Rhizoctonia izolatlarının patojenisite testleri

Patojenisite testlerinde kullanılacak olan hassas nohut tohumlarının (ILC482) yüksek oranda çimlenebilmesini sağlamak amacıyla öncelikle çimlenme testi uygulanmıştır.

3.2.5.1 Nohut tohumlarının çimlenme testi

Tohumların yüzeysel dezenfeksiyonunda kullanılacak uygun NaOCl oranı ve bekletme süresinin belirlenmesi için tohumlara 2 farklı NaOCl oranı (%1 ve %2) ve 3 farklı süre (1, 3 ve 5 dk.) uygulanmıştır. Tohumlar her muameleden sonra 3 defa steril saf sudan geçirilerek %2’lik su agarı içeren 2 petri kabına 10’ar adet olacak şekilde yerleştirilmiştir. Kontrol olarak ise tohumlar NaOCl’ye batırılmadan steril saf suda 3 dk.

bekletilerek 2 petriye yine 10’ar tohum olacak şekilde ekilmiştir. Petriler parafilm ile sarılarak 24±2°C’de 12 saat aydınlık 12 saat karanlık periyotta 6-7 gün süreyle inkübasyona bırakılmıştır. Kontrol petrilerinde herhangi bir kontaminasyon ve çimlenme sorunu oluşmadığı için tüm petrilerdeki tohumlar değerlendirilmiştir.

Çimlenen ve çimlenmeyen tohumlar sayılarak yüzde olarak hesaplanmıştır. Sonraki çalışmalarda nohut tohumlarında en yüksek çimlenme oranının tespit edildiği yüzeysel dezenfeksiyon uygulaması esas alınmıştır.

3.2.5.2 Rhizoctonia izolatlarının in vitro patojenisite testleri

In vitro patojenisite testi, bitkide hipokotil enfeksiyonunun esas alındığı, petri kaplarında uygulanan ve kısa sürede çok sayıda izolatın testlenmesine imkan veren bir testleme yöntemi olduğu için tercih edilmiştir.

Patojenisite testlerinin sağlıklı sonuçlar vermesi için genç fungus kültürü gerektiğinden, ilk olarak stok kültürlerden yeniden PDA içeren petri kaplarına ekim yapılmıştır.

Karanlık ortamda 25±2°C’de 7-10 gün süreyle inkübasyona bırakıldıktan sonra farklı izolatları içeren her petriden 4 mm çapındaki mantar delici yardımıyla 3’er parça

66

alınmıştır. Her bir parça %2’lik su agarı içeren petri kaplarının ortasına konularak 48 saat süreyle 24±1°C’de inkübasyona bırakılmıştır. Nohut tohumları (ILC482), lekesiz ve sağlam olmasına dikkat edilerek seçilmiş ve yüzeysel dezenfeksiyon amacıyla %1’lik NaOCl’de 5 dk. tutularak 3 defa steril saf sudan geçirilmiştir. Daha sonra bu tohumlar her bir petriye 7’şer adet olacak şekilde fungus parçasının etrafına eşit uzaklıkta yerleştirilmiştir (Şekil 3.7a). Her fungus için, 3’er petri kabı kullanılmış ve her petride 7’şer tohum olmak üzere toplamda 21 adet tohum yerleştirilmiştir. Kontrol olarak ise, her bir deneme için yine 3 adet petri kabının ortasına fungus içermeyen, sadece su agarı parçası yerleştirilmiş ve bunun etrafına yine dezenfekte edilen 7’şer adet tohum konulmuştur. Tüm petriler parafilm ile sarılarak 24±1°C’de (12 saat aydınlık, 12 saat karanlık) inkübasyona bırakılmıştır (Şekil 3.7b).

Şekil 3.7 In vitro patojenisite testinde fungus diskinin etrafına yerleştirilen nohut tohumları (a), inkübasyona bırakılan petri kapları (b)

İnkübasyonun 10-12. günü sonunda petrilerin değerlendirilmesine geçilmiştir. Bunun için, çimlenen tohumların hipokotilleri incelenerek, Ichielevich-Auster vd.’nin (1985) hipokotildeki nekrotik alan büyüklüğünün esas alındığı 0-5 skalasına (Çizelge 3.4, Şekil 3.8) göre hastalık değerlendirmesi yapılmıştır.

67

Çizelge 3.4 Rhizoctonia izolatlarının in vitro patojenisite testinde hastalık değerlendirmesinde kullanılan 0-5 skalası (Ichielevich-Auster vd.1985)

Skala Değeri Tanı

0 Sağlıklı bitki

1 %1-10 hipokotil enfeksiyonu 2 %11-30 hipokotil enfeksiyonu 3 %31-50 hipokotil enfeksiyonu 4 %51-80 hipokotil enfeksiyonu

5 Ölü bitki (tamamen hipokotil enfeksiyonu)

Şekil 3.8 Rhizoctonia izolatlarının in vitro patojenisite testi hastalık değerlendirmesinde kullanılan 0-5 skalası

3.2.5.3 Rhizoctonia izolatlarının in vivo patojenisite testleri

In vitro patojenisite testleri sonucunda patojen olarak tespit edilen Rhizoctonia tür ve farklı anastomosis gruplarına ait izolatlar arasından seçilen, virülensliği en yüksek izolatlar ile saksı denemesi şeklinde in vivo patojenisite testleri uygulanmıştır. Bunun için R. solani AG-4’ü temsilen U12, R. solani AG-5’i temsilen IS23, binükleat Rhizoctonia AG-K’yı temsilen IS18 ve R. bataticola’yı temsilen D33 nolu izolatlar seçilmiştir.

