3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.2 Yöntem
3.2.6 Çeşit reaksiyonu çalışmaları
In vitro patojenisite testleri ile her bir Rhizoctonia tür ve anastomosis grubunu temsilen seçilen U12, IS23, IS18 ve D33 nolu izolatlar in vivo patojenisite testi ile paralel sonuçlar vermişlerdir. Bu izolatların yüksek oranda virülent oldukları teyid edilmiş ve bu izolatlar çeşit reaksiyonu çalışmalarında kullanılmıştır (Çizelge 3.6).
71
Çizelge 3.6 Çeşit reaksiyonu çalışmalarında kullanılan izolatların hastalık şiddeti değerleri
İzolat Türü İzolat No
In vitro Patojenisite
Hastalık Şiddeti (%) In vivo Patojenisite Hastalık Şiddeti (%)
R. solani AG-4 U12 100.00 100.00
R. solani AG-5 IS23 92.30 98.00
BN Rhizoctonia AG-K IS18 76.10 76.60
R. bataticola D33 100.00 86.70
Çeşit reaksiyonu çalışmalarında kullanılan nohut çeşitleri Çizelge 3.7’de verilmiştir.
Çizelge 3.7 Çeşit reaksiyonları çalışmalarında kullanılan nohut çeşitleri
Çeşit Adı Tescil Ettiren Kuruluş Tescil Yılı
Hisar Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2008 Azkan Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2009 Çakır Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2012 Akça Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2013
Sarı98 Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü 1998
Diyar95 GAP Uluslararası Tarımsal Araştırma ve Eğitim
Merkezi Müdürlüğü 1995
İnci Doğu Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2003 Hasanbey Doğu Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2011
Aksu Doğu Akdeniz Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma
Enstitüsü 2009
Akçin Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü 1991 Gökçe Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü 1997 Uzunlu99 Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü 1999 Er99 Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü 1999 Küsmen99 Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü 1999 Dikbaş Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü 2006 Çağatay Karadeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2001 Sezenbey Karadeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2012 Zuhal Karadeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü 2012
72
Çeşit reaksiyonu çalışmaları in vitro ve in vivo olmak üzere iki farklı metot uygulanarak tesadüf blokları deneme desenine göre 4 tekerrürlü olarak gerçekleştirilmiştir.
In vitro çeşit reaksiyonu çalışmaları, 18 nohut çeşidinin tümünde 3.2.5.2’de belirtildiği gibi in vitro patojenisite testlerinde uygulanan metot ve skala kullanılarak laboratuvar koşullarında gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.11).
Şekil 3.11 In vitro çeşit reaksiyonu çalışmaları
In vivo çeşit reaksiyonu çalışmaları ise 9 nohut çeşidinde (Azkan, Çakır, Akça, Gökçe, Çağatay, İnci, Aksu, Sarı98 ve Uzunlu99) 3.2.5.3’te belirtilen in vivo patojenisite testlerinde uygulanan ikinci metot (inokulum ve tohum eşzamanlı), değerlendirmede ise Çizelge 3.5’teki skala kullanılarak uygulanmıştır (Şekil 3.12).
Şekil 3.12 In vivo çeşit reaksiyonu çalışmaları. Nohut tohumları ve inokulumun saksılara ekilmesi (a), saksıların toprak ile kapatılarak inkübasyona bırakılması (b)
73 3.2.7 Verilerin değerlendirilmesi
3.2.7.1 Hastalık şiddeti değerinin hesaplanması
Patojenisite testleri ve çeşit reaksiyonu çalışmaları ile elde edilen skala değerleri üzerinden Townsend-Heuberger formülüne göre yüzde hastalık şiddetleri hesaplanmıştır (Townsend-Heuberger 1943). Buna göre;
Hastalık Şiddeti (%) = Σ(nxV/ZxN)x100
n: skalada farklı hastalık derecesine giren bitki sayısı, V: skala değeri,
Z: en yüksek skala değeri,
N: gözlem yapılan toplam bitki sayısı
3.2.7.2 Virülenslik ve reaksiyon tipi değerlendirmesi
Patojenisite testlerinde elde edilen hastalık şiddeti değerleri %0-20 arasında olan izolatlar düşük derecede virülent (DDV), %20.1-50.0 arasında olanlar orta derecede virülent (ODV), %50.1-100 arasında olanlar ise yüksek derecede virülent (YDV) olarak değerlendirilmiştir.
