T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
Bilimsel Araştırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No: 2011/08
Projenin Başlığı
Ubikitin Proteozom Sistemine Ait p97/Valosin-containing protein (VCP) Ve Etkileşimde Olduğu Proteinlerin Gelişmekte Olan Sıçan Testisi Ve Epididimisindeki
Lokalizasyonlarının Ve Ekspresyonlarının Belirlenmesi
Proje Yöneticisi Doç.Dr. Sevil ÇAYLI
Birimi
Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji ABD Araştırmacılar ve Birimleri
Uzm. Hakan Kesici Uzm. Zafer Karaca
Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji ABD
ÖZET
Ubikitin Proteozom Sistemine Ait p97/Valosin-containing protein (VCP) Ve Etkileşimde Olduğu Proteinlerin Gelişmekte Olan Sıçan Testisi Ve Epididimisindeki
Lokalizasyonlarının Ve Ekspresyonlarının Belirlenmesi
Bone morfogenetik protein ailesi (BMP) ve ubikütin proteazom sistem (UPS) üyelerinin sıçan testis ve epididimis gelişimi boyunca farklı biyolojik fonksiyonlarının olduğu bilinmektedir. Bizim son çalışmalarımızdan bir tanesinde, fare ve insan hücrelerinde Jab1/CSN5’in p97/VCP’ye direk olarak bağlandığı ve Jab1/CSN5’in p97/VCP’ye bağlanmış ubikütinlenmiş proteinleri kontrol ettiği gösterilmiştir. Fakat p97/VCP’nin Jab1/CSN5 ile olan ilişkisi ve p97/VCP’nin Jab1/CSN5 harici diğer başka proteinlerle olan ilişkisi bugüne kadar çalışılmamıştır. Smad1, BMP sinyal yolağında çalışan UPS’deki birçok proteinlerle etkileşebilen bir proteindir. Valosin-containing protein (p97/VCP), UPS substratlarının proteasomda parçalanmasını sağlayan şaperon bir proteindir. p97/VCP’nin birçok hücresel yolakta farklı fonksiyon gördüğü bilinse de, BMP sinyal yolağı ile olan ilişkisi postnatal sıçan testisinde gösterilmemiştir.
Bu çalışmanın amacı UPS proteinlerinin (p97/VCP, ubiquitin, Jab1/CSN5) ve BMP ailesine ait proteinlerin (Smad1 ve fosfo Smad1)’in postnatal sıçan testis ve epididimisinde hücresel lokalizasyonlarının belirlenmesi ve Smad proteinleri ile UPS proteinleri arasındaki etkileşimin araştırılmasıdır.
Postnatal 5-, 15-, 30- and 60-günlük sıçan testis ve epididimisleri üzerinde immunohistokimya, immunofloresan, Western blot ve immunopresipitasyon teknikleri uygulandı.
5 günlük sıçan testisinde, Smad1, fosfo-Smad1, p97/VCP, Jab1/CSN5 and ubiquitin gonosit ve Sertoli hücrelerinde ekspre edilmektedir. 15-, 30- and 60-günlük sıçan testisinde, p97/VCP ve Jab1/CSN5 and p97/VCP ve fosfo-Smad1 proteinlerinin spermatogonia, Sertoli hücreleri ve spermatositlerde birlikte kolokalize olduğu bulunmuştur. Sertoli hücre markerları ile p97/VCP ve Smad1 proteinlerinin Sertoli hücrelerindeki spesifik lokalizasyonu gelişmekte olan sıçan testisinde belirlendi. Epididimisde, bu proteinlerin ekspresyonlarının 5. Günden 60. güne doğru arttığı gösterildi. Smad1 ekspresyonunda epididimisin farklı bölgelerinde aynı tip dağılım gözlenirken, p97/VCP immunoreaktivitesinin kaput epididimisinde korpus ve kauda epididimise göre daha yüksek olduğu 15 ve 60 günlük sıçan epididimisinde bulundu. Koimmunopresipitasyon deneyleri, Smad1-p97/VCP ve p-Smad1- p97/VCP etkileşimini sıçan testisinde doğruladı.
Sonuç olarak, postnatal sıçan testisi ve epididimisindeki bazı Smad proteinleri (Smad1 ve p-Smad1) ve UPS proteinleri (p97/VCP, JAb1/CSN5, ubiquitin) arasındaki etkileşimin bulunması, UPS’in BMP sinyal yolağını spermatogenez boyunca kontrol edebileceğini göstermektedir.
ABSTRACT
The determination of localization and expression of Ubiquitin Proteasome System protein, p97/Valosin-containing protein (VCP) and its interacting partners in the
developing rat testis and epididimis
Members of the bone morphogenetic proteins (BMPs) and ubiquitin proteasome system (UPS) family are known to have different biological functions during rat testicular and epididymal development. Recently published data show that Jab1/CSN5 interacts with p97/VCP and controls the ubiquitination status of proteins bound to p97/VCP in mouse and human cells. However, coexpression of p97/VCP and Jab1/CSN5 in the developing rat testis and epididymis has not previously been studied. Smad1 is one of the signal transducers of BMP signaling and binds to several proteins involved in ubiquitin–proteasome system (UPS). Valosin-containing protein (p97/VCP) is required for the degradation of some UPS substrates. Although p97/VCP has been indicated in different cellular pathways, its association with BMP signaling in male reproductive system has not been elucidated.
The aim of the present study was to investigate the cellular localization of Smads (Smad1 and pSmad1), the UPS proteins (p97/VCP, ubiquitin, Jab1/CSN5) and the interaction of proteins in the postnatal rat testis and epididymis.
Testicular and epididymal tissues from 5-, 15-, 30- and 60-day-old rats were examined by immunohistochemistry, immunofluorescence, Western blotting, and immunoprecipitation techniques.
