3.2. Türkiye'deki Mevcut Ar-Ge Kurumsal Yapısı ve Etkileyen Çerçevenin Gözden
3.2.4. Kobi’lere Yönelik Teşvikler ve Ar-Ge Destekleri
Foi realizado um estudo para avaliar o grau de interferência de alguns dos excipientes mais usados nas formulações farmacêuticas utilizadas neste estudo (de acordo com as informações das bulas). Analisaram-se soluções contendo uma concentração fixa da fluoroquinolona de 20 g mL-1.
Os excipientes testados foram: celulose microcristalina, dióxido de silício, hidroxipropilmetilcelulose, polietilenoglicol (PEG 6000), lactose, dióxido de titânio, amido, talco, polivinilpirrolidona (PVP), estearato de magnésio, manitol, frutose, glicose e cloreto de benzacônio. O estudo foi realizado com concentração dos excipientes 1 e 10 vezes superior a concentração do analito. Uma substância pode ser considerada interferente se a sua presença provocar uma variação de absorbância para a concentração fixada de analito, superior a 3% quando comparado com o valor obtido na sua ausência. Não foi observada interferência de nenhum desses compostos na determinação dos analitos. IV.8. Aplicação do método proposto em amostras de formulações farmacêuticas
A metodologia analítica desenvolvida foi aplicada à determinação de norfloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina e enrofloxacina em formulações farmacêuticas, sendo as três primeiras adquiridas em farmácias nas cidades de Araraquara/SP e Guariba/SP e as de enrofloxacina em estabelecimentos de produtos veterinários da cidade de Araraquara/SP. As soluções das diferentes amostras foram preparadas a partir das formulações em estudo, de acordo com capítulo III e posteriormente analisadas no procedimento de análise em fluxo automatizado com multi-bombas após a otimização.
A exatidão do método proposto foi avaliada através de ensaios de adição de padrão e recuperação em quatro amostras, bem como a comparação dos resultados das amostras com métodos de referência.
55 IV.8.1 Adição de Padrão e Recuperação
Para verificar a influência da matriz foram realizados experimentos de adição de padrão e recuperação em quatro medicamentos (A, E, F e H), que correspondem a cada uma das fluoroquinolonas estudadas.
Nestes estudos, quantidades conhecidas de fluoroquinolona (padrão analítico) foram adicionadas às soluções das amostras pré-analisadas. Foram realizados ensaios de recuperação em quatro níveis para cada amostra - 50, 100 e 150 e 200% - em triplicatas, da concentração do composto presente nas amostras conforme Tabela 12.
Tabela 12: Validação do método proposto por adição de padrão e recuperação.
Composto fortificação Níveis de
Conc. do composto (g mL-1) Média da concentração obtida Recuperação (%) Norfloxacina (amostra A) 10 9,75 início + 50% 15 14,3 96,9 início + 100% 20 19,2 97,2 início + 150% 25 22,9 92,5 início + 200% 30 28,8 98,8 Enrofloxacina (amostra E) 10 11,2 início + 50% 15 17,2 106,2 início + 100% 20 22,7 107,1 início + 150% 25 27,5 105,0 início + 200% 30 33,8 108,3 Ciprofloxacina (amostra F) 10 10,2 início + 50% 15 15,4 101,3 início + 100% 20 21,5 106,4 início + 150% 25 27,0 107,1 início + 200% 30 31,9 105,6 Levofloxacina (amostra H) 10 10,1 início + 50% 15 15,6 104,0 início + 100% 20 21,2 106,0 início + 150% 25 26,6 106,4 início + 200% 30 31,9 106,3
Os resultados obtidos indicam que o método apresenta boa exatidão e que não há interferência significativa da matriz no método proposto.
56 IV.8.2 Análise das amostras e comparação com os métodos de referência (HPLC-DAD)
A exatidão também foi avaliada através da comparação com métodos de referência que utilizam a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado a detector de fotodiodo (HPLC-DAD). O método desenvolvido por Cañada et al. (2007, p. 1242-1249) foi utilizado para determinar norfloxacina, ciprofloxacina e enrofloxacina e o método proposto por Nagaraj et al. (2013, p. 102-120) utilizado para a determinação da levofloxacina.
Os resultados obtidos encontram-se esquematizados na Tabela 13 apresentando os desvios padrão da metodologia desenvolvida em relação às metodologias de referência. Os desvios padrão relativo (DPR%) foram calculados e apresentaram valores inferiores a 0,94; 0,96; 0,44 e 1,97% para a análise de formulações farmacêuticas contendo norfloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina e enrofloxacina, respectivamente.
