HORMON İLE İNDÜKLENMİŞ GECİKMİŞ OVULASYONUN ERKEN EMBRİYO GELİŞİMİ ÜZERİNE ETKİSİ
Ann-Kathrin Bittner, M.D.,a Bernhard Horsthemke, Ph.D.,b Elke Winterhager, Ph.D.,a and Ruth Gr€ummer, Ph.D.a
a Institute of Molecular Biology, University Hospital Essen, University Duisburg-Essen, Essen, Germany; and b
Institute of
Human Genetics, University Hospital Essen, University Duisburg-Essen, Essen, Germany
Amaç: Bu çalışma ile insanlarda yardımcı üreme teknikleri (ART) sırasında intrafoliküler oosit gelişimi gecikebileceğinden , geçikmiş ovulasyonun fare embriyolarının gelişimi üzerine etkisini analiz etmek amaçlandı.
Dizayn: Eksperimental fare çalışması Yapıldığı yer: Üniversite hastanesi Hayvanlar: C57B1/6 dişi fareler
Uygulama: Cetrorelix ART sikluslarında kullanılan GnRH-antagonistidir. Geçikmiş ovulasyonun embriyo gelişimi üzerindeki etkisini belirlemek için, gebe kısrakların serumundan elde edilen gonadotropinle aynı zamanlı cetrorelix verilerek folikül stimulasyonu ve HCG ile ovulasyon sağlandı . Kontrol grubu da gebe kısrakların serumundan elde edilen gonadotropinle stimüle edildi, ancak geçikmiş ovulasyon yapılmadı. Ovulasyonun supresyonu tersiyer foliküllerin sayısı, rüptüre folikül sayısı ve cetrolelix tedavisi sonrası fare overlerindeki korpora lutea sayısı ile belirlendi. Gebeliğin 17,5 günü embriyoların ve plasentaların sayısı ağırlıkları, rezorpsiyon alanları ve ölü embriyolar değerlendirildi.
Ana Sonuç Ölçütleri: Ovulasyonun inhibisyonu, embriyonik gelişim
Sonuçlar: Farelerde cetrolelix ile tersiyer foliküllerin artışı ile birlikte folikül rüptürünün belirgin inhibisyonu ve korpora lutea formasyonu ile gösterilebilen ovulasyon inhibisyonu sağlandı. Cetrolelix tedavisi ile sağlanan geçikmiş ovulasyon, farelerin embriyonik ağırlığında belirgin azalmaya ve resorpsiyon alanında belirgin artışa neden olduğu görüldü.
Yorum: Preovulatuar oositin aşırı olgunlaşması , ART tedavisinde embriyo gelişimi ve
fertiliteyi etkilemektedir.
Anahtar kelimeler: GnRH-antagonisti, cetrorelix, oosit kalitesi, oosit maturitesi, embriyo gelişim
i
Preovulatuar ve postovulatuar yaşlanma oositlerin fazla olgunlaşmasına (1) sebep olur. Bu
durum her yaştaki fertil kadınlarda geçikmiş ovulasyonun ve gecikmiş fertilizasyonun
sonuçlarıdır. Postovulatuar oosit yaşlanmasının etkileri geniş olarak çalışılmıştır (2). Bununla
birlikte, uzamış preovulatuar yaşlanmanın da oositlerin gelişimsel yeterliliği üzerinde etkisi
olabilir (3). Xenopus laevis deneyleri, preovulatuar fazla olgunlaşmanın yüksek embriyo
mortalitesi ve malformasyonuna neden olduğunun göstermiştir (4). Fareler üzerinde yapılan
çalışmalar, intrafoliküler oosit yaşlanması ile kromozom anomalileri, mRNA ve protein
sentezinde değişiklikler, ve embriyo ölümlerinde ve gelişimsel defeklerde artışa neden
olduğunu göstermiştir (5-7). İnsanlarda uzamış foliküler fazın konjenital malformasyon
riskini arttırdığı ile ilgili çalışmalar mevcuttur (8). Fertilizasyon sonrası embriyonun gelişme
potansiyelini oositin kalitesinin belirlediği bilinmektedir (9). ART tedavisinin ovulasyonun