In 5-day-old rat testis, Smad1, phospho-Smad1, p97/VCP, Jab1/CSN5 and ubiquitin were mainly expressed in gonocytes and Sertoli cells. In 15-, 30- and 60-day-old rat testis, p97/VCP, Jab1/CSN5 and phospho-Smad1/5/8 were overlapped in spermatogonia, Sertoli cells, and spermatocytes. Sertoli cell markers showed the colocalization of Smad and p97/VCP in the developing rat testis. Expression of proteins in the epithelial cells of epididymis was gradually increased from 5 to 60 days of age. Expression of Smads showed uniformity in the different regions of epididymis, however p97/VCP immunoreactivity were higher only in caput epididymis compared to corpus and cauda epididymis in 15- and 60-day-old rat epididymis. Co-immunoprecipitation experiments further confirmed the Smad1-p97/VCP, p-Smad1- p97/VCP and ubiquitin-p97/VCP interactions in rat testis.
The interaction between some of Smad proteins (Smad1 and phospho-Smad1) and UPS proteins (p97/VCP, JAb1/CSN5, ubiquitin) in the postnatal rat testis and epididymis suggests that UPS may play important roles in mediating BMP signaling during spermatogenesis.
ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR)
Proje yürütücüsü, bu çalışmanın gerçekleşmesine katkılarından dolayı, aşağıda adı geçen kişi ve kuruluşlara içtenlikle teşekkür eder.
Projemizi başından sonuna kadar destekleyen GOP Universitesi BAP yöneticilerine ve tüm çalışanlarına,
Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı’nın tüm çalışanlarına,
Tıp Fakültesi Biyokimya ABD. tüm öğretim üyelerine hücre ekstratı hazırlamak için kullanılan homojenizatörü bizlerle paylaştıkları için teşekkür ederim.
KBB AB. üyelerinden sayın Doç. Dr. Ahmet Eyibilen, kendi projesinde kullandığımız AEC kromojeni ve kapatma solusyonunu bizim projemizde kullanmamıza izin verdiği için teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa ÖZET ii ABSTRACT iii ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR) iv İÇİNDEKİLER DİZİNİ v
SİMGELER VE KISALTMALAR vii
ŞEKİLLER DİZİNİ ix
ÇİZELGELER DİZİNİ x
GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER 1
1.1. Protein Yıkımı 1
1.2. Übikütin Protazom Sistemi (UPS) 1
1.3. VCP Bağımlı Protein Yıkımı 3
1.4. p97/VCP’in otofagozom oluşumundaki rolü 4
1.5. p97/VCP’nin selektif otofajiyi yönetmesi 5
1.6. p97/VCP ve Patalojisi 6
1.7. p97/VCP ile İlişkide Olan Proteinler ve fonksiyonları 6
1.8. COP9 Signalozom (CSN) 7
1.8.1. CSN’in Metalloproteaz Ve Denedilaz Aktivitesi 8
1.8.2. CSN İlişkili Protein Kinaz Ve Deübikütinlasyon Aktivitesi 9
1.9. Çalışmanın amacı 10
MATERYAL VE METOD 13
2.1. Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar 13
2.2. Antikorlar, Ait oldukları Kaynaklar Ve Kullanım Oranları 13
2.3. Deney Aletleri Ve Markaları 14
2.4. Kromojenler 14
2.5. Deney hayvanlarının sakrifiye edilmesi 14
2.6. İmmunohistokimya 15
2.7. İmmunofloresan 15
2.8. Çiftli boyama 16
2.9. Protein Biyokimyası İle İlgili Methodlar 16
2.9.1. Hücre Ekstraktının Hazırlanması 16
2.9.2. Protein Konsantrasyonunun Belirlenmesi (Bradford Yöntemi) 16
2.9.3. 1D-SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi 17
2.9.4. İmmunoblotlama 17
2.9.5. Komasi Mavi Boyası 18
2.9.6. Immün-çökeltme (Ko-immunopresipitasyon) 18
İSTATİKSEL ANALİZ 20
3.1. Semiquantitative HSCORE analizi 20
BULGULAR 21
4.2. Postnatal sıçan testisinde p97/VCP ile ilişkili proteinlerin ekspresyonun
belirlenmesi 22
4.3. p97/VCP ve Jab1/CSN5 birlikte lokalizasyonlarının postnatal gelişmekte olan
sıçan testisinde belirlenmesi 23
4.4. Postnatal gelişmekte olan Sertoli hücrelerinde p97/VCP ve Jab1/CSN5’nın
immunolokalizasyonları 24
4.5. Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde übikütin immunolokalizasyonları 25 4.6. Postnatal gelişmekte olan sıçan epididimisinde. p97/VCP
immunolokalizasyonları 25
4.7. Postnatal gelişmekte olan sıçan epididimisinde Jab1/CSN5
immunolokalizasyonları 27
4.8. Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde Bone morfogenetik protein (BMP) ailesi üyelerinin p97/VCP ile ilişkisinin belirlenmesi 28 4.9. p97/VCP ve Smad1’in birlikte lokalizasyonlarının postnatal gelişmekte olan
sıçan testisinde belirlenmesi 30
4.10. Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde Smad1 ve p97/VCP proteinleri arasındaki etkileşimin birlikte çökeltme (ko-immunopresipitasyon ) ile
belirlenmesi 32
4.11. Smad1’ın übikütinlenmesi ve p97/VCP ile bağlanması 33
TARTIŞMA 35
KAYNAKLAR 40
SİMGELER VE KISALTMALAR
aa : Aminoasit
APS : Amonyum persülfat
ATP : Adenosin 5'-trifosfat
bp : Baz çifti
BSA : Sığır serum albumin
cDNA : Komplementer DNA
COP : Sürekli fotomorfogenez
cPLA2 : sitosolik fosfolipaz
DNA : Deoksiribonükleik asit
DTT : Ditiotereitol
DUB : Deübikütinaz
ECL : Kemiluminisans
EDTA : Etil diamin tetraasetik asit
ERAD : Endoplasmik retikulum ilişkili yıkım ERK1/2 : Ekstrasellular sinyal-regüle edici kinaz1/2
FCS : Fetal sığır serumu
HRP : Horse radish peroksidaz
JAB1 : c-Jun-aktivasyon domain-bağlayıcı protein 1
JNK : c-Jun N-terminal kinaz
kb : Kilo baz.
