Devido à sua sensibilidade e robustez, a proteômica foi escolhida para a descoberta de biomarcadores clínicos. A proteômica clínica é definida como o estudo quali e quantitativo do perfil proteico de amostras clínicas de tecidos ou fluidos corporais, como o palsma (BANKS;SELBY, 2003). No presente trabalho, anterior a análise em espectrômetro de massa, foi adicionada a fase de imunodepleção, para auxiliar na diminuição da faixa dinâmica e retirar as proteínas de maior abundância, e a fase de cromatografia de afinidade em coluna com lectina imobilizada, no intuito de buscar glicoproteínas que possam ter sofrido alterações no padrão de glicosilação. Já foi relatado na literatura que essas modificações das glicoproteínas podem estar relacionadas a alterações na expressão gênica causadas pelo câncer e que a utilização de lectinas na busca de biomarcadores de câncer é promissora (FANAYAN; HINCAPIE; HANCOCK, 2012).
A abordagem proteômica realizada nessa pesquisa se baseou na identificação das glicoproteínas do Pico I e II obtidas a partir da cromatografia em matriz Frutalina- Sepharose. Após essa etapa, as amostras do Pico I e II foram submetidas aos processos de diálise, concentração, digestão, para posterior identificação e quantificação das proteínas diferencialmente expressas nos grupos, através de nanoUPLC-MS com aquisição MSE. As amostras do grupo controle (C) e do grupo paciente (P) foram analisadas no EM em triplicata nas mesmas condições.
No total, incluindo o Pico I e o Pico II, foram identificadas 6.788 proteínas e 6.209 peptídeos, onde 89.18% dos peptídeos apresentaram erro de massa de, no máximo, 10 ppm para mais ou para menos (figura 8). Quanto à qualidade de fragmentação e digestão dos peptídeos, 18 % dos peptídeos foram fragmentados na fonte, enquanto 9% correspondem à clivagem perdida (figura 9).
Figura 8 – Distribuição do erro de massa total (pico 1 e pico 2) dos peptídeos após cromatografia de afinidade com matiz Frutalina-Sepharose e análise em EM. O erro de 89,18% dos peptídeos ficou na faixa de 10 ppm para mais ou para menos.
Fonte: Binned peptidePercursor
Figura 9 - Representação gráfica da avaliação da qualidade de fragmentação e digestão dos peptídeos.
Legenda: azul claro – peptídeo fragmentado 1 = 53%; violeta – peptídeo fragmentado 2 = 15%; rosa – moficação peptídica = 2%; vermelho – fragmentação na fonte = 18%; azul escuro – clivagem perdida = 9%; amarelo - perca neutra H2O = 3%; preto – perca neutra NH4 = 0%. Fonte: Binned peptidePercursor.
Vários estudos ao longo dos anos têm sido realizados, aplicando a quantificação label free, para estimar a proporção de uma proteína em uma amostra. (KITO; ITO, 2008; BECKER; BERN, 2011). A quantificação label free requer comparação dos peptídeos, provenientes da digestão proteolítica, idênticos em cada uma das condições, para determinar, com precisão, as proporções relativas das proteínas de interesse particular (OELJEKLAUS et al., 2009). Muitos destes métodos baseiam-se na intensidade dos picos, determinada pelas proporções da área do pico de peptídeos idênticos entre as diferentes condições, e na frequência da identificação, determinada pela razão entre a contagem de espectros e o número de peptídeos para a proteína em questão (SILVA et al., 2006; BECKER; BERN, 2011).
Megger e colaboradores (2014) realizaram um estudo para comparação de quantificação proteômica label free e duas metodologias que utilizam marcação pela incorporação de isóbaros. Os autores foram capazes de mostrar que a abordagem label free, de longe, supera os métodos, TMT e iTRAQ, em relação à cobertura do proteoma de diversas linhagens celulares, com até três vezes mais proteínas identificadas apresentando uma excelente reprodutibilidade em medições repetidas.
Após a identificação das proteínas, foi utilizada a abordagem de quantificação label free. A metodologia consistiu na adição de um padrão interno, para isso utilizamos uma solução de peptídeos da proteína álcool desidrogenasse. Além disso, paralelamente, as proteínas foram quantificadas pela escolha de uma house keeping, e o resultado dos dois processamentos mostraram diferenças insignificantes, demonstrando a exatidão dos resultados.
Posteriormente, uma lista de proteínas do Pico I e do Pico II foram geradas pelo programa ExpressionE. As proteínas que se apresentaram em duas das três injeções foram selecionadas (filtro 2x2). Para a comparação proteica entre o grupo controle e paciente foi realizada a razão entre as proteínas do grupo paciente com HCC (P) e grupo controle (C), (P/C), onde as proteínas com razões ≥ 2 foram ditas UP reguladas, isto é, foram super expressas, e as razões ≤ 0,5 foram ditas DOWN reguladas, isto é, foram sub expressas. As proteínas que apresentaram razão < 2,0 e razão > 0,5 foram descritas como UNCHANGED, pois foram expressas dentro dos limites estabelecidos nesse trabalho. As proteínas “UP” apresentaram aumento significativo na expressão, já as proteínas “DOWN”
apresentaram diminuição significativa da expressão e as proteínas “UNCHANGED” não apresentaram modificações significativas na sua expressão.
Um total de 112 proteínas foram incluídas na análise de expressão diferencial nos dois grupos (C e P) do Pico I e 121 proteínas foram identificadas nos dois grupos (C e P) do Pico II. A comparação dos níveis de expressão de proteínas nesses grupos foi possível através da ferramenta ExpressionE pertencente ao programa Protein Lynx Global Server. As figuras 10 e 11 apresentam um gráfico com o perfil das proteínas totais do Pico I e II, respectivamente, evidenciando as proteínas UP e DOWN reguladas em relação aos valores da razão Paciente/Controle e seus respectivos desvios padrões.
Figura 10 – Expressão diferencial de glicoproteínas do Pico I após cromatografia em matriz de Frutalina- Sepharose. Demonstração da razão (P/C) pelo desvio padrão evidenciando as proteínas “up” e “down” reguladas.
Legenda: Azul: proteínas “down” reguladas; vermelho: proteínas sem modificação na expressão; verde: proteínas “up” reguladas; * verde: proteína “up” regulada fora de escala. Fonte: produção do autor.
Figura 11 - Expressão diferencial de glicoproteínas do Pico II após cromatografia em matriz de Frutalina- Sepharose. Demonstração da razão (P/C) pelo desvio padrão evidenciando as proteínas “up” e “down”
Legenda: Azul: proteínas “down” reguladas; vermelho: proteínas sem modificação na expressão; verde: proteínas “up” reguladas; * verde: proteína “up” regulada fora de escala. Fonte: produção do autor.