Çocuğa Görelik

Para avaliar os níveis de peroxidação lipídica nos tecidos, foi analisada a presença do pro- duto formado entre o malondialdeído (MDA) e o ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), via cromatogra- fia líquida de alta performance (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) acoplada ao detector de UV/Vis (ALMEIDA et al., 2003, 2004).

Para isso, 100 mg de tecido foi homogeneizado em 300 µL de tampão Tris 0,1 M, pH 8,0. Em seguida, 300 µL de TBA diluído em HCl 0,2 M (solução a 0,4%) foi adicionado à amostra.

3.6 Análise estatística 32

de n-butanol e quantificado no HPLC-UV/Vis em 532 nm, em termos da curva de calibração utilizando como padrão o MDA obtido pela hidrólise do tetrametoxipropano. O sistema de HPLC (ESA) constitui-se de uma bomba modelo ESA 584 e de detector de UV/Vis modelo ESA 526. A coluna utilizada foi ACE 5 C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). O monitoramento do cromatograma e a identificação e quantificação do pico foram realizados utilizando o software EZ Chrom Elite (Agilent Technologies). A fase móvel foi composta por solução de fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH 7,0 com 40% metanol, bombeada isocraticamente (0,9 mL/min). Dados foram expressos em nmol/mg de tecido.

3.6

Análise estatística

Para cada espécie de peixe foram feitas as seguintes análises:

• Comparações entre os diferentes tratamentos para um mesmo período de exposição: foi realizado teste de homogeneidade das variâncias (Levene) e quando os dados se apresen- taram paramétricos, utilizou-se ANOVA One-Way seguido pelo teste de Fisher LSD, caso contrário, foi utilizado Kruskal-Walllis.

No caso desta análise os dados que inicialmente apresentaram variâncias não homogêneas foram normalizados em termos de logaritmo da atividade enzimática ou concentração. Esse procedimento foi feito para os seguintes dados referentes às tilápias: GST hepática, GPx e MDA branquiais dos dois períodos de exposição, catalase hepática e branquial de sete dias. No caso dos cascudos esse procedimento se limitou aos dados da EROD hepática de sete dias, catalase hepática de dois dias, GST hepática e das brânquias com dois dias de tratamento e MDA das brânquias com sete dias de exposição.

• Comparação da atividade enzimática ou concentração entre os dois períodos de exposição de um mesmo tratamento (mesma dose e mesmo contaminante): primeiramente avaliou- se a normalidade (Shapiro-Wilk) e homogeneidade (Levene) dos dados. Quando os dados se apresentaram paramétricos foi aplicado o teste t de Student e, em caso de dados não- paramétricos, teste de Mann-Whitney. Quando já no teste de Shapiro-Wilk, os dados não apresentavam distribuição normal, o teste de homogeneidade não foi aplicado. Esta aná- lise só foi realizada para os grupos que apresentaram diferenças significantes em relação ao controle em dois ou sete dias de exposição.

Diferenças significativas foram aceitas somente para p< 0,05. As análises estatísticas foram realizadas com ajuda do programa Statistica 7.1 (Statsoft).

33

4

Resultados

Dados sobre normalidade, homogeneidade das variâncias e as matrizes geradas pelo teste de Fisher LSD para cada tempo de exposição de todos os biomarcadores aqui analisados estão dispostos em tabelas no apêndice deste trabalho.

4.1

Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel

4.1.1

EROD

Houve diferenças na atividade da EROD entre os tratamentos em ambos os períodos de exposição para as duas espécies de peixe (Tabela 1).

Tabela 1: Análise de variância da atividade enzimática da EROD de O. niloticus e P. anisitsi para cada período de exposição. EROD Tilápia Cascudo Efeito F gl P F gl P Atividade em 2 dias 7,6934 8 5,91.10−6* 23,1257 8 8,07.10−12* Atividade em 7 dias 40,2116 8 2,10.10−15* 44,4366 8 4,44.10−16*

Nota: * Valores significativos (p<0,05).

No caso das tilápias, em dois dias de exposição, a enzima teve sua atividade aumentada nos grupos expostos às duas concentrações de óleo diesel e B20 e para a concentração de 0,1 mL/L de B5 em relação ao controle. A atividade da EROD dos animais expostos às duas concentrações de biodiesel puro foi estatisticamente igual ao controle (Tabela 15 e Figura 8). Após sete dias de exposição, com exceção dos grupos expostos ao biodiesel puro, todos os outros grupos tiveram a atividade aumentada em relação ao controle (Tabela 16 e Figura 8). Além disso, nesse mesmo período a atividade da EROD foi menor nos peixes submetidos ao B20 0,01 mL/L em relação diesel e B5 de mesma concentração e ao B20 0,1 mL/L em relação aos grupos expostos ao diesel e B5 de 0,1 mL/L (Tabela 16 e Figura 8).

A atividade da EROD nas tilápias foi maior para sete dias que em dois dias para os grupos expostos ao diesel 0,01 mL/L (p= 0,016294), diesel 0,1 mL/L (p= 0,040664) e B5 0,01 mL/L

4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 34

(p= 0,039958) (Figura 8).

Para os cascudos, a atividade da EROD foi maior que o controle para todos os grupos com exceção dos animais expostos por dois dias às duas concentrações de biodiesel B100 e expostos por sete dias a menor dose de B100. Em dois dias, a menor concentração de óleo diesel, B5 e B20 induziu maior atividade enzimática quando comparados respectivamente aos grupos expostos a maior dose dos mesmos tratamentos. O mesmo fenômeno ocorreu com os animais expostos por sete dias ao B5 (Tabelas 17 e 18 e Figura 8).

A atividade do CYP1A nos cascudos após dois dias de tratamento foi maior para os grupos diesel 0,1 mL/L (p= 0,000234) e B5 0,01 (p= 0,044506) mL/L e menor para B20 0,01 mL/L (p= 0,000780) em relação aos mesmos grupos de sete dias de exposição (Figura 8).

Para as duas espécies de peixes, no segundo dia de exposição, podemos observar que não há diferenças na atividade da EROD entre os grupos expostos ao diesel, B5 e B20 (0,01 mL/L) e entre os mesmos grupos para a concentração de 0,1 mL/L. No sétimo dia, nas tilápias isso ocorre apenas para os tratamentos com óleo diesel e B5 e nos cascudos para a maior dose de diesel e B5 (Tabelas 17 e 18 e Figura 8).

4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 35

Figura 8: Gráfico da atividade da EROD em fígado de O. niloticus. O gráfico referente a atividade da EROD em P. anisitsi encontra-se em maior escala para melhor visualizar as diferenças entre os tratamentos.a

Diferença significativa em relação ao controle.b

Diferença significativa em relação ao grupo exposto ao mesmo contaminante com maior concentração. c _{Diferença significativa entre os tempos de exposição para o mesmo grupo. Dados}

4.1 Efeitos da exposição ao óleo diesel e ao biodiesel 36