kD : Kilo Dalton
LPS : Lipopolisakkarid
M : Molar
MAPK : Mitojen-aktive edici protein kinaz MES : Morfolin etan sülfonik asit
MIF : Makrofaj göçünü engelleyici faktör MOPS : 3-(N-Morpolin)-propan sülfonik asit
mRNA : haberci RNA
NaCl : Sodyum klorit
NCBI : Uluslarası Biyoteknoloji Bilgi Servisi
NHS : Normal at serumu
NP-40 : Nonidet P-40
PAGE : Poliakrillamit jel elektroforesi
PBS : Fosfat buferli tuz
PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu
PFA : Paraformaldehit
pH : -log c[H+]
PMSF : Fenilmetilsülfonil florit
PVDF : Polivinlidenflorit
RNA : Ribonükleik asit
RNase : Ribonükleaz
rpm : Revolutions per minute
SDS : Sodyum dodesilsülfat
TE : Tris-EDTA
TEMED : N-N’-N’-Tetrametilendiamin
TNF-α : Tümor nekroz faktörü alfa
Tris : Tris (hidroksimetil)-amino-methan
UPS : Übikütin protazom sistem
UV : Ultraviolet
V : Volt
VCP : Valosin-içeren protein
wt : vahşi tip
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
Şekil 1.2.1. Übikütin Sinyali 2
Şekil 1.3.1. VCP’nin yapısal domainleri. 3
Şekil 1.7.1: p97/VCP’nin çoklu fonksiyonları. 7
Şekil 1.8.1. CSN subunitelerinin birbiriyle ilişkileri. 8 Şekil 4.1.1: Postnatal 5 (A), 15 (B), 30 (C ve D) ve 60 (E ve F) günlük
sıçan testisinde p97/VCP lokalizasyonları. 21
Şekil 4.2.1: Postnatal 5 (G), 15 (H), 30 (I) ve 60 (J-L) günlük sıçan
testisinde Jab1/CSN5 lokalizasyonları. 22
Şekil 4.5.1: Postnatal 5 (A), 15 (B) ve 60 (C) günlük sıçan testisinde
übikütin lokalizasyonları. 23
Şekil 4.6.1: Postnatal 5 (A-C), 15 (D-F), 30 (G-I) v e 60 (J-L) günlük sıçan epididimislerinin kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA) bölgelerindeki
p97/VCP immunolokalizasyonları 24
Şekil 4.7.1: Postnatal 5 (A-C), 15 (D-F), 30 (G-I) ve 60 (J-L)
günlük sıçan epididimislerinin kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA)
bölgelerindeki Jab1/CSN5 immunolokalizasyonları. 20
Şekil 4.8.1: Postnatal 5 (A, B, G), 15 (C, D, H), 30(I) ve 60 (E, F, I)
günlük sıçan testisinde Smad1 ve fosfo-Smad1 lokalizasyonları. 22 Şekil 4.9.1. Smad1 ve p97/VCP’nin gelişmekte olan postnatal sıçan
testisinde birlikte lokalizasyonları. 32
Şekil 4.10.1. Smad1’in p97/VCP’ye gelişmekte olan sıçan testisi ve
epididimisinde in vivo bağlanması. 33
Şekil 4.11.1. Sıçan testisinde ubikütünlenmiş p-Smad1’in p97/
ÇİZELGELER DİZİNİ
Tablo Sayfa
GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER 1.1. Protein Yıkımı
Protein yıkımı, hücre içerisindeki proteinlerin steady-state diye adlandırılan normal düzeylerinde fonksiyon görmelerini sağlamak amacıyla işleyen düzenli bir mekânizmadır. Ökaryotlarda protein yıkımı, hem sitoplâzmada hem de çekirdek Übikütin Protazom Sistemi (UPS) ve onun düzenleyici proteinleri sayesinde gerçekleşmektedir. Bu düzenleyici proteinler arasında hem COP9 signalozom (CSN) hem de p97/Valosin containing protein (VCP) belirli substratların yıkımını kontrol etmektedirler (Ye ve arkd., 2001; Wei ve Deng, 2003).
Jab1/CSN5, p27Kip, Lutenize edici hormon reseptörü (LHR), p53, östrojen reseptörü, Smad4, Smad7, Id1, Id3 ve IκBα gibi birçok proteinin proteazoma bağlı yıkılımına yardımcı olmaktadır (Li ve arkd., 2000; Wan ve arkd., 2002; Berse ve arkd., 2004; Kim ve arkd., 2004; Yun ve arkd., 2004; Callige ve arkd., 2005).
1.2. Übikütin Protazom Sistemi (UPS)
UPS, ökaryotlarda hücreiçi düzenleyici proteinlerin seviyelerini kontrol etmede önemli bir fonksiyona sahiptir. UPS’in übikütinleme ve übikütinlenmiş proteinlerin yıkımı olmak üzere iki temel fazı vardır. İlk übikütinleme fazında, übikütin (Ub) ATP yardımıyla übikütin aktive edici enzimin (E1) sistein kuyruğuna eklenir ve sonra übikütin bağlayıcı edici enzimin (E2) sistein kuyruğuna transfer edilir. Son olarak ise, übikütin, protein ligaz (E3) sayesinde substratın lizin kuyruğuna transfer edilir. Ub, substrata izopeptid bağı ile bağlanır. Ub aktivasyonu ve ligasyonu, Ub’nin son aminoasidinin (G76) karboksil grubunda gerçekleşir (Şekil 1.2.1) (Pickart, 2001b, a).