gecikmesine ve oositin gelişimsel yeterliliğine etkisi olabilmektedir. Yakın tarihteki
tartışmalarla, hormonal tedavileri, IVF ve embriyo kültürünü kapsayan ART tedavisinin
muhtemel yan etkileri olduğu kaygılarını kanıtlamıştır. ART tedavisi ile doğan çocuklar
düşük doğum ağırlığı, erken doğum, malformasyonlar ve genomik bozukluklar gelişimi
açısından artmış riske sahiptir (10-15). Günümüzde, preovulatuar oosit yaşlanmasının etkileri
konusunda çok az şey bilinmektedir. İntrafoliküler fazla olgunlaşmaya bağlı bozulmuş oosit
kalitesi ve gelişimsel defektlerin arasındaki ilişkiyi bulmak zor gibi gözükmektedir. Biz
embriyo gelişimi üzerinde gecikmiş ovulasyonun etkisini analiz etmek için, LH piki cetrolelix
ile baskılanmış hayvan çalışmasını planladık. Bu GnRH antagonisti, GnRH ile yarışarak aynı
reseptöre bağlanır ve eşit miktarlardaki GnRH ve cetrorelix LH salınımını tamamen baskılar (16). Cetrorelix bu güne kadarki en gelişmiş GnRH antagonistlerinden biridir ve ART programlarında LH salınımını baskılamak için sıklıkla kullanılmaktadır (17).
MATERYAL VE METOD Hayvanlar
Yetişkin fareler için
(C57B1/6) 12 saat gece, 12 saat gündüz ve sınırsız su ve yiyecek sağlandı.
Over siklusunun evresi vajinal smear ile belirlendi. Almanya devleti hayvan çalışması etik kurul onamı alındı
(LANUV G887/06).
Gecikmiş ovulasyon
Her bir fare için günlük 10 ve 50 mikrogram cetrorelix, adetin ikinci günü başlanarak 3 gün verilmek üzere SC uygulandı ve böylelikle gecikmiş ovulasyon sağlandı. Son cetrorelix enjeksiyonundan 24 saat sonra fareler servikal dislokasyon ile öldürüldü ve overler alındı, parafin işlemi öncesi tartıldı. Kontrol grubu ovarian siklusun aynı günlerinde incelendi.
Dokuz tane kontrol ve dört tane cetrorelix ile tedavi almış fare toplam tersiyer folikül sayısı, rüptüre folikül ve korpore lutea sayıları açısından değerlendirildi.
Fertilite ve Embriyonik Tedavi
Ovulasyonun geciktirilmesinin ardından embriyonik gelişim değerlendirildi. Ovulasyon günlük 50 mikrogram cetrorelix enjeksiyonu ile adetin 1. günü başlanarak baskılandı. Cetrorelix tedavisinin 1. ve 4. günleri 5IU PMSG subkutan uygulanarak folikül gelişimi sağlandı. Tedavinin 6. günü subkutan 7.5 IU hCG ile ovulasyon sağlandı. Kontrol grubu adetin birinci günü PMSG ile stimüle edildi ve 48 saat sonraki hCG ile ovulasyon sağlandı. hCG enjeksiyonu sonrası aynı gece erkek farelerle (C57Bl/6)
çiftleştirildi.
Sonraki sabah vajinal plag varlığı postkoital 0.5. gün olarak değerlendirildi. Her deneysel grup için, 18 fare çiftleştirildi ve bunlardan cetrorelix ile tedavi edilenlerden 10, kontrol grubundan 6 tane gebelik elde edildi. Gebeliğin 17.5. günü uterus longitidunal olarak açıldı ve düzgün gelişmiş embriyo sayısı, resorpsiyon alanları ve intrauterin ölü embriyo sayısı ( kalp atımı olmamasına göre) tespit edildi. Düzgün olarak gelişmiş embriyolar ve plasentaları alındı ve tartıldı.İstatistiksel Analiz
Araştırma data analizi ve variant analiz (Mann–Whitney test) SPSS programı kullanılarak yapıldı.
