Os terpenos são o maior grupo de fitoquímicos, os quais exibem diversas funções na mediação de interações benéficas e antagônicos entre os organismos. Espécies de Jatropha são ricas em terpenóides. Dentre os terpenos, os diterpenos, são os mais estudados desse gênero, sendo os ésteres de forbol o diterpeno de maior interesse no estudo de Jatropha
curcas(DEVAPPA et al., 2010).
Em plantas os diterpenóides são sintetizados em três passos principais. No primeiro, a unidade de isopreno isopentenil difosfato (IPP) é sintetizada através da via do 1-desoxi-D- xilulose-5-fosfato (DXP), quatro das sete enzimas que compõem essa via foram identificadas no presente trabalho: 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato reductoisomerase, 2 - C- metil-D-eritritol 4-fosfato citidililtransferase, 4 - (citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritritol- quinase, e (E) -4 - hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-sintase. Com isso, sugere-se que a via DOXP encontra-se em funcionamento nos plastídeos, como sugerido previamente nos estudos transcriptômicos de sementes do pinhão manso em desenvolvimento (KING et al., 2011).
Numa segunda etapa, o isoprenil difosfato sintase catalisa a síntese dos precursores intermediários do difosfato: geranil difosfato, farnesil difosfato, e geranilgeranil difosfato (GGPP) a partir da unidade do isopreno. Nas amostras de proteínas plastidiais do endosperma em desenvolmento do pinhão manso, a GGPP sintase foi identificada. Essa enzima é responsável pela síntese do GGPP, um precursor de diversos diterpenos. Entretanto não foram identificadas enzimas envolvidas na síntese de outros precursores do GGPP.
O terceiro passo na formação dos diversos diterpenóides ocorre pela ação da terpeno sintase/ciclase, mas nenhuma delas foi identificada no presente trabalho. As proteínas relacionadas com o metabolismo secundário, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, estão listadas na tabela 6 (ver figura 14 e tabela suplementar 4).
Em estudo transcriptômico de sementes em desenvolvimento de J.curcas, King et al. (2011) também não identificaram transcritos para as terpeno sintase, embora tenham detectado todos os transcritos que codificam para enzimas da via DOXP.
As enzimas que podem estar envolvidas na síntese de ésteres de forbol foram detectadas a partir dos estudos transcriptômicos e proteômicos de sementes de pinhão manso realizados por Costa et al. (2010) e Soares et al. (2014). Dentre estas, pode-se destacar transcritos envolvidos nas vias biossintéticas do isopentenil pirofosfato (IPP) e do
dimetilalil pirofosfato (DPP) que são os precursores de todas as classes de terpenos sintetizados em plantas. Estes compostos são sintetizados tanto a partir de vias que ocorrem no citoplasma (via do mevalonato), quanto de vias que ocorrem nos plastídeos (via do 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato - DXP) (ZULAK; BOHLMANN, 2010).
O geranilgeranilpirofosfato (GGPP), sintetizado pela ação da geranilgeranilpirofosfato sintase, é o substrato de uma ampla variedade de ciclases que catalisam a formação de diterpenos cíclicos os quais serão processados de diferentes maneiras culminando com a síntese de diterpenos específicos (YAMAGUCHI, 2008). Embora ainda sem evidência experimental, acredita-se que os ésteres de forbol são sintetizados a partir do casbeno que é sintetizado através da ciclização do geranilgeranilpirofosfato pela sintase do casbeno. A via biossintética do forbol ainda não está completamente delineada, mas segundo Dewick (2002) pode se originar a partir da ciclização do geranilgeranilpirofosfato (GGPP) (Figura 16), que cria um cátion contendo um anel de 14 membros. A perda de um próton quando da formação do anel do ciclopropano leva à formação do casbeno, composto que na mamona (Ricinus communis) é um metabólito antifúngico. O casbeno é provavelmente o precursor do forbol. Dessa maneira, a via de síntese dos ésteres de forbol a partir do geranilgeranilpirofosfato não tem intermediários comuns com a síntese de diterpenos importantes para o metabolismo primário das plantas, como , por exemplo, as giberelinas. A sintase do casbeno foi isolada primeiramente de folhas da mamoneira (Ricinus communis) e usa o geranilgeranilpirofosfato como substrato para produzir diretamente o casbeno, uma fitoalexina.