Çeşit reaksiyonu çalışmalarında hem in vitro hem de in vivo çalışmalarında reaksiyon tipi değerlendirmesinde ise, hastalık şiddeti değerleri %0-30 arasında olan çeşitler dayanıklı, %30.1-50.0 arasında olanlar tolerant, %50.1-100 arasında olanlar ise hassas olarak değerlendirilmiştir.
3.2.7.3 İstatistik analizi
Patojenisite testlerinde ve çeşit reaksiyonu çalışmalarında yapılan değerlendirmeler sonrasında elde edilen sonuçlar, izolatlar ve çeşitler arasındaki farklılığın ortaya konulması için IBM SPSS 22 istatistik programı kullanılarak varyans analizi ve Duncan (p≤0.05) testine tabi tutulmuştur. Analiz öncesi izolatların hastalık şiddeti yüzde değerleri açı değerine dönüştürülmüştür.
74 3.2.7.4 Filogenetik analiz
İzolatlar arasındaki genetik farklılığın ortaya konulması amacıyla oluşturulan filogenetik ağaçlar, sekans analizi yapılan genomik DNA’ların baz dizilimleri kullanılarak MEGA 10.0.5 programı ile neighbor-joining bootstrap metodu uygulanarak elde edilmiştir.
75 tarladan 1545 adet hastalıklı bitki örneği toplanmıştır. Bu bitkilerden yapılan izolasyon işlemleri sonucunda, Uşak’tan 29, Denizli’den 77, Isparta’dan 88 ve Kütahya’dan 17 izolat olmak üzere toplamda 211 adet fungal izolat elde edilmiştir (Çizelge 4.1).
Çizelge 4.1 Denizli, Uşak, Kütahya ve Isparta illerinde 2016 yılında survey yapılan ilçeler, alınan örnek ve izolat sayıları
İl İlçe
76 4.1.2 2017 yılı çalışmaları
2016 yılında Isparta ilinden yeterli sayıda fungal izolat elde edildiği için 2017 yılında bu il için survey gerçekleştirilmemiştir. 2017 yılında yürütülen survey çalışmaları sonucunda Uşak’tan 335 da alandaki 7 farklı tarladan 93 adet, Denizli’den 62 da alandaki 5 farklı tarladan 36 adet, Kütahya’dan ise 125 da alandaki 10 farklı tarladan 77 adet olmak üzere toplamda 522 da alandaki 22 farklı tarladan 206 adet hastalıklı bitki toplanmıştır. Bu bitkilerden yapılan izolasyon işlemleri sonucunda, Uşak’tan 9, Denizli’den 2 ve Kütahya’dan 39 izolat olmak üzere toplamda 50 adet fungal izolat elde edilmiştir (Çizelge 4.2).
İller bazında elde edilen veriler bütün olarak incelenecek olursa, 2016-2017 yıllarında yürütülen tüm survey çalışmaları sonucunda Uşak’tan 1308 da alandaki 28 farklı tarladan 436 adet, Denizli’den 533 da alandaki 29 farklı tarladan 484 adet, Isparta’dan 429 da alandaki 22 farklı tarladan 627 adet, Kütahya’dan ise 433 da alandaki 18 farklı tarladan 204 adet olmak üzere toplamda 2703 da alandaki 97 farklı nohut tarlasından 1751 adet hastalıklı bitki toplanmıştır. Bu bitkilerden yapılan izolasyon işlemleri sonucunda, Uşak’tan 38, Denizli’den 79, Isparta’dan 88 ve Kütahya’dan 56 izolat olmak üzere toplamda 261 adet fungal izolat elde edilmiştir (Çizelge 4.3).