(SPSS, Inc., Chicago,IL). P<0.005 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
Cetrorelix ile ovulasyonun baskılanması doza bağımlıdır.
GnRH antagonisti cetrorelix ile normal siklusu olan farelerde tahmin edilen ovulasyon gününün 3 gün
inhibisyonu sağlandı. Kontrol grubunun overlerinin histolojik incelenmesinde çok sayıda korpora luteaya rastlanıldı (Figür 1-A). Ancak cetrorelix ile tedavi alan farelerin overlerinde korpora luteaya rastlanılmadı ve bunun yerine çok sayıda tersiyer folikül izlendi (Figür 1-B). Overlerin seri diseksiyonu ile tüm korpora lutea ve tersiyer foliküllerin sayımı, cetrorelix tedavisinin doza bağımlı etkisini gösterdi. 50 mikrogram cetrorelix enjeksiyonu korpora lutea gelişimini belirgin engellerken (Figür 1-C), 10 mikrogram cetrorelix enjeksiyonu corpora lutea sayısını belirgin azaltacak kadar yeterli değildi. Korpora lutea oluşumunun baskılanmasının tersiyer folikül sayısındaki artışla (Figür 1-E) ve ovulasyonun histomorfolojik belirtisi olan rüptüre folikülün tamamen kaybolması ile paralel gittiği gözlendi (Figür 1-D). Ovulasyon 10 mikrogram cetrorelix ile tam olarak inhibe edilemedi.
Cetrorelix ile tedavi edilen tüm farelerde over ağırlığı azalmış olarak bulundu, bununla birlikte bu
azalma gruplar arasında belirgin değildi(Figür 1-F). Bu sonuçlara dayanarak, bundan sonraki aşamalarda, ovulasyonu baskılamak için 50mikrogram cetrorelix kullanıldı.
Gecikmiş ovulasyonun embriyo ve plasenta gelişimi ve infertilite üzerine etkisi
5 günlük hormonal folikül stimulasyonu sırasında cetrorelix ile ovulasyon baskılandı ve tedavinin 6.
gününde yapılan hCG ile gecikmiş ovulasyon sağlandı. Başarılı çitleşmenin ardından, uterus 17.5. gün
çıkarıdı ve normal olark gelişen embriyo sayısı, ölü embriyolar ve resorpsiyon alanları analiz edildi.
Her iki grubun gebelik oranları ve sağlıklı gelişen embriyo sayıları arasında fark yoktu (Tablo 1).
İntrauterin ölü embriyo, sağlıklı embriyolara göre daha küçük görünmeleri ve kalp atışının olmaması ile tanımlandı ve intrauterin ölü embriyo her iki grupta da benzer sayıda tespit edildi. Bununla birlikte rezorpsiyon alanları sadece cetrorelix ile tedavi alan fare grubunda izlendi (Tablo 1). Cetrorelix ile ovulasyon geciktirilmesinin, 17.5. günkü ortalama normal embriyo sayısında azalmaya ve (Figür 2-A) ölü embriyo sayısında hafif ancak anlamlı olmayan azalmaya(Figür 2-B) sebep olduğu gözlendi.
Bununla birlikte, ovulasyonu geciktirilen grupta resorpsiyon alanlarında belirgin artış tespit edildi (Figür 2-C). İntrauterin resorpsiyon alanları, dejenere doku topları olarak gebeliğin ortalarında in utero kaybı temsil etmekteydi. (Figür 2-E). Kontol grubu ile karşılaştırıldığında geciktirilmiş ovulasyon grubunda, sağlıklı embriyoların 17.5. gündeki ortalama ağırlığının belirgin az olduğu tespit edildi (ort
± SEM, 0.92 ± 0.05 ve 0.77 ± 0.02 g) (Figür 3A), bununla birlikte plasenta ağırlığında herhangi bir fark bulunmadı (0.091 ±0.0023 ve 0.095± 0.0026 g (Figür 3B). Sonuç olarak, plasenta/ embriyo ağırlığı oranı gecikmiş ovulasyon grubunda belirgin olarak daha yüksek bulundu (Figür 2-C).