Tek bir übikütin molekülünün substrata eklenmesi (monoübikütinleme) ise, lizozomal sınıflandırma, gen ekspresyonu ve endositoz gibi substratın farklı görevlerde iş yapmasına neden olmaktadır (Schnell ve Hicke, 2003)
Şekil 1.2.1. Übikütin Sinyali
A: Übikütin, übikütin aktive edici enzim (E1) ile aktive edilip ve sonra übikütin bağlayıcı
enzime (E2) transfer edilir. Substrat (mavi kutu) ve E2 enzimi özgün olarak übikütin protein ligaza bağlanabilirler ve de aktive olmuş übikütin substrata transfer olur. B: E3, substrata ve E2’ye farklı alanlarda bağlanır. Substrat, übikütinlenme sinyalı ile tanınır. C: Proteolizin gerçekleştiği 26S protazom, 19S kapak kısmı ve esas proteolitik aktiviteye sahip 20S kısmından oluşur. Proteoliz öncesi 19S kapakla bağlantılı deübikütinleyici enzimler ile substratdan übikütin zincirlerinin uzaklaşması sağlanır (Meusser ve arkd., 2005).
UPS siklusunun ikinci fazında, protazom poliübikütin zincirleri sayesinde, substratı tanır. Substrat, küçük peptidlerine yıkılır ve Ub’nin özgün deübikütinleyici enzimi sayesinde geri eldesi sağlanır. Ub’nin substrata konjugasyonu gibi, proteazomal yıkım da, ATP bağımlıdır. 26S proteazomun, hem übikütinlenmiş proteinlerin übikütinden ayrılması hem de onların yıkımlarının katalizlenmesinde önemli bir görevi vardır (Schwechheimer ve Deng, 2001; Pickart ve Cohen, 2004). Protazom, birbirine bağlı 2 farklı bölümden oluşmuştur (Figure 1.2.1C). 20S silindirik temel bölüm, proteolitik aktiviteye sahip iken, silindirik bölümün alt ve üst kısımlarına yerleşmiş 19S’lik proteazom kapakları poliübikütinlenmiş substratın tanınması ve proteoliz görevini üstlenmişlerdir. Herbir 19S kompleksi, 6 tanesi ATP az aktivitesine sahip 15-20 subuniteden oluşmuştur.
1.3. VCP Bağımlı Protein Yıkımı
97-kDa’luk Valosin-içeren protein (p97 ve ya VCP), übikütin-protazom sistemine bağlı proteolizde önemli fonksiyonlara sahiptir. Bu proteoliz, VCP’nin, übikütin ve kofaktörleri ile ilişkisine bağlıdır. VCP, UPS’de şaperon protein olarak görev yapmaktadır. Toplam hücresel proteinin 1% den fazlasının VCP olduğu bilinmektedir.
VCP, tip II AAA (ATPases Associated with a variety of Activities: Birçok aktivitesi bulunan ATPazlar) ATPaz ailesine ait bir proteindir ve AAA domaini olarak adlandırılan iki ATPaz domainine sahiptir (Neuwald ve arkd., 1999; Zwickl ve Baumeister, 1999; Vale, 2000; Maurizi ve Li, 2001; Ogura ve Wilkinson, 2001). VCP çeşitli türlerde farklı isimlerle anılmaktadır. Örneğin: arkebakteride VAT, mayada CDC48, Drosophilada TER94, memeli ve bitkilerde ise p97 ve ya VCP olarak bilinmektedir (Frohlich ve arkd., 1991; Pamnani ve arkd., 1997).
VCP, N-terminal domain (N), iki tane ATPaz domaini (D1 ve D2) ve de C-terminal domaini (C) olmak üzere dört domainden oluşmuştur. N terminal domaini, poliübikütin zincirlerine bağlanma ve substrat tanınmasından sorumlu iken, D1 ve D2 domainleri, VCP’nin şaperon aktivitesinden sorumludur (Figure 1.11.1) (Wang ve arkd., 2003).
Şekil 1.3.1. VCP’nin yapısal domainleri.
A: Walker A, B: Walker B ve SRH: VCP’nin D1 ve D2 domainlerindeki ikinci bölge homoloji motifleri. (Wang ve arkd., 2004).
Elektron mikroskobu çalışmaları, VCP’nin silindirik şekilli homo hekzemerik yapıda olduğunu kanıtlamıştır (Wang ve arkd., 2003).
VCP, hücre içerisinde birçok aktivitede görev yapmaktadır: hücresiklusu gelişimi (Cao ve Zheng, 2004), mitoz sonrası membrane kaynaşması ve iğ ipliklerinin ayrılması (Kondo ve arkd., 1997; Cao ve arkd., 2003; Wojcik ve arkd., 2004), yanlış katlanmış proteinlerin ER’dan geri atılımı (Ye ve arkd., 2001; Braun ve arkd., 2002; Jarosch ve arkd., 2002), proteazomda poliübikütinlenmiş proteinlerin degrade edilmesi (Ghislain ve arkd.,
1996; Dai ve Li, 2001) ve transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu (Hitchcock ve arkd., 2001; Rape ve arkd., 2001).