77
Çizelge 4.3 Denizli, Uşak, Kütahya ve Isparta illerinde 2016-2017 yıllarında yapılan surveylerde incelenen tarla, alınan bitki ve elde edilen izolat sayısı ile izolat elde edilme oranları
İl
İncelenen Tarla Sayısı
(adet) Alınan Bitki Sayısı Elde Edilen İzolat Sayısı İzolat Elde Edilme
Oranı (%)*
2016 2017 Toplam 2016 2017 Toplam 2016 2017 Toplam
Isparta 22 0 22 627 0 627 88 0 88 14.03
Uşak 21 7 28 343 93 436 29 9 38 8.71
Kütahya 8 10 18 127 77 204 17 39 56 27.45
Denizli 24 5 29 448 36 484 77 2 79 16.32
Toplam 75 22 97 1545 206 1751 211 50 261 14.90
* İzolat elde edilme oranı (%)=(İzole edilen toplam fungus sayısı/Alınan toplam bitki sayısı)x100
Tüm izolatlar değerlendirildiğinde Rhizoctonia benzeri fungal izolat elde edilme oranı
%14.90 olarak belirlenmiştir. Bu oran Isparta ili için %14.03, Uşak ili için %8.71, Kütahya ili için %27.45, Denizli ili için ise %16.32 olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.3).
4.2 Rhizoctonia İzolatlarının Klasik Yöntemlerle Tür Teşhisi
Işık mikroskobu altında yapılan incelemeler sonucunda, multinükleat (MN) ve binükleat (BN) Rhizoctonia izolatlarının genç hiflerinin büyüme yönünde dik açıyla dallandığı ve ana hiflerle birleşme noktasında daralarak bu noktanın yakınında septum meydana geldiği gözlemlenmiştir (Şekil 4.1a). MN ve BN ayırımı için Safranin O çözeltisi ile boyanan izolatların her bir hücredeki çekirdek sayıları incelenerek, MN Rhizoctonia izolatlarının ikiden fazla çekirdeğe, BN Rhizoctonia izolatlarının ise iki adet çekirdeğe sahip oldukları belirlenmiştir (Şekil 4.1b, c). R. bataticola izolatlarının ise ışık mikroskobu altında incelendiğinde, koyu renkli mikrosklerotlara sahip oldukları gözlemlenmiştir (Şekil 4.1d).
78
Şekil 4.1 Fungusların klasik teşhis çalışmaları. Rhizoctonia cinsinin hif yapısı (a), multinükleat Rhizoctonia hif yapısı (b), binükleat Rhizoctonia hif yapısı (c), Rhizoctonia bataticola’nın mikrosklerotları (d)
Klasik yöntemlerle yapılan tür teşhisi sonuçlarına göre, 261 adet fungusun 187 tanesi MN Rhizoctonia (R. solani), 18 tanesi BN Rhizoctonia ve 21 tanesi R. bataticola olarak tanılanmıştır (Çizelge 4.4). Diğer 35 adet fungusun ise klasik olarak tanılanması yapılamamıştır.
Çizelge 4.4 Klasik tür teşhisi sonucuna göre il bazında fungus sayıları
İl
Fungus Sayıları
Toplam Multinükleat
Rhizoctonia
Binükleat
Rhizoctonia R. bataticola Diğer
Isparta 60 12 7 9 88
Uşak 20 2 9 7 38
Kütahya 47 1 4 4 56
Denizli 60 3 1 15 79
Toplam 187 18 21 35 261
79
Yüzde olarak dağılıma bakıldığında ise 261 adet fungusun %72’sini MN Rhizoctonia,
%7’sini BN Rhizoctonia, %8’ini R. bataticola ve kalan %13’ünü ise diğer funguslar oluşturmaktadır (Şekil 4.2).
72%
13%
8%
7%
MN Rhizoctonia BN Rhizoctonia R. bataticola Diğer
Şekil 4.2 Klasik tanılaması yapılan fungus gruplarının yüzde olarak dağılımı
4.3 Nohut Tohumlarının Çimlenme Testi
Çimlenme testi sonucunda, nohut tohumlarının en yüksek oranda çimlendiği parametreler %1’lik NaOCl’de 5 dk. olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5).