Sonuçlarımıza göre, cetrorelix tedavisi ile gecikmiş ovulasyon, resorpsiyon alanında artışa ve sağlıklı gelişen embriyonun ağırlığında azalmaya neden olmaktadır.
TARTIŞMA
Bu çalışmada, GnRH antagonisti ile gecikmiş ovulasyonun sağlanmasının ardından, preovulatuar oositin fazla olgunlaşmasının embriyo ve plasenta gelişimi üzerine etkilerini analiz ettik. Pituiter desensitizasyonuyla prematür LH salınımını engelleyen GnRH agonistlerinin aksine GnRH antagonistleri, GnRH reseptörü için yarışıp gonadotropinlerin hızlı ve daha fazla baskılanmasını
sağladıkları için daha avantajlıdır (18). Bu çalışmada GnRH antagonisti olarak kullandığımız cetrorelix ART programlarında yaygın olarak kullanılmaktadır (17). Cetrorelix, kadınlarda LH pikini güvenli bir şekilde engellemesinin yanında ayrıca dişi farelerde, pituter LHRH reseptörünü de baskılamaktadır (19). Torres ve arkadaşları (20) farelerin normal sikluslarında GnRH agonistleri ve antagonistlerinin etkilerini karşılaştırmışlar ve cetrorelixin ovulasyonu GnRH agonistlerine göre daha etkili bir şekilde baskıladıklarını ve daha az implantasyon alanı ve daha az gelişen embriyoya sebep olduklarını tespit etmişlerdir. Bizim hayvan modelimizde, ovulasyonun cetrorelix ile baskılanmasının doza bağımlı olduğu ve tersiyer foliküllerin birikimine yol açtığı görülmüştür. Bu sonuçlar göstermiştir ki, farelerin cetrorelixe cevabı insanlarla benzer şekildedir ve bu model ART tedavisi sırasında model olarak kullanılabilir.
Gecikmiş ovulasyon, çoğunlukla resorpsiyon alanlarının fazlalığı nedeni ile daha az embriyo gelişimi ile sonuçlanmıştır. Gecikmiş ovulasyon grubunda embriyo ağırlığında belirgin azalma tespit edilmiş ancak plasenta ağırlığı kontrol grubu ile benzer bulunmuştur. Farelerde süperovulasyonun, ağırlıkları daha az olan embriyo gelişimine neden olduğu (21) ve ART tedavisi ile doğan bebeklerin artmış düşük doğum ağırlığı riski taşıdığı (10) daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Plasenta ağırlığının fetal ağırlığa oranı fetal gelişim için bilinen bir belirteçdir ve bu oranın IVF bebeklerinde belirgin olarak arttığı ve bu bebeklerin gebelik haftalarına göre daha küçük oldukları tanımlanmıştır (22). Bu yayınların sonuçları, gecikmiş ovulasyon grubundaki plasenta ağırlığı/embriyonik ağırlık oranındaki artışın, plasental ağırlıktaki artışdan değilde embriyonik ağırlıktaki azalmadan kaynaklandığı yönündeki bulgularımız ile örtüşmektedir. Bu bulgular, ART hastalarında ovulasyonun hormonal yolla geciktirilmesinin embriyo gelişimi üzerine etkileri olabileceğini göstermektedir.
Önceki çalışmalar, hormonal hiperstimülasyonun farelerde ve insanlarda embriyo gelişim sürecine etkileri olabileceğini göstermiştir. İmplantasyon oranları ve gebelik sonuçları embriyo gelişimi sırasında oluşan defektlere bağlı olarak azalmakta (21, 23) gibi gözükmektedir (24). Oositler intrafoliküler gelişim ve maturasyon sırasında belirgin moleküler değişikliklere maruz kaldıklarından dolayı, gecikmiş ovulasyon sonucu oositlerin fazla olgunlaşması, oositlerin gelişimsel yeterlilikleri üzerine bir darbe olarak eklenmektedir. Farelerde pentobarbital ile ovulasyonun 1-2 gün
geciktirilmesinin embriyonik ölüm ve anormal embriyo gelişim insidansını arttırdığı gösterilmiştir (5).