VCP, kofaktörlerinin de yardımıyla, übikütinlenmiş proteinlere özgün olarak bağlanır ve bu proteinlere 26S protazomda degrede olmadan önce, şaperonluk yaparak onlara yol gösterir. Substrat übikütinlenmesinden sonra, VCP protein komplekslerini birbirinden ayırmak için ATP’yi kullanır ve proteinlerin protazoma yönlenmesini sağlar. Örneğin: Herhangi bir şekilde stimüle edilmeyen hücrelerde, NF-κB sitoplâzmada inaktif formda inhibitör IκB proteini ile etkileşim halindedir (Karin ve Ben-Neriah, 2000; Santoro ve arkd., 2003). Sitimulasyona cevap olarak, NF-κB aktive olur ve IκBα hızlıca fosforile olup, poliübikütinlenir (Karin ve Ben-Neriah, 2000). Bunu takiben, VCP, poliübikütinlenmiş IκBα’ya bağlanır ve onu NF-κB kompleksinden ayırır (Dai ve arkd., 1998). IκBα’nın NF-κB’dan ayrılmasından sonra, NF-κB hedef genin regülâsyonu nedeniyle nükleusa transfer edilir. Bu arada, VCP, poliübikütinlenmiş IκBα’ya şaperonluk yaparak, onun 26S proteazomda yıkımı için yol gösterir (Dai ve arkd., 1998).
1.4. p97/VCP’in otofagozom oluşumundaki rolü
Otofaji, uzun süreli hücrede depo edilen proteinleri, makromolekülleri ve ya hasarlı organelleri elimine etmek için ökaryotlarda kullanılan evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir. Otofaji, genelde hücrenin yaşamını sürdürmesi amacıyla açlık, çeşitli stres ve hücrede emekliye ayrılmış dokuları ortadan kaldırmak amacıyla kullanılır. Otofajinin 3 tipi vardır.1-Şaperon aracılı otofaji 2-Makrootofaji 3-Mikrootofaji. Şaperon aracılı otofaji, yüksek ökaryotik canlılarda görülür ve lizozomda sitosolik proteinlerin yıkımına sebep olur. Makrootofaji ise çift membranlı, sitoplazmik materyali yutup bu materyalin yıkımı için lizozom ve ya vakuol ile birleşebilen otofagozomun oluşumu ile karakterizedir. Mikrootofaji ise vakuol ya da lizozom oluşumu ile sitosolik kompartmanların direk yıkımı ile ilişkilidir. Bugüne kadar, mayada 35 tane Autophagy related genes (ATG) (ATG1 den ATG35 e kadar tanımlanmıştır. Bunlardan Atg8 (memelideki karşılığı LC3), otofagozom oluşumu için gereklidir.
p97/VCP’nin otofagozom maturasyonundaki rolü ilk memeli hücrelerinde, p97/VCP’nin N terminal ve D1 domainlerinde mutasyonunun neden olduğu IBMPFD hasta
lığında ortaya çıkmıştır. IBMPFD’li VCP mutasyonu gösteren hücrelerde otofagozom markerlerının LC3II ve p62 nin fazlaca ekspre edildiği görülmüştür. p97/VCP, siRNA yöntemiyle nakdavn edildiğinde, p62 ve LC3II nin hücre sitoplazması içerisinde toplandığı saptanmıştır. Bütün bunlar p97/VCP’nin otofajik protein degradasyonunda gerekli bir protein olduğunu göstermektedir. Aynı zamanda, p97/VCP’nin otofagozom-lizozom füzyonunda ve otolizozom oluşumunda gerekli olduğu çalışılmıştır. p97/VCP mutant hücrelerin otofagozomlarında ubiquitinin toplandığı görülmüş ve p97/VCP’nin ubikütinlenmiş substratların otofajik degradasyonları için gerekli olabileceğini önermektedir. Fakat p97/VCP aracılı otofagozom-lizozom füzyonunun mekanizması ve ya bazı otofagozom ilişkili proteinlerin ubikütin benzeri domainler ile ilişkisi tam olarak açıklanamamıştır.
1.5. p97/VCP’nin selektif otofajiyi yönetmesi
Mitokondri ve peroksizomlar mitofaji ve pekzofaji olarak bilinen yöntem ile yıkılmaktadırlar. Nükleusun bir kısmı, 60S ribozomal ünite ve endoplazmik retikulum yine otofaji yöntemiyle yıkılmaktadır (Dargemont C, 2011, Paris). Maya hücrelerinde yapılan çalışmada, nitrojen yokluğunda olgun ribozomların 60S ünitelerinin degrade olduğu gösterilmiştir. Mitofaji ile ise hasarlı ve ya fonksiyon görmeyen mitokondrinin eliminasyonu sağlanmaktadır. Birçok mitokondriyal proteinin (Atg32, Atg11…) stress ve ya yaşlılık gibi durumlarda otofajik yıkım için devreye girdiği bilinmektedir. Memeli hücrelerinde mitokondrilerin iş görmemesi Parkinson hastalığı gibi önemli nörodejenaratif patolojiler ile ilişkilendirilmiştir. PARK2 gen ürünü olan Parkin’nin mutasyona uğraması, Parkinson hastalığı ortaya çıkmaktadır. Parkin hasarlı mitokondrilerin toplanması ve fonksiyon görmeyenlerin eliminasyonu için gereklidir. p97/VCP’ninde, Parkin aracılı mitokondriyal yıkım için gerekli olduğu belirlenmiştir. p97/VCP’nin aynı zamanda, hasarlı mitokondriyal membranlarındaki ubikütinlenmiş proteinleri membranlardan ayırıp proteasomda degrade olabilmelerini sağlamaktadır. p97/VCP’nin endoplasmik retikulumun ve nükleusun bir parçasının yıkımında da fonksiyon görebileceği gösterilmiştir.