Çizelge 4.5 Çimlenme testi sonucunda nohut tohumlarının çimlenme oranları
Muamele Çimlenen
Tohum Sayısı
Çimlenmeyen Tohum Sayısı
Çimlenme Oranı (%)
%1’lik NaOCl’de 1 dk. 13 7 65
%1’lik NaOCl’de 3 dk. 10 10 50
%1’lik NaOCl’de 5 dk. 17 1 94
%2’lik NaOCl’de 1 dk. 16 4 80
%2’lik NaOCl’de 2 dk. 12 8 60
%2’lik NaOCl’de 3 dk. 14 6 70
80
4.4 Rhizoctonia İzolatlarının In Vitro Patojenisite Testleri
Klasik olarak tanısı yapılamayan 35 adet fungus elimine edilerek toplamda 226 adet Rhizoctonia spp. izolatı in vitro patojenisite testine tabi tutulmuştur. In vitro patojenisite testleri ile yapılan değerlendirmeler sonucunda izolatların hastalık şiddeti değerleri %0-100 arasında değişim göstermiştir. İzolatların 5 tanesi düşük derecede virülent (DDV), 47 tanesi orta derecede virülent (ODV), kalan 170 tanesi ise yüksek derecede virülent (YDV) olarak değerlendirilirken 4 tanesi patojen bulunmamıştır (Çizelge 4.6).
Çizelge 4.6 In vitro patojenisite testinde virülenslik durumuna göre izolat sayıları
Vir.
Patojenisite durumuna yüzde dağılımı olarak bakıldığında ise, izolatların %75.22’si YDV, %20.80’i ODV, %2.21’i DDV olarak bulunurken, patojen olmayan izolat oranı
%1.77’dir (Şekil 4.3).
81 75,22%
20,80%
1,77% 2,21%
Patojen Değil (PD)
Düşük Derecede Virülent (DDV) Orta Derecede Virülent (ODV) Yüksek Derecede Virülent (YDV)
Şekil 4.3 İzolatların virülenslik derecelerine göre yüzde dağılımı
Isparta’dan elde edilen izolatların 3 tanesi DDV, 15 tanesi ODV, 59 tanesi YDV özellik göstermiş, 2 izolat ise patojen olarak değerlendirilmemiştir (Çizelge 4.6). Isparta ili için yüksek derecede virülent izolat oranı %74.68 olarak belirlenmiştir. Uşak’tan elde edilen izolatların 1 tanesi DDV, 6 tanesi ODV, 23 tanesi YDV özellik gösterirken, 1 izolat patojen olarak değerlendirilmemiştir. Uşak ili için yüksek derecede virülent izolat oranı
%77.41 olarak belirlenmiştir. Kütahya’dan elde edilen izolatların 1 tanesi DDV, 20 tanesi ODV, 31 tanesi YDV özellik gösterirken, yüksek derecede virülent izolat oranı
%59.61 olarak belirlenmiştir. Denizli’den elde edilen izolatların 7 tanesi ODV, 56 tanesi YDV özellik gösterirken, 1 izolat patojen olarak değerlendirilmemiştir. Denizli ili için yüksek derecede virülent izolat oranı ise %87.50 olarak bulunmuştur.
Çalışmamızda patojenisite testi yapılan 226 adet Rhizoctonia spp. izolatından 187 adet MN R. solani izolatının hastalık şiddeti ortalaması %61.92 olarak belirlenirken, bu oran Isparta ili için %63.80, Uşak ili için %58.73, Kütahya ili için %59.08, Denizli ili için ise
%66.09 olarak bulunmuştur. 18 adet binükleat Rhizoctonia izolatının hastalık şiddeti ortalaması %46.56 olarak belirlenirken, bu oran Isparta ili için %50.32, Uşak ili için
%56.60, Kütahya ili için %23.08, Denizli ili için ise %55.53 olarak bulunmuştur. 21 adet R. bataticola izolatının hastalık şiddeti ortalaması ise %82.92 olarak belirlenmiş olup, bu oran Isparta ili için %75.27, Uşak ili için %75.84, Kütahya ili için %80.58, Denizli ili için ise %100.00 olarak bulunmuştur (Çizelge 4.7).
82
Çizelge 4.7 In vitro patojenisite testine tabi tutulan izolatların il/ilçelere göre hastalık şiddeti ortalamaları
İl İlçe
Hastalık Şiddeti Ortalaması (%)
MN R. solani BN Rhizoctonia R. bataticola
Isparta
Isparta’dan elde edilen 79 adet Rhizoctonia spp. izolatının hastalık şiddeti değerleri %0-97.10 arasında değişim gösterirken izolatların hastalık şiddeti ortalaması %61.22 olarak bulunmuştur. En yüksek virülensliğe sahip izolat %97.10 hastalık şiddeti değeri ile 42-7-1 kodlu R. bataticola izolatı iken, en düşük derecede virülensliğe sahip izolat %11.40 hastalık şiddeti değeri ile 3-1 kodlu MN Rhizoctonia izolatı olmuştur. 9-1 ve 52-9-2 kodlu MN Rhizoctonia izolatları ise patojen olarak değerlendirilmemiştir (Çizelge 4.8).