Diante dos dados expostos, sugere-se que os plastídeos isolados a partir do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso não sintetizam ésteres de forbol. Um suporte experimental para essa proposta encontra-se na observação feita por He
et al. (2011), ao mostrarem que a maior deposição de ésteres de forbol em semente do pinhão manso ocorre no tegma e não no endosperma. O tégma é um tecido de origem materna, o qual se origina a partir do integumento interno das sementes, ele é importante para a transferência de nutrientes dos tecidos de origem materna para o endosperma e o embrião. Na semente madura esse tecido se reduz a uma fina camada, que juntamente com a testa formam a casca da semente.
Tabela 6 - Proteínas relacionadas com o metabolismo secundário, presentes nos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, com base no KEGG.
ProteinID Protein description communisHitBest Ricinus Best Arabidopsisthaliana Hit Final locaization
Jcr4S00021.320 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RKN5 AT4G29010.1 P
Jcr4S00035.80 delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase B9R960 AT5G62530.1 P
Jcr4S00115.180 aldehyde dehydrogenase, putative B9RZQ0 AT3G66658.2 P
Jcr4S00558.90 Delta3,5-delta2,4-dienoyl-CoA isomerase B9RM93 AT5G43280.1 P
Jcr4S00616.80 3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase, putative B9RT76 AT3G06860.1 P
Jcr4S00742.70 acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial, putative B9SA57 AT5G48230.2 P
Jcr4S01649.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9T4Y7 AT3G51050.1 P
Jcr4S01936.100 aldehyde dehydrogenase - - P
Jcr4S02497.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P
Jcr4S03546.10 aldehyde dehydrogenase, putative B9RB49 AT3G48000.1 P
Jcr4S04843.20 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme a hydrolase-like B9RPB0 AT4G13360.1 P
Jcr4S04843.30 3-hydroxyisobutyryl- hydrolase-like protein 4 B9RPB0 AT4G13360.1 P
Jcr4S08423.20 aldehyde dehydrogenase Family B9RB49 AT1G23800.1 P
Jcr4S11660.10 betaine aldehyde dehydrogenase B9R8Y8 AT1G74920.1 P
Jcr4S26962.10 aldehyde dehydrogenase family 3 member B9S2Y3 AT1G44170.2 P
Jcr4S01018.60 3-ketoacyl-CoA thiolase B, putative B9RWL7 AT2G33150.1 P
Jcr4S15816.20 3-ketoacyl-CoA thiolase B, putative B9S554 AT2G33150.1 P
gi|225544133 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit G1D767 ATCG00500.1 P
Jcr4S00416.90 -carboxyl-tansferase ( -CT) subunit of Het-ACCase B9SPE5 AT2G38040.2 P
Jcr4S01232.50 Biotin carboxyl carrier protein subunit of of Het-ACCase B9RM56 AT5G16390.1 P
Jcr4S03449.40 biotin carboxylase precursor B9S1E2 AT5G35360.1 P
Jcr4S09385.30 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit G1D767 ATCG00500.1 P
Jcr4U29862.20 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P
Jcr4U31237.20 acetyl-coenzyme a carboxylase carboxyl transferase subunit - - P
Jcr4U32160.10 acetyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit beta G1D767 ATCG00500.1 P
Jcr4S00057.90 transketolase, putative B9RDA1 AT2G45290.1 P
Jcr4S00202.110 dtdp-glucose 4-6-dehydratase, putative B9SAR7 AT3G62830.2 P
Jcr4S00225.120 pyruvate dehydrogenase, putative B9S0Z5 AT2G34590.1 P
Jcr4S00089.150 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase B9RB24 AT5G62790.1 P
Jcr4S00528.60 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase B9S047 AT2G02500.1 P
Jcr4S01187.50 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase B9SWB7 AT5G60600.1 P
Jcr4S05483.10 4-diphosphocytidyl-2-c-methyl-d-erythritol kinase B9SB47 AT2G26930.1 P
Jcr4S07015.40 geranylgeranyl pyrophosphate synthase-related protein B9SUY3 AT4G38460.1 P
Jcr4S01069.20 curcin precursor B9RRJ1 - -
6 CONCLUSÃO
