını sarması beklenmiştir (Şekil 3.9f, g, h).
Şekil 3.9 Rhizoctonia izolatları ile inokulum hazırlanması. Buğday tohumlarının kloramfenikol ile mumale edilmesi (a), tohumların kaynatılması (b), tohumların filtre kağıdında kurutulması (c), tohumların cam tüplere alınması (d), cam tüplerin otoklav için hazırlanması (e), hif içeren PDA disklerinin tüplere konulması (f), inkübasyon aşaması (g), hiflerin buğday tohumlarını sarması (h)
In vivo patojenisite testlerinde inokulumun toprağa bulaştırılması için ise ilk olarak metot optimizasyonu yapılmıştır. Bunun için, 10 cm çaplı steril saksılara yaklaşık 1/3 oranında perlit, üzerine 2/3 oranında otoklavda steril edilmiş bahçe toprağı+ince kum (2:1 v/v) karışımı doldurulmuştur. İnokulumu toprağa bulaştırmak için kullanılan birinci metotta; izolatların hifleri ile kolonize edilerek bulaştırılmış 5 adet buğday tohumu saksıdaki toprak üzerine yerleştirilerek 20-25 ml saf su ile sulanmıştır (Şekil 3.10a).
Üzeri temiz bir polietilen torba ile kapatılan saksılar (Şekil 3.10b), 5 gün boyunca 20-25°C’de inkübasyona bırakılarak izolatın hiflerinin toprağı sarması beklenmiştir (Şekil 3.10c). Bu sürenin sonunda her saksıya yüzeysel dezenfeksiyon amacıyla %1’lik NaOCl’de 5 dk. tutularak 3 defa steril saf sudan geçirilen 5’er adet nohut tohumu
69
(ILC482) ekilmiş ve tohumların üzeri daha önceden hazırlanan steril bahçe toprağı+ince kum karışımı ile kapatılmıştır (Şekil 3.10d, e).
Şekil 3.10 Patojenisite testleri için metot optimizasyonu. İnokulum içeren buğday tohumlarının saksıya bırakılması (a), polietilen torba ile kapatılan saksılar (b), hiflerin toprağı sarması (c), iki farklı metot ile nohutların ekilmesi (d), toprak ile kapatılan saksıların inkübasyonu (e)
İkinci metot olarak ise steril toprak karışımı saksılara doldurulduktan sonra nohutlar ekilmiş ve eş zamanlı olarak her tohumun yanına izolat hifleri ile kolonize edilerek bulaştırılmış buğday tohumu yerleştirilerek toprak kapatılmıştır. Her iki metot için de kontrol olarak steril toprak içeren saksılara % 1’lik NaOCl ile 5 dakika dezenfekte edilmiş sağlıklı tohumlar ekilmiştir. Tüm saksılar iklim odasında 20-25°C’de gelişmeye bırakılmıştır. Denemeler her bir metot için 3 tekerrürlü olarak kurulmuştur.
In vitro patojenisite testleri sonuçlarına göre seçilen en yüksek hastalık şiddetine sahip Rhizoctonia izolatları ile in vivo patojenisite testleri, ikinci metot uygulanarak yapılmıştır. Denemeler tesadüf blokları deneme desenine göre 4 tekerrürlü olarak
70
yürütülmüş ve gelişme durumuna göre ekimden yaklaşık 30 gün sonra bitkiler sökülerek kökleri incelenmiştir (Paulitz vd. 2003).
Hastalık değerlendirmeleri, sonuçların daha sağlıklı olması amacıyla Kim vd. (1997) ve Demirci (1998)’de yer alan skalalar birleştirilip modifiye edilerek oluşturulan 0-4 skalasına göre yapılmıştır (Çizelge 3.5).
Çizelge 3.5 Rhizoctonia izolatlarının in vivo patojenisite testleri değerlendirilmesinde kullanılan 0-4 skalası
Skala Değeri Tanı
0 Belirti yok (kök ve kökboğazı)
1 Hafif renksizleşme veya tohumdan çıkan kökler 3 cm’den daha kısa 2 Bir ya da daha fazla küçük lezyon (<0,5 cm) veya tohumdan çıkan
kökler 2cm’den daha kısa
3 Bir ya da daha fazla büyük lezyon (>0,5 cm) veya tohumdan çıkan kökler 1 cm’den daha kısa
4 Şiddetli lezyon, tamamen ölmüş veya köksüz fideler
İnokule edilen fungusların teyidi amacıyla enfekteli nohut bitkilerinin kök kısımlarından, çıkış yapmayan tohumlardan ve kontrol bitkilerinin köklerinden reizolasyonlar yapılmıştır.
3.2.6 Çeşit reaksiyonu çalışmaları
In vitro patojenisite testleri ile her bir Rhizoctonia tür ve anastomosis grubunu temsilen seçilen U12, IS23, IS18 ve D33 nolu izolatlar in vivo patojenisite testi ile paralel sonuçlar vermişlerdir. Bu izolatların yüksek oranda virülent oldukları teyid edilmiş ve bu izolatlar çeşit reaksiyonu çalışmalarında kullanılmıştır (Çizelge 3.6).
71
Çizelge 3.6 Çeşit reaksiyonu çalışmalarında kullanılan izolatların hastalık şiddeti değerleri
İzolat Türü İzolat No
In vitro Patojenisite
Hastalık Şiddeti (%) In vivo Patojenisite Hastalık Şiddeti (%)
R. solani AG-4 U12 100.00 100.00
R. solani AG-5 IS23 92.30 98.00
BN Rhizoctonia AG-K IS18 76.10 76.60
R. bataticola D33 100.00 86.70
Çeşit reaksiyonu çalışmalarında kullanılan nohut çeşitleri Çizelge 3.7’de verilmiştir.
Çizelge 3.7 Çeşit reaksiyonları çalışmalarında kullanılan nohut çeşitleri
Çeşit Adı Tescil Ettiren Kuruluş Tescil Yılı
Hisar Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2008 Azkan Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2009 Çakır Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2012 Akça Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2013
Sarı98 Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü 1998
Diyar95 GAP Uluslararası Tarımsal Araştırma ve Eğitim
Merkezi Müdürlüğü 1995
İnci Doğu Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2003
İnci Doğu Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2003