1.6. p97/VCP ve Patalojisi
p97/VCP’nin birçok hastalığın patogenezinde rol oynamaktadır. p97/VCP ile ilişkili, birçok hastalığın farklı sistem ve organlardaki dağılımı Tablo 1.6.1’de gösterilmiştir (Lue ve arkd., 2002). Bu hastalıkların çoğunda VCP geninin ilgili bölgesinde mutasyonlar saptamıştır.
Tablo 1.6.1. p97/VCP ile İlişkili Patolojiler
Sistem ve organlar Patoloji
Kemik ve eklemler Paget hastalığı
Kas Inklüzyon cisimcik miyopati
Beyin Frontotemporal demans
Göz Katarak
Beyin Parkinson, Alzhmeir, ALS
1.7. p97/VCP ile İlişkide Olan Proteinler ve fonksiyonları
Birçok proteinle olan ilişkisi nedeniyle, p97/VCP hücrede çok çeşitli aktiviteler göstermektedir (Şekil 1.7.1). Bu şekilde, p97/VCP’nin protein degradasyonu, hücre siklusu kontroli, otofaji gibi birçok önemli fonksiyonu yerine getirdiği özetlenmiştir.
Şekil 1.7.1: p97/VCP’nin çoklu fonksiyonları. p97/VCP ve kofaktörleri birçok biyolojik fonksiyonun yerine getirilmesinde görev alırlar. Sarı yuvarlak içindekiler: membran oluşumu ile ilgili fonksiyonları. Mavi ve yeşil yuvarlak içindekiler: Protein yıkımı ile ilgili fonksiyonları, Pembe daire içindekiler: Hücre siklusu ve DNA’nın işlenmesi ile ilgili fonksiyonları göstermektedir.
1.8. COP9 Signalozom (CSN)
CSN, UPS’in en önemli üyelerinden birisidir. Deng ve arkadaşları, 1994 ilk olarak, Arabidops’larda (COP: constitutive photomorphogenesis: sürekli ışıkla değişim), ışık bağımlı gelişimin baskılayıcısı olarak tanımlanmıştır (Wei ve arkd., 1994; Wei ve Deng, 1999). Jab1/CSN5 içeren signalozom olarak da bilinen memeli CSN kompleksi, izole edilip, 26S proteazom ile birlikte saflaştırılmıştır (Seeger ve arkd., 1998).
CSN, gel filtrasyon kolonlarında, 450-550 kDa moleküler ağırlığında olduğu saptanmış ve CSN1’den CSN8’e kadar 8 subuniteden oluşmuştur (Şekil 1.9.1). CSN subunitelerinin en belirgin karakteristik özellikleri, PCI/PINT (Proteazom, COP9 signalozom, Initiation factor 3/Proteazom subunits, Int-6, Nip-1, ve TRIP-15) ve MPN/MOV34 (Mpr1 Pad1-N-terminal) domainlerinin bulunmasıdır (Aravind ve Ponting, 1998). Bu iki domain aynı zamanda, CSN yanında, 26S proteazom kapak kompleksinde ve ökaryotik translasyon başlatıcı faktör 3 (eIF3)’de de bulunmuştur (Glickman ve arkd., 1998; Wei ve arkd., 1998). Ökaryatik hücrelerde, lizozomal olmayan protein yıkımından sorumlu 26S proteazom (detaylar için 1.10’da Şekil 1.10.1C’ye bakınız,), 20S kor ve 19S
düzenleyici iki kısımdan oluşmuştur. İlginç olarak, sekiz CSN subunitelerinin herbiri, 19S düzenleyici bölümün kapak kısmındaki unitelerle homoloji göstermektedir. Bu homoloji, CSN ve proteazom kapağının, evrimsel olarak aynı atadan gelebileceğini göstermektedir.
Şekil 1.8.1. CSN subunitelerinin birbiriyle ilişkileri. MPN domainine sahip olan subuniteler mavi, PCI
domainine sahip olanlar ise sarı ile gösterilmiştir. CSN2 ve CSN7’nin fosforilasyonu ise kırmızı ile belirtilmiştir. CSN’nin aşağıda açıklanan birçok biyokimyasal aktiviteleri vardır:
1.8.1. CSN’in Metalloproteaz Ve Denedilaz Aktivitesi
Jab1/CSN5, JAMM (Jab1/MPN domain-associated metalloisopeptidase: Jab1/MPN domain-ilişkili metaloizopeptidaz) ya da MPN olarak bilinen metalloproteaz motifini içerir. Bu motifdeki mutasyonun, metalloproteaz aktivitesini engellediği görülmüştür. Benzer bir şekilde, proteazom kapağında yer alan, Jab1/CSN5 paralogu olan ve 26S proteasomun deübikütinleme aktivitesinden sorumlu RPN 11’nın da, aynı motifi içerdiği bilinmektedir (Verma ve arkd., 2002). Diğer bazı proteinlerde, JAMM/MPN motifine sahip olmalarına rağmen (Maytal-Kivity ve arkd., 2002; McCullough ve arkd., 2004; Bellare ve arkd., 2006), bu proteinlerin metalloproteaz aktivitesi göstermedikleri saptanmıştır. Hem Jab1/CSN5 hem de RPN11, ancak CSN kompleksi ya da 26S proteazom yapısında bulundukları zaman bu aktiviteyi gösterdikleri belirlenmiştir (Cope ve arkd., 2002). Jab1/CSN5 ve RPN11’in metalloproteaz aktiviteleri, deübikütinleme ve denedilasyon aktiviteleri ile uyumlu bir şekilde yönetilmektedir.