İnokulum hazırlanmasında Sneh vd.’nin (1991) buğday tohumuna sardırma metodu kullanılmıştır. Buna göre, buğday tohumları 1 mg/ml oranında kloramfenikol antibiyotiği içeren saf suda kaynatılıp bu çözelti içerisinde bir gece bekletilmiştir (Şekil 3.9a, b). Daha sonra süzülen tohumlar kapaklı cam tüpler içerisine alınarak, peş peşe iki gün 121°C’de 1 saat süreyle otoklav cihazında steril edilmiştir (Şekil 3.9c, d, e). Ertesi gün bu tüpler içerisine daha önceden PDA besi ortamında 5-6 gün süreyle geliştirilen

68

Rhizoctonia izolatlarının hif uçlarından alınan 5 mm çaplı agar diskleri yerleştirilerek 24±1°C’de 15 -20 gün inkübasyona bırakılmış ve hiflerin buğday tohumlarını sarması beklenmiştir (Şekil 3.9f, g, h).

Şekil 3.9 Rhizoctonia izolatları ile inokulum hazırlanması. Buğday tohumlarının kloramfenikol ile mumale edilmesi (a), tohumların kaynatılması (b), tohumların filtre kağıdında kurutulması (c), tohumların cam tüplere alınması (d), cam tüplerin otoklav için hazırlanması (e), hif içeren PDA disklerinin tüplere konulması (f), inkübasyon aşaması (g), hiflerin buğday tohumlarını sarması (h)

In vivo patojenisite testlerinde inokulumun toprağa bulaştırılması için ise ilk olarak metot optimizasyonu yapılmıştır. Bunun için, 10 cm çaplı steril saksılara yaklaşık 1/3 oranında perlit, üzerine 2/3 oranında otoklavda steril edilmiş bahçe toprağı+ince kum (2:1 v/v) karışımı doldurulmuştur. İnokulumu toprağa bulaştırmak için kullanılan birinci metotta; izolatların hifleri ile kolonize edilerek bulaştırılmış 5 adet buğday tohumu saksıdaki toprak üzerine yerleştirilerek 20-25 ml saf su ile sulanmıştır (Şekil 3.10a).

Üzeri temiz bir polietilen torba ile kapatılan saksılar (Şekil 3.10b), 5 gün boyunca 20-25°C’de inkübasyona bırakılarak izolatın hiflerinin toprağı sarması beklenmiştir (Şekil 3.10c). Bu sürenin sonunda her saksıya yüzeysel dezenfeksiyon amacıyla %1’lik NaOCl’de 5 dk. tutularak 3 defa steril saf sudan geçirilen 5’er adet nohut tohumu

69

(ILC482) ekilmiş ve tohumların üzeri daha önceden hazırlanan steril bahçe toprağı+ince kum karışımı ile kapatılmıştır (Şekil 3.10d, e).

Şekil 3.10 Patojenisite testleri için metot optimizasyonu. İnokulum içeren buğday tohumlarının saksıya bırakılması (a), polietilen torba ile kapatılan saksılar (b), hiflerin toprağı sarması (c), iki farklı metot ile nohutların ekilmesi (d), toprak ile kapatılan saksıların inkübasyonu (e)

İkinci metot olarak ise steril toprak karışımı saksılara doldurulduktan sonra nohutlar ekilmiş ve eş zamanlı olarak her tohumun yanına izolat hifleri ile kolonize edilerek bulaştırılmış buğday tohumu yerleştirilerek toprak kapatılmıştır. Her iki metot için de kontrol olarak steril toprak içeren saksılara % 1’lik NaOCl ile 5 dakika dezenfekte edilmiş sağlıklı tohumlar ekilmiştir. Tüm saksılar iklim odasında 20-25°C’de gelişmeye bırakılmıştır. Denemeler her bir metot için 3 tekerrürlü olarak kurulmuştur.

In vitro patojenisite testleri sonuçlarına göre seçilen en yüksek hastalık şiddetine sahip Rhizoctonia izolatları ile in vivo patojenisite testleri, ikinci metot uygulanarak yapılmıştır. Denemeler tesadüf blokları deneme desenine göre 4 tekerrürlü olarak

70

yürütülmüş ve gelişme durumuna göre ekimden yaklaşık 30 gün sonra bitkiler sökülerek kökleri incelenmiştir (Paulitz vd. 2003).

Hastalık değerlendirmeleri, sonuçların daha sağlıklı olması amacıyla Kim vd. (1997) ve Demirci (1998)’de yer alan skalalar birleştirilip modifiye edilerek oluşturulan 0-4 skalasına göre yapılmıştır (Çizelge 3.5).

Çizelge 3.5 Rhizoctonia izolatlarının in vivo patojenisite testleri değerlendirilmesinde kullanılan 0-4 skalası

Skala Değeri Tanı

0 Belirti yok (kök ve kökboğazı)

1 Hafif renksizleşme veya tohumdan çıkan kökler 3 cm’den daha kısa 2 Bir ya da daha fazla küçük lezyon (<0,5 cm) veya tohumdan çıkan

kökler 2cm’den daha kısa

3 Bir ya da daha fazla büyük lezyon (>0,5 cm) veya tohumdan çıkan kökler 1 cm’den daha kısa

4 Şiddetli lezyon, tamamen ölmüş veya köksüz fideler

İnokule edilen fungusların teyidi amacıyla enfekteli nohut bitkilerinin kök kısımlarından, çıkış yapmayan tohumlardan ve kontrol bitkilerinin köklerinden reizolasyonlar yapılmıştır.