57
Tabela 13: Resultados da análise de formulações farmacêuticas e comparação com métodos de referência. Formulação Farmacêutica Quantidade declarada (mg) Quantidade encontradaa(mg) Tc Fc Método Métodos de desenvolvido Referênciab NORFLOXACINA A (comprimidos) 400 401 (± 0.94) 407 (± 6,6) 1,2 49,2 B (comprimidos) 400 399 (± 0.94) 395 (± 3,7) 1,9 15,5 C (solução oral 10%) 100 mg mL-1 99.8 (± 0.94) 101,1 (± 1,5) 2,4 2,5 ENROFLOXACINA D (comprimidos) 50 50,0 (± 0,48) 56 (± 2,3) 4,0 22,9 E (sol. injetável 2,5%) 25 mg mL-1 27,2 (± 0,21) 26,5 (± 0,61) 1,7 8,4 CIPROFLOXACINA F (comprimidos) 500 523 (± 1,2) 530 (± 3,4) 2,6 8,0 G (colírio 0,3%) 3,0 mg mL-1 3,2 (± 0,047) 3,3 (± 0,075) 4,0 2,5 LEVOFLOXACINA H (comp. revestido com corantes) 500 520 (± 2.3) 517 (± 5,7) 0,83 6,1
a: média ± desvio padrão de 3 análises independentes b:referências 59 e 20.
c:valores calculados de t e F (valores teóricos para 95% de nível de confiança com t = 4,30 e F = 19,00)
A realização do teste de t-Student bicaudal, calculado para duas amostras em par para médias e um nível de confiança de 95%, confirmou a ausência de diferenças estatisticamente significativas entre os resultados obtidos pelos dois métodos, uma vez que os valores de tcalc são inferiores aos valores de ttab.
Através do cálculo da razão entre o quadrado dos desvios padrão (DP) dos dois métodos (Fcalc=DPA²/DPB²), com a exceção das amostras A e D, verificou-
se que os dois métodos não apresentam diferenças significativas entre si, relativamente às suas precisões, uma vez que os valores de Fcalc são inferiores
aos valores de Ftab.
A quantidade de princípio ativo dos medicamentos A, B, C, D e G não apresentam diferenças significativas em relação à concentração nominal de
58 fluoroquinolona. Somente as amostras F e H apresentaram valores acima da quantidade esperada. De qualquer forma, todos estes valores estão na faixa de variação de ± 10% da concentração nominal, para peso médio de até 300 mg, e ± 7,5% para peso médio acima de 300 mg, que é usualmente aceita na produção desses medicamentos segundo a Farmacopeia Brasileira 5ª Ed (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2010, p. 60).
Capítulo V - CONCLUSÃO
O procedimento de análise em fluxo empregando multi-bombas desenvolvido neste trabalho para a determinação de norfloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina e enrofloxacina em formulações farmacêuticas apresentou boa precisão e exatidão. O método desenvolvido possui boa seletividade evidenciada pela possível ausência de interferência com os excipientes farmacêuticos. Como se trata de um procedimento com elevado nível de automação, esse sistema MPFS permitiu um fácil ajuste nos parâmetros físicos e químicos, dessa forma, contribuindo com o controle e desenvolvimento reacional. O uso do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS), não só permitiu o deslocamento (batocrômico) da absorbância máxima para a região do visível, como também aumentou a sensibilidade do método na determinação de norfloxacina, ciprofloxacina e enrofloxacina. Com isso, foi possível desenvolver um procedimento analítico mais simples, mais econômico, mais versátil e com maior ritmo de amostragem do que métodos similares já existentes na literatura (ASKAL, 2007), sendo possível obter até 40 determinações por hora, numa vazão de 1,5 mL mim-1. Para cada ciclo analítico correspondente a uma determinação, foram gastos 500 μL de amostra, 250 μL de reagente (NBS) e 1600 μL solução carregadora (água).
Portanto, a metodologia proposta revelou ser uma alternativa vantajosa se comparada com aquelas recomendadas pelas Farmacopeias que em geral são lentas, laboriosas, requerendo muitas vezes o uso de solventes de elevada toxicidade como, por exemplo, acetonitrila e metanol. Comparada com outros métodos de fluxo com determinação espectrofotométrica, verificou-se que a metodologia desenvolvida apresentou, de uma maneira geral, figuras de mérito melhores. Outro diferencial do sistema MPFS frente ao procedimento FIA convencional é o fato de apresentar menor consumo de amostra e reagente. Por
59 isso, se caracteriza como um procedimento ambientalmente amigável, estando de acordo com os princípios propostos pela Química Verde.
A metodologia analítica poderá ainda ser estendida à determinação em outras matrizes (como alimentícias e ambientais), desde que esteja associado a um processo de extração/pré-concentração eficaz ou adotada alguma estratégia de aumento de sensibilidade (como o emprego de uma cela de longo caminho ótico).
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