Ek olarak, Sommergruber ve arkadaşları (25) insanlarda uzun süre cetrorelix kullanılmasının gebelik oranlarını azalttığını tespit etmişlerdir. Oositlerin gelişimsel olgunlaşmasını engelleyen faktörler tam olarak tanımlanamasa da, metabolik faktörler, sitoplazmik nRNA ve protein depoları, yapısal komponentler ve maternal genomdaki epigenetik modifikasyonlar (26, 27) ve RNA poliadenilasyonundaki düzenlemeler etkili gibi gözükmektedir (28, 29). Bu defektler sağlıklı embriyo gelişimini engellemekte ve plasentada yapısal ya da fonksiyonel anormalliklerin oluşumuna sebep olmaktadır (30). Bu sonuçların, plasental fonksiyona bağlı olarak mı yoksa embriyonun gelişimsel defektlerine bağlı olarak mı oluştuğunun aydınlatılması zorunludur. Cünkü ART tedavisinin, embriyonik ağırlıkta azalmayı (21) ve konjenital malformasyon oranlarında artışı da içerecek şekilde embriyo gelişimini etkilediği gösterilmiştir. Cetrorelix veya diğer GnRH antagonistleri ile gecikmiş ovulasyonun muhtemel etkisi ile ART tedavisi alan hastaların oosit kalitesi ve arkasından embriyo gelişimi etkilenmektedir. ART sikluslarında hormonal tedavinin risklerini azaltmak için bu tedavilerin embriyo üzerindeki etki mekanizmalarının daha iyi netleştirilmesi gerekmektedir.
KAYNAKLAR
1. Jongbloet PH. Overripeness of the ovum. Observations on the etiology of Goldenhar’s syndrome and related congenital dysplasias. Ned Tijdschr Geneeskd 1969;113:653–65.
2. Miao YL, Kikuchi K, Sun QY, Schatten H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Hum Reprod Update 2009;15:573–85.
3. Ottolenghi C, Uda M, Hamatani T, Crisponi L, Garcia JE, Ko M, et al. Aging of oocyte, ovary, and human reproduction. Ann N Y Acad Sci 2004;1034:117–31.
4. Mikamo K. Intrafollicular overripeness and teratologic development. Cytogenetics 1968;7:212–33.
5. Butcher RL, Blue JD, Fugo NW. Role of intrauterine environment on ova after normal and delayed ovulation. Biol Reprod 1969;1:149–51.
6. Butcher RL, Fugo NW. Overripeness and the mammalian ova. II. Delayed ovulation and chromosome anomalies. Fertil Steril 1967;18:297–302.
7. Peluso JJ, Butcher RL. RNA and protein synthesis in control and follicularly-aged rat oocytes. Proc Soc Exp Biol Med 1974;147:350–3.
8. Spira A, Spira N, Papiernik-Berkauer E, Schwarz D. Pattern of menstrual cycles and incidence of congenital malformations. Early Human Dev 1985;11: 317–24.
9. Wang Q, Sun QY. Evaluation of oocyte quality: morphological, cellular and molecular predictors.
Reprod Fertil Dev 2007;19:1–12.
10. Schieve LA, Meikle SF, Ferre C, Peterson HB, Jeng G, Wilcox LS. Low and very low birth weight in infants conceived with use of assisted reproductive technology. N Engl J Med 2002;346:731–7.
11. Hansen M, Bower C, Milne E, de Klerk N, Kurinczuk JJ. Assisted reproductive technologies and the risk of birth defects–a systematic review. Hum Reprod 2005;20:328–38.
12. Shiota K, Yamada S. Intrauterine environmentgenome interaction and children’s development (3): Assisted reproductive technologies and developmental disorders. J Toxicol Sci 2009;34(Suppl 2):287–91.