Moleküler biyololojide ilgileri çeken CSN’nin diğer bir önemli fonksiyonu da, Jab1/CSN5’in MPN motifinden dolayı, SCF kompleksinin denedilasyonunda görev almasıdır. SCF übikütin ligaz kompleksi, CSN’nin temel hedefidir. SCF, hedef proteine übikütinin eklenmesinde görev yapan bir E3 übikütin ligazdır. Übikütin eklenmesine benzer bir şekilde, nedilasyon, Nedd8 aktive edici enzimler ile katalize edilmektedir. Fakat, denedilasyon ise Jab1/CSN5’in metaloisopeptidaz aktivitesi ile katalize edilmektedir (Cope ve arkd., 2002). Nedilasyon ve denidilasyonun aktif bir şekildeki bu siklusu, SCF aktivitesinin sağlanması için gereklidir.
1.8.2. CSN İlişkili Protein Kinaz Ve Deübikütinlasyon Aktivitesi
CSN’nin c-Jun (Ser63 ve Ser73), IκBα, NF-κB prekürsörü p105’i ve de tümör supresörü p53 (Ser149, Thr 150 ve Thr 155)’ü fosforladığı in vitro olarak gösterilmiştir (Seeger ve arkd., 1998; Bech-Otschir ve arkd., 2001). Aynı zamanda, bazı CSN subuniteleri üzerinde fosforlanma alanları bulunmasından dolayı da, CSN’nin kendisi de fosforlanmaya hedefdir (Henke ve arkd., 1999).
Son olarak, übikütin isopeptidaz aktivitelerinin CSN ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (Groisman ve arkd., 2003; Zhou ve arkd., 2003; Hetfeld ve arkd., 2005; Schweitzer ve arkd., 2007). CSN’nin deübikütinleme aktivitesi iki yolla açıklanmaktadır: CSN ya mono-übikütinlenmiş substratlardan übikütinin ayrılmasını ya da poliübikütin zincirlerinin depolimerize olmasını sağlar (Groisman ve arkd., 2003). CSN’nin bu ilk aktivitesi, Jab1/CSN5’indeki metaloproteaz domainine ihtiyaç duyarken (Groisman ve arkd., 2003), sonraki aktivitesi ise tüm CSN ile ilişkilidir (Zhou ve arkd., 2003; Hetfeld ve arkd., 2005; Schweitzer ve arkd., 2007). Kısacası, CSN hem denidilasyon hem de deübikütinlasyon aktivitelerine ya kendisi sahiptir ya da diğer deübikütinleyici enzimlerle ilişkide olması nedeniyle yürütmektedir.
1.9. Çalışmanın amacı
p97/VCP’nin, yukarıdaki bölümde detaylı bir şekilde anlatıldığı gibi hücreiçi birçok temel fonksiyonu yerine getirdiği bilinmektedir. Fakat p97/VCP’nin erkek üreme hücrelerinde ve testisde ekspresyonu ve etkileşimde olduğu proteinler çalışılmamıştır. Bu nedenle bu çalışmada öncelikle biz p97/VCP’nin gelişmekte olan sıçan testisinde ekpresyonunu göstermeyi, ikincil olarak da p97/VCP’nin bağlandığı ya da etkileşimde olduğu ya da olabileceği proteinlerin postnatal sıçan testisinde ekspresyonlarını incelemeyi amaçladık.
MATERYAL VE METOD
Projemizin bu bölümünde, deneyler boyunca kullanılan sarf malzemeler ve ait oldukları kaynaklar ayrı başlıklar halinde verildi.
2.1. Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar
Asetik asit Merck, Darmstadt
Akrilamid 30% Roth, Karlsruhe
Kloroform Merck, Darmstadt
Komasi Mavisi Boyası Sigma-Aldrich, Steinheim
1,4-Ditiotetritol Roche, Mannheim
Etanol Sigma-Aldrich, Steinheim
Igepal CA-630 (NP-40) Sigma-Aldrich, Steinheim
Magnezyum klorid Merck, Darmstadt
Magnezyum sülfat Sigma-Aldrich, Steinheim
Mangan klorid Merck, Darmstadt
β-Merkaptoethanol AppliChem, Darmstadt
Methanol Sigma-Aldrich, Steinheim
Morfolinethan sülfonik asit Serva, Heidelberg
Süttozu Bio-Rad, München
Formaldehit Merck, Darmstadt
Fenilmetilsülfonilflorid Sigma-Aldrich, Steinheim
Ponseu S Roth, Karlsruhe
Potasyum klorit Merck, Darmstadt
Sodyum klorid Sigma-Aldrich, Steinheim
Sodyum dodesil sülfat Merck, Darmstadt
Tris Roth, Karlsruhe
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Steinheim
Tween-20 Roth, Karlsruhe
2.2. Antikorlar, Ait oldukları Kaynaklar Ve Kullanım Oranları
Primer antikorlar Firması Dilusyon oranı
Rabbit α-Jab-1 Santa Cruz, USA 1:500
α-Biotin-HRP Amersham, Freiburg 1:1,500
Mouse α-VCP ABR, USA 1:1,000
Rabbit α-VCP Santa Cruz, USA 1:200
Rabbit α-ubiquitin Abcam 1:200
Mouse α-p27 Santa Cruz, USA 1:3,000
Rabbit α-sitokeratin 18 Abcam , UK 1:250
Rabbit α-Smad1 Axxora, USA 1:500
Rabbit α-p-Smad1 Abcam, UK 1:500
Sekonder antikorlar
Goat α-rabbit-HRP ICN, Ohio, USA 1:10,000
α-rabbit IgG-Rhodamine Chemicon, Hampshire, UK 1:1,000
α-mouse IgG-FITC Dianova, Hamburg 1:1,000
Rabbit α-mouse IgG Cell Signaling , USA 1:100
2.3. Deney Aletleri Ve Markaları
Hassas terazi Korn ABJ, Turkiye
Microdalga fırını Arcelik, Turkiye
Mini santrifüj Biosan, Turkiye
Floresan mikroskobu Nikon, Almanya
Power supply uniteleri Thermo Scientific
Pre-Kast Gel Sistemi Invitrogen, Almanya
SDS jel elektroforez uniteleri Invitrogen, Almanya
IBlot kuru blotlama unitesi Invitrogen, Almanya
Orbital karıştırıcı Sigma, Almanya
Shaker Velp Scientifica
Mikrotom Leica, Almanya
Etuv Nüve, EN500
2.4. Kromojenler
DAB (Diaminobenzidine) Sigma, Germany
AEC Syctek Lab
Fast red Sigma, Germany
2.5. Deney hayvanlarının sakrifiye edilmesi
Bu çalışmada 24 adet Wistar albino erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar postnatal gelişimlerine göre 5 günlük, 150 günlük, 30 günlük ve 60 günlük olmak üzere dört gruba ayrıldı. Bütün gruptaki sıçanlar yüksek doz intraperitonal pentobarbital (100mg/kg) ile sakrifiye edilip, testis ve epididimis dokularının bir kısmı immunohistokimyasal çalışmalar için bouin fiksatifine konuldu ve bir kısmı ise immunopresipitasyon ve western blot çalışmaları için -800C de saklandı.