83
Çizelge 4.8 Isparta ilinden elde edilen Rhizoctonia spp. izolatlarının patojenisiteleri
Sıra
1 İzolat kodunun ilk rakamı fungusun izole edildiği tarla numarasını göstermektedir.
2 42-43 nolu tarlalar Senirkent ilçesi, 44-53 arasındaki tarlalar Yalvaç ilçesi, 54-56 arasındaki tarlalar Şarkikaraağaç ilçesi, 57-63 arasındaki tarlalar Gelendost ilçesine bağlıdır.
3R. bat.: Rhizoctonia bataticola, MNR: Multinükleat Rhizoctonia, BNR: Binükleat Rhizoctonia
84
Uşak’tan elde edilen 31 adet Rhizoctonia spp. izolatının hastalık şiddeti değerleri %0-100 arasında değişim gösterirken izolatların hastalık şiddeti ortalaması %64.81 olarak bulunmuştur. 29-1-2 kodlu MN Rhizoctonia izolatı ve 72-1-2, 84-5-2, 85-1-2, 85-1-3 ve 85-4-1 kodlu R. bataticola izolatları %100 hastalık şiddeti değeri ile en yüksek virülensliğe sahip iken, en düşük virülensliğe sahip izolat %3.80 hastalık şiddeti değeri ile 29-2 kodlu MN Rhizoctonia izolatı olmuştur. 19-7-1 kodlu MN Rhizoctonia izolatı ise patojen olarak değerlendirilmemiştir (Çizelge 4.9).
Çizelge 4.9 Uşak ilinden elde edilen Rhizoctonia spp. izolatlarının patojenisiteleri
Sıra
1 İzolat kodunun ilk rakamı fungusun izole edildiği tarla numarasını göstermektedir.
214,16 ve 21 nolu tarlalar Merkez, 4,17,19,70,72,84 ve 85 nolu tarlalar Ulubey ilçesi, 11 ve 29 nolu tarlalar Banaz ilçesine bağlıdır.
3R. bat.: Rhizoctonia bataticola, MNR: Multinükleat Rhizoctonia, BNR: Binükleat Rhizoctonia
Kütahya’dan elde edilen 52 adet Rhizoctonia spp. izolatlarının hepsi patojen bulunmuş ve bunların hastalık şiddeti değerleri %1.9-100 arasında değişim göstermiştir. İzolatların hastalık şiddeti ortalaması %57.02 olarak belirlenmiştir. En yüksek virülensliğe sahip izolat %100 hastalık şiddeti değeri ile 82-5-5 kodlu R. bataticola izolatı iken, en düşük virülensliğe sahip izolat %1.90 hastalık şiddeti değeri ile 82-9-3 kodlu MN Rhizoctonia izolatı olmuştur (Çizelge 4.10).
85
Çizelge 4.10 Kütahya ilinden elde edilen Rhizoctonia spp. izolatlarının patojenisiteleri
Sıra
1 İzolat kodunun ilk rakamı fungusun izole edildiği tarla numarasını göstermektedir.
28 nolu tarla Merkez, 9 ve 64 nolu tarlalar Altıntaş ilçesi, 10 ve 66 nolu tarlalar Dumlupınar ilçesi, 36,80 ve 81 nolu tarla Aslanapa ilçesi, 45,82 ve 83 nolu tarlalar Gediz ilçesine bağlıdır.
3R. bat.: Rhizoctonia bataticola, MNR: Multinükleat Rhizoctonia, BNR: Binükleat Rhizoctonia
Denizli’den elde edilen 64 adet Rhizoctonia spp. izolatının hastalık şiddeti değerleri
%0-100 arasında değişim gösterirken izolatların hastalık şiddeti ortalaması %63.99 olarak bulunmuştur. En yüksek virülensliğe sahip izolat %100 hastalık şiddeti değeri ile 76-4-1 kodlu R. bataticola izolatı iken, en düşük virülensliğe sahip izolat %22 hastalık şiddeti değeri ile 27-9-1 kodlu MN Rhizoctonia izolatı olmuştur. 25-10-1 kodlu MN Rhizoctonia izolatı ise patojen olarak değerlendirilmemiştir (Çizelge 4.11).