13. Cox GF, B€urger J, Lip V, Mau UA, Sperling K, Wu BL, et al. Intracytoplasmic sperm injection may increase the risk of imprinting defects. Am J Hum Genet 2002;71:162–4.
14. Ludwig M, Katalinic A, Gross S, Sutcliffe A, Varon R, Horsthemke B. Increased prevalence of imprinting defects in patients with Angelman syndrome born to subfertile couples. J Med Genet 2005;42:289– 91.
15. Gosden R, Trasler J, Lucifero D, Faddy M. Rare congenital disorders, imprinted genes, and assisted reproductive technology. Lancet 2003;361:1975–7.
16. Weiss JM, K€onig SJ, Polack S, Emons G, Schulz KD, Diedrich K, et al. Actions of gonadotropin- releasing hormone analogues in pituitary gonadotrophs and their modulation by ovarian steroids. J Steroid Biochem Mol Biol 2006;101:118–26.
17. Tur-Kaspa I, Ezcurra D. GnRH antagonist, cetrorelix, for pituitary suppression in modern, patient- friendly assisted reproductive technology. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2009;5:1323–36.
18. Huirne JA, Homburg R, Lambalk CB. Are GnRH antagonists comparable to agonists for use in IVF? Hum Reprod 2007;22:2805–13.
19. Kovacs M, Schally AV, Csernus B, Rekasi Z. Luteinizing hormone-releasing hormone (LH-RH) antagonist Cetrorelix down-regulates the mRNA expression of pituitary receptors for LH-RH by counteracting the stimulatory effect of endogenous LH-RH. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:1829–
34.
20. Torres MM, Donadio N, Donadio NF, Brand~ao AC, Heck B. Comparison of embryo implantation inWistar rats that underwent ovarian stimulation using exogenous gonadotropins associated with cetrorelix acetate or leuprolide acetate. Fertil Steril 2005;84: 1235–40.
21. Ertzeid G, Storeng R. The impact of ovarian stimulation on implantation and fetal development in mice. Hum Reprod 2001;16:221–5.
22. Daniel Y, Schreiber L, Geva E, Amit A, Pausner D, Kupferminc MJ, et al. Do placentae of term singleton pregnancies obtained by assisted reproductive Technologies differ from those of spontaneously conceived pregnancies? Hum Reprod 1999;14:1107–10.
23. Santos MA, Kuijk EW, Macklon NS. The impact of ovarian stimulation for IVF on the developing embryo. Reproduction 2010;139:23–34.
24. Sato A, Otsu E, Negishi H, Utsunomiya T, Arima T. Aberrant DNA methylation of imprinted loci in superovulated oocytes. Hum Reprod 2007;22:26–35.
25. Sommergruber M, Shebl O, Jesacher J, Gaiswinkler U, Krain V, Ebner T, et al. Antagonist und intrauterine Insemination—wann ist der geeignete Zeitpunkt der Ovulationsinduktion?
J Reproduktionsmed Endokrinol 2006;4:260.
26. Lucifero D, Mertineit C, Clarke HJ, Bestor TH, Trasler JM. Methylation dynamics of imprinted genes in mouse germ cells. Genomics 2002;79:530–8.
27. Krisher RL. The effect of oocyte quality on development. J Anim Sci 2004;82(ESuppl):E14–23.
28. De Leon V, Johnson A, Bachvarova R. Half-lives and relative amounts of stored and polysomal ribosomes and poly(A)þ RNA in mouse oocytes. Dev Biol 1983;98:400–8.
29. Kosubek A, Klein-Hitpass L, Rademacher K, Horsthemke B, Ryffel GU. Aging of Xenopus tropicalis Eggs Leads to Depolyadenylation of a Specific Set of Maternal mRNAs and Loss of Developmental Potential. PLoS 2010;5:e13532.
30. Fowden AL, Sibley C, Reik W, Constancia M. Imprinted genes, placental development and fetal growth. Horm Res 2006;65(Suppl 3):50–8.