O presente trabalho realizou a primeira análise do proteoma dos plastídeos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso. Utilizando os dados de sequencia do genoma do pinhão manso, foi possível identificar 923 proteínas relacionadas com diversas atividades metabólicas. Além da identificação das proteínas responsáveis pela biossíntese de ácidos graxos e de outras importantes vias metabólicas, que ocorrem nos plastídeos, também foram identificadas uma série de proteínas transportadoras relacionadas com a captação de fontes de carbono e nitrogênio, que são fontes necessárias para promover as vias biossintéticas. Apesar de várias enzimas, envolvidas na síntese dos precursores de diterpenos, terem sido identificadas, nenhuma terpeno sintase/ciclase foi detectada. Dessa forma, possivelmente os plastídeos, isolados a partir do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, não sintetizam ésteres de forbol.
O estudo exposto fornece insights sobre as principais vias biossintéticas e mostra características originais dos plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento em nível de proteoma. Além disso, abre prerrogativa para o estudo proteômico dos plastídeos do integumento de sementes do pinhão manso em desenvolvimento para se obter uma maior amplitude de dados referentes às proteínas plastidiais envolvidas na síntese dos ésteres de forbol, bem como nas demais vias metabólicas que ocorrem nos plastídeos.
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os dados obtidos por He et al. (2011), permitem formular a hipótese de que as enzimas relacionadas com a síntese dos ésteres de forbol, com foco para sintase do casbeno, estejam localizadas nos plastídeos do tegma. Outra possibilidade é que a enzima sintase do casbeno possa estar presente em outros tecidos que não na semente, nos quais ocorrem a síntese dos ésteres de forbol sendo estes, em seguida, transportados até as sementes.
Os dados produzidos pelos estudos proteômicos do pinhão manso, tornam-se cruciais para melhor compreender e explorar as diversas vias biossintéticas que ocorrem nos plastídeos, e proporcionar um maior alicerce de dados aos experimentos de melhoramento genético. No pinhão manso as vias metabólicas de biossíntese dos lipídios e dos ésteres de forbol são as que despertam maior interesse para o melhoramento. Seja para produzir óleo de melhor qualidade e em maior quantidade, ou para diminuir o nível dos compostos tóxicos, principalmente os ésteres de forbol (terpenóide).
Levando em conta a ampla gama de funções que os terpenóides desempenham em plantas, tais como defesa, reguladores de crescimento, etc (KIRBY; KEASLING, 2009), é patente que a interferência em reações que produzam precursores comuns à síntese de várias classes de terpenos, pode ter consequências drásticas para a planta. Por exemplo, a inibição da síntese de geranilgeranilpirofosfato (GGPP) pelo silenciamento da GGPP sintase, certamente levaria a uma dramática redução na síntese tanto de diterpenos, como, por exemplo, de giberelinas, bem como de carotenóides uma vez que o geranilgeranilpirofosfato é precursor destes. Neste contexto, é interessante chamar a atenção que a despeito de várias tentativas exitosas de silenciar genes envolvidos na sintese de terpenóides (JASSBI et al., 2007), o efeito do silenciamento destes genes no desempenho da planta em condições de campo ainda não foi analisada.
A hipótese de que a síntese dos ésteres de forbol tem o casbeno como intermediário, poderá ser testada através de experimentos onde a expressão da sintase do casbeno é transitoriamente bloqueada através de silenciamento gênico mediado por vírus (VIGS). Daí tamanho o interesse em continuar a busca pelo conhecimento da via síntese dos ésteres de forbol.
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