86
Çizelge 4.11 Denizli ilinden elde edilen Rhizoctonia spp. izolatlarının patojenisiteleri
Sıra
1 İzolat kodunun ilk rakamı fungusun izole edildiği tarla numarasını göstermektedir.
28,34,35 ve 76 nolu tarlalar Serinhisar, 11,12,26,27,28,29,30,31 ve 74 nolu tarlalar Tavas ilçesi, 13 ve 14 nolu tarlalar Çal ilçesi, 25 nolu tarla Güney ilçesi, 36,38 ve 39 nolu tarlalar Acıpayam ilçesine bağlıdır.
3R. bat.: Rhizoctonia bataticola, MNR: Multinükleat Rhizoctonia, BNR: Binükleat Rhizoctonia
Hastalık şiddeti değerleri, fungus grupları açısından incelendiğinde ise, 187 adet MN Rhizoctonia izolatının 140’ı (%74.87) YDV, 40’ı (%21.39) ODV, 3’ü (%1.60) DDV olarak değerlendirilirken, 4 izolat (%2.14) ise patojen olarak değerlendirilmemiştir. 18 adet BN Rhizoctonia izolatının hepsi patojen olarak değerlendirilirken, bunların 10’u
87
(%55.56) YDV, 6’sı (%33.33) ODV, 2’si (%11.11) ise DDV kategorisinde yer almışlardır. 21 adet R. bataticola izolatının ise yine hepsi patojen olarak değerlendirilmiş, bunların 20’si (%95.24) YDV iken kalan 1’i (%4.76) ODV patojenisiteye sahip bulunmuştur (Çizelge 4.12, Şekil 4.4).
Çizelge 4.12 Fungus gruplarının virülenslik derecelerine göre izolat sayıları
Fungus Rhizoctonia (a), BN Rhizoctonia (b), Rhizoctonia bataticola (c)
a b c
88 4.5 İzolatların Seçimi
İzolatların PDA besi ortamında gelişme durumları, test izolatları ile kültürel olarak benzerlikleri, in vitro patojenisite testlerinden elde edilen hastalık şiddeti değerleri ve izole edildikleri bitkilerin alındıkları tarla bilgileri dikkate alınarak izolatların sayısında azaltmaya gidilmiştir. R. bataticola izolatlarının hepsi seçim yapılmaksızın teşhis aşamasına alınmıştır. Seçim yapılırken virülensliği yüksek (>%50) olan izolatların seçilmesine dikkat edilmiştir.
Multinükleat Rhizoctonia, binükleat Rhizoctonia ve R. bataticola olarak ayrımları yapılan ve in vitro patojenisite testleri sonucunda virülenslik dereceleri belirlenen izolatlardan yapılan seçimler sonucunda, 79 adet Isparta izolatından 49, 31 adet Uşak izolatından 22, 52 adet Kütahya izolatından 27 ve 64 adet Denizli izolatından 35 adet olmak üzere, toplamda 226 adet izolattan 133 tanesi anastomosis gruplarının belirlenmesi çalışmalarında kullanılmıştır (Çizelge 4.13).
Çizelge 4.13 Seçim yapılan izolatların dağılımı
İl
İzolat Sayısı
R.
bataticola*
Multinükleat Rhizoctonia
Binükleat
Rhizoctonia Toplam
Seçilen Seçilmeyen Seçilen Seçilmeyen Seçilen Seçilmeyen
Isparta 7 38 22 4 8 49 30
Uşak 9 12 8 1 1 22 9
Kütahya 4 23 24 - 1 27 25
Denizli 1 32 28 2 1 35 29
Toplam 21 105 82 7 11 133 93
*R. bataticola izolatlarının hepsi seçilmiştir.
4.6 Multinükleat Rhizoctonia İzolatlarının Klasik Yöntemlerle Anastomosis Gruplarının Belirlenmesi
Teşhis yapılmak üzere seçilmiş olan 105 adet MN Rhizoctonia izolatı ile test izolatları
89
3.2.4.1’de belirtildiği gibi karşılıklı olarak ekilmiş ve hifsel birleşme reaksiyon tiplerinin (C0, C1, C2, C3) hepsi gözlemlenmiştir (Şekil 4.5a-d).