2.6. İmmunohistokimya
5 günlük, 15 günlük, 30 günlük ve 60 günlük sıçanlardan elde edilen testis ve epididimis dokuları Bouin çözeltisinde tespit edilip parafine gömme uygulandı. Uzerinde rutin histolojik doku takipleri yapıldıktan sonra, bir gece 56°C’ da inkübe edildi. Mikrotomla 5 mikronluk kesitler, poli-L-lizin kaplı lamlarda (Sigma, St. Louis, MO, USA) toplandı ve alınan kesitler ksilol ve dereceli alkol serilerinden geçirilip dehidrate edildi. Suya kadar indirilen dokular, 0.1M sitrik asit solusyonu (pH: 6) içerisinde 5 er dakika 2 kez mikrodalgada kaynatıldı. PBS ile 3 kez 5 er dakika yıkama işleminden sonra, endojen peroksidaz aktivitesi %3’lük hidrojen peroksidazla baskılandı. Tekrar PBS ile 3 kez 5 er dakika yıkama işleminden sonra, oda ısısında kesitler spesifik olmayan reaksiyonu engellemek için 10 dk. bloklama serumla (ScyTek Laboratorları, USA) bloklandı. 10 dk/ lik inkübasyon sonrası, PBS ile oda sıcaklığında yıkamadan sonra sırayla biotinlenmiş sekonder antikorlar (ScyTek Laboratories, USA) ve peroksidaz-işaretli streptavidin (ScyTek Laboratories, Utah, USA) ile toplam 50 dakika inkübe edildi. Peroksidaz aktivitesi, 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) (ScyTek Laboratories, USA) kromojeni ile inkübasyon sonucu görünür hale getirilip, Mayer’in hematoksileni (ScyTek Laboratories, Utah, USA) ile zıt boyama yapıldı. Sonrasında, slaytlar su bazlı kapatma solusyonu (Fisher Chemicals, Springfield, NJ, USA) ile kapatıldı. Kontroller için, kesitler primer antikorla benzer konsantrasyonda normal tavşan serumuyla inkübe edildi. Boyanan kesitler Leica mikroskop (Leica DM2500, Nussloch, Almanya) altında fotoğraflandırıldı. Sekonder antikorun horseradish peroxidase (HRP) ya da alkaline fosfotaz (AP) ile konjuge olma durumuna göre, AEC nin yanında, DAB veya Fast red gibi kromojenler de kullanılarak immunopositif bölgeler görünür hale getirildi.
2.7. İmmunofloresan
Bir önceki bölümde anlatılan immunohistokimya yönteminin temel basamakları aynı olmak şartıyla, kullanılan sekonder antikorların rhodamine ve FITC gibi belli dalga boylarında floresan renk vermesi nedeniyle özellikle çiftli boyamalarda immunofloresan işaretleme yöntemi tercih edilir. Kısaca bizim çalışmamızda, primer antikorlarla inkubasyondan sonra, rhodamine ile işaretli anti mouse ve FITC ile işaretli anti rabbit
sekonder antikorları ile 1 saat oda ısısında inkübasyon gerçekleştirildi. Floresana uygun kapatma medyumu ile slaytlar kapatılarak, Nikon microscope (Nikon E600, Germany) altında fotoğraflar çekildi.
2.8. Çiftli boyama
Çalışmamızda iki farklı proteinin aynı bölgede lokalizasyonunu göstermek amacıyla testiküler ve epididimal dokular üzerinde çiftli boyamalar yapıldı. Her iki primer antikor (p97/VCP ile Jab1/CSN5, Smad1 ile p97/VCP) belirlenen dilusyon oranlarında aynı zamanda uygulanıp, geceboyu 4oC’de inkübe edildi. Ertesi gün, yıkama işleminden sonra,
rhodamine-konjuge anti-mouse-Ig ile 1 saat oda ısısında inkübe edilip, ardından ikinci yıkamaya geçildi ve sonrasında, FITC-konjuge anti-rabbit-Ig ile 1 saat inkübe edildi. Yıkama işlemlerinden sonra kapatma solüsyonuyla kapatılıp, floresan mikroskobu altında incelendi.
2.9. Protein Biyokimyası İle İlgili Methodlar 2.9.1. Hücre Ekstraktının Hazırlanması
Sıçandan elde edilen testiküler ve epididimal dokular direk sıvı nitrojen tankı içine atılıp uzun süreli saklama1ar için -80C’de bekletildi. Doku lizis edileceği zaman havanla ezilip, un gibi parçalanmış dokular üzerine 1 ml lizis solusyonu (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 µM leupeptin, 1 mM PMSF) eklendi ve 15 dakika inkübe edildