Konaklama letmelerinde Maliyetlerin Yapısı

3.2.2.1 Conservação do Fungo Cephalosporium acremonium ATCC 48272

Foi desenvolvida e padronizada a metodologia para preservação do microrganismo em criotubos , mantidos no Ultra-freezer à -50oC. O procedimento experimental adotado foi baseado em metodologia proposta por Andrietta (1998).

Tubos de ensaio, contendo 10 mL de meio de esporulação (item 3.1.2.1), eram preparados a partir de criotubos e eram incubados em tubos de ensaios por um período de 7 dias a 28oC. Após este período de incubação, os tubos de ensaio eram preservados em

geladeira à 4oC. Estes tubos eram utilizados para o preparo do germinado e inóculo dos experimentos com o fungo.

A partir destes tubos de ensaio também foram preparados os criotubos. Utilizando- se 10 mL de solução salina (NaCl a 0,9% p/v) foi preparada uma suspensão de esporos contidas em dois tubos de ensaio. Esta suspensão foi adicionada a 80 mL de meio de cultura de germinação, descrito no item 3.1.2.2, contido num erlenmeyer de 500 mL e cultivado por 48 horas em mesa incubadora rotativa a 28 °C a 250 rpm.Transferiu-se 20 mL do germinado para vários frascos Erlenmeyers de 1000 mL contendo 150 mL de meio de cultura de inóculo, descrito no item 3.1.2.2, e cultivados por 24 horas em mesa incubadora rotativa a 28 °C a 250 rpm. Então era adicionada 20% (v/v) de glicerol, como crioprotetor, que depois foram transferidas para criotubos que serem armazenados a -50 °C em ultrafreezer.

Esta metodologia de ativação das células provenientes de criotubos em meio sólido de esporulação foi adotada devido a problemas encontrados quando o conteúdo dos criotubos era adicionado diretamente ao meio de cultura para preparo de germinado, como aumento do tempo necessário para atingir alta concentração celular; presença de concentração de glicerol em concentrações repressoras da produção de cefalosporina C e maior quantidade de criotubos necessários para a preparação de germinado.

3.2.2.2 Preparação do Germinado

Para cada tubo de ensaio contendo os esporos, era utilizado 5 mL de solução salina (NaCl à 0,9% v/v) para a suspensão dos esporos. A suspensão de esporos de dois tubos de ensaio eram adicionados em um erlenmeyer de 500 mL contendo 80,0 mL de meio de cultura de germinação, descrito no item 3.1.2.2 que eram incubados por 48 horas em mesa incubadora rotativa à 28oC e 250 rpm.

3.2.2.3 Preparação e Acompanhamento do Desenvolvimento do Inóculo

Uma alíquota de 20 mL de germinado era adicionada a um erlenmeyer de 1000 mL contendo 100 mL de meio do inóculo, como descrito no item 3.1.2.2, e incubados por 24 horas em mesa incubadora rotativa à 28oC e 250 rpm.

Com o objetivo de acompanhar o desenvolvimento do inóculo, alíquotas de 10 mL de germinado eram adicionados a um erlenmeyer de 500 mL contendo 50 mL de meio de inóculo e incubados por 24 horas em mesa incubadora rotativa à 28oC e 250 rpm. O acompanhamento foi feito pela medida do crescimento celular, consumo de glicose, nitrogênio na forma de acetato de amônio e fósforo.

3.2.2.4 Experimentos de Fermentação com Cephalosporium acremonium em Erlenmeyer e em Fermentador

Para os ensaios padrão, em frascos agitados, para validação do estudo do planejamento fatorial, alíquotas de 10 mL de inóculo eram adicionados a um erlenmeyer de 500 mL contendo 50 mL de meio de produção, como descito no item 3.1.2.3, a uma temperatura 28 °C, pH inicial 7,0+0,1 e mantidos a uma rotação de 250 rpm por um período de 144 horas. O acompanhamento foi feito pela medida do crescimento celular, consumo de glicose, de fósforo e de nitrogênio na forma de acetato de amônio.

Para o experimento em fermentador operando em regime batelada convencional (Bioflo III - New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ, EUA), foi utilizado 4,0 litros de meio de cultura conforme Tabela 3.3. Este meio foi inoculado com 400 mL de inóculo, a temperatura foi mantida em 28 °C e o oxigênio dissolvido foi controlado em 30% da saturação através da variação automática da velocidade de agitação entre 250 e 700 rpm e uma vazão de ar em 3 L/min por um período de 144 horas. O pH foi controlado em 7,0 com a adição automática de solução de NaOH 2 N e H2SO4 2 N.

Todos os ensaios conduzidos segundo o planejamento fatorial foram realizados em regime descontínuo em mesa incubadora rotativa variando a concentração inicial dos nutrientes do meio de acordo com o previsto pelo planejamento, a uma temperatura de 28,0°C, pH inicial igual a 7,0 + 0,1, com agitação de 250 rpm.

O volume total do meio de fermentação para o acompanhamento do crescimento do microrganismo nos ensaios da matriz planejamento, Tabela 3.9, foram de 60 mL (50 mL de meio para crescimento mais 10 mL de inóculo) em erlenmeyer de 500 mL.

Para o acompanhamento do crescimento do microrganismo nos ensaios da matriz planejamento, Tabelas 3.12 e 3.14, as fermentações foram realizadas com um volume total de 50 mL ( 45 mL de meio para crescimento mais 5 mL de inóculo ) em erlenmeyer de

500 mL. O acompanhamento das fermentações foi feito pela medida do crescimento celular, consumo de glicose, de fósforo e de nitrogênio na forma de acetato de amônio.

Para o acompanhamento da produção de antibiótico, as fermentações foram conduzidas em erlenmeyer de 500 mL com um volume 45 mL de meio de produção (Tabela 3.4) mais 5 mL de inóculo. Após aproximadamente 40 horas de fermentação, quando o meio atingia alta concentração celular e concentrações quase nulas de glicose e acetato de amônio, eram adicionados 5 mL de sacarose e DL-metionina de modo que as concentrações das variáveis em estudo atingissem os níveis definidos pelo planejamento, Tabela 3.16 e Tabela 3.17.

Para os experimentos em fermentador de tanque agitado Bioflo III, em regime batelada alimentada, foi utilizado um volume inicial de 2,5 litros de meio e um inóculo de 300 mL. A temperatura foi mantida em 28 °C e o oxigênio dissolvido em 30% da saturação através da variação automática da velocidade de agitação entre 250 e 700 rpm e uma vazão de ar em 3 L/min por um período de 144 horas. O pH foi controlado em 7,0 com a adição automática de solução de NaOH 2 N e H2SO4 2 N. O meio suplementar de crescimento, era adicionado ao fermentador seguindo uma vazão exponencialmente crescente no tempo de modo a manter as concentrações de glicose e acetato de amônio em torno de 4,5 e 2,5 g/L, respectivamente. Após 48 horas o meio suplementar de crescimento era trocado pelo meio suplementar de produção, o qual era adicionado também a uma vazão exponencialmente crescente no tempo de modo a manter as concentrações de sacarose e DL-metionina, em torno de 10,5 e 2,5 g/L, respectivamente. O meio suplementar contendo fósforo e os sais era adicionado em intervalos de tempo levando em consideração somente a diluição destes componentes no fermentador, ocorrida até o momento da adição.