Şekil 4.5 Multinükleat Rhizoctonia izolatlarında anastomosis reaksiyonları. C0 reaksiyon tipi: akraba değil (a), C1 reaksiyon tipi: uzak akraba (b), C2 reaksiyon tipi: akraba (c), C3 reaksiyon tipi: yakın akraba (d)
Hifsel birleşme tiplerine göre test izolatları ile akraba olup olmadıkları belirlenen izolatların anastomosis grupları tespit edilmiş ve test edilen izolatların sadece AG-4 ve AG-5 test izolatları ile birleşme gösterdiği belirlenmiştir. Buna göre, Isparta izolatlarından 15 tanesi AG-4, 23 tanesi AG-5, Uşak izolatlarından 7 tanesi AG-4, 5 tanesi AG-5, Kütahya izolatlarından 11 tanesi AG-4, 12 tanesi AG-5 ve Denizli izolatlarından 12 tanesi AG-4, 20 tanesi AG-5 olmak üzere toplamda 105 adet izolatın 45 tanesi AG-4 ve 60 tanesi AG-5 olarak tanılanmıştır (Şekil 4.6).
90 15
7 11 12
23 5 12 20
38 12 23 32
45 60 105
Isparta Uşak Kütahya Denizli Toplam
AG-4 AG-5 Toplam MN İzolat Sayısı
Şekil 4.6 Klasik olarak anastomosis grupları belirlenen izolatların dağılımı
4.7 Rhizoctonia İzolatlarının Moleküler Yöntemlerle Tür Teşhisi
105 adet MN Rhizoctonia (R. solani), 7 adet BN Rhizoctonia ve 21 adet R. bataticola izolatı olmak üzere toplamda 133 adet izolatın DNA izolasyon işlemi yapılmıştır.
Genomik DNA’ların PCR amplifikasyonu işlemi sonucunda R. solani ve BN Rhizoctonia izolatları için %1.5’luk agaroz jelde ~700 bp büyüklüğünde, R. bataticola izolatları için ise ~600 bp büyüklüğünde bant elde edilmiştir (Şekil 4.7).
Şekil 4.7 Genomik DNA’ların UV ışık altında görüntüsü. 0: Negatif kontrol; 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13: MN ve BN Rhizoctonia izolatları; 5, 14, 15, 16, 17:
Rhizoctonia bataticola izolatları
PCR ürünlerinin sekans işlemi sonucunda izolatların 96 tanesi tür ve anastomosis düzeyinde tanılanabilmiştir. Kalan 36 tane izolattan sağlıklı sonuçlar alınamadığı için
91
bu izolatlar sonraki çalışmalarda değerlendirilmeye alınmamıştır. Sekans işlemi sonucunda izolatların büyük çoğunluğunun NCBI GenBank’ta referans izolatlar ile
%99-100 oranında benzerlik gösterdiği görülmüştür. En yüksek benzerlik oranları baz alındığında izolatların 23 tanesi Rhizoctonia solani 4 HGII, 50 tanesi R. solani AG-5, 4 tanesi binükleat Rhizoctonia AG-K ve 19 tanesi ise R. bataticola olarak tanılanmıştır (Şekil 4.8).
Şekil 4.8 Moleküler olarak tanılama yapılan Rhizoctonia izolatlarının dağılımı
4.8 İzolatların Morfolojik, Patojenik ve Genetik Çeşitliliği
Tür düzeyinde tanılama işlemi yapılan 96 adet Rhizoctonia spp. izolatının morfolojik, patojenik ve genetik olarak özellikleri incelenmiştir.
4.8.1 Rhizoctonia solani AG-4-HGII
Klasik olarak anastomosis grup belirleme çalışmalarında AG-4 test izolatı ile hifsel birleşme yapan ve sekans analizi ile AG-4 HGII olduğu teyid edilen izolatların PDA besi ortamında gelişme yapıları ve sklerot oluşturma durumları incelenerek kayıt altına alınmıştır. 23 adet AG-4-HGII izolatının 30-35 günlük kültür gelişimleri incelenmiş ve izolatlar arasındaki farklılık ortaya konulmuştur (Şekil 4.9a-f). Kültürlerin koloni renkleri incelendiğinde, 4 tanesinin beyazımsı kahverengi, 16 tanesinin açık
5
92
kahverengi, 3 tanesinin ise koyu kahverengi olduğu gözlemlenmiştir. Hif oluşturma yetenekleri incelendiğinde, 7 tanesinin az, 5 tanesinin bol, 11 tanesinin ise orta miktarda hif meydana getirdiği gözlemlenmiştir. Sklerot oluşturma durumları incelendiğinde ise, 13 izolatın sklerot oluşturduğu, 9 tanesinin açık kahverengi, 4 tanesinin koyu kahverengi, sklerot konumlarına bakıldığında ise 4 tanesinin merkezi, 8 tanesinin dağınık, 1 tanesinin çevresel olduğu gözlemlenmiştir (Çizelge 4.14).
Şekil 4.9 Rhizoctonia solani AG-4-HGII izolatlarının morfolojik farklılıkları. Açık kahverengi koloni rengi (a), beyazımsı kahverengi koloni rengi (b), merkezi açık kahverengi sklerot oluşumu (c), dağınık koyu kahverengi sklerot oluşumu (d), bol hif yapısı (e), dağınık sklerot ve bol hif yapısı (f)
AG-4-HGII izolatlarının in vitro patojenisite testi sonuçlarında elde edilen % hastalık şiddeti değerleri Çizelge 4.14’de verilmiştir. Buna göre izolatların 3 tanesi (%13) orta derecede virülent, diğer 20 tanesi (%87) yüksek derecede virülent olarak değerlendirilmiştir (Şekil 4.10a-c). En agresif izolat %100 hastalık şiddeti değeri ile U12 nolu izolat, virülensliği en düşük olan izolat ise %42.8 hastalık şiddeti değeri ile IS29 nolu izolat olmuştur. AG-4-HGII izolatlarının hastalık şiddeti değerleri ortalaması ise %68.48 olarak bulunmuştur.
93
Çizelge 4.14 Rhizoctonia solani AG-4-HGII izolatlarının morfolojik ve patojenik özellikleri
Sıra No
İzolat No1
Koloni Özellikleri Skleroti Özellikleri Patojenik Davranışları Koloni
2B.K: Beyazımsı kahverengi, A.K: Açık kahverengi, K.K: Koyu kahverengi
3Aynı harfi taşıyan rakamlar arasındaki farklılık Duncan testine göre önemli değildir (p≤0.05).
4YDV: Yüksek derecede virülent, ODV: Orta derecede virülent
Şekil 4.10 Farklı virülensliğe sahip Rhizoctonia solani AG-4 izolatları. Yüksek derecede virülent izolat (a), orta derecede virülent izolat (b), kontrol petrisi (c)
94
Rhizoctonia solani AG-4 izolatları ITS gen bölgesi sekans analizi sonucuna göre NCBI GenBank’ta yer alan R. solani AG-4 HGII referans izolatları ile %99-100 arasında genetik benzerlik göstermiştir. AG-4-HGII izolatlarının sekansa tabi tutulduktan ve kesim işlemleri gerçekleştirildikten sonra 615-667 arasında baz çiftine sahip oldukları görülmüştür. Bu izolatlar GenBank’a kaydedilmiş ve accession numaraları (MH231493-MH231515) temin edilmiştir (Çizelge 4.15).
Çizelge 4.15 Rhizoctonia solani AG-4-HGII izolatlarının genetik farklılıkları
Sıra No
İzolat Numarası*
İzolat Bilgileri GenBank’ta Eşleştiği Referans İzolatlar
95
ITS gen bölgesi sekans analizine göre oluşturulan dendogramda, AG-4 izolatlarının hepsinin referans AG-4-HGI ve AG4-HG-III izolatlarından ayrı olarak, %100 bootstrap değeri ile referans AG-4-HGII izolatları ile aynı dalda yer aldığı görülmüştür (Şekil 4.11).
Şekil 4.11 ITS gen bölgesi sekans analizi ile oluşturulan Rhizoctonia solani AG-4
Şekil 4.11 ITS gen bölgesi sekans analizi ile oluşturulan Rhizoctonia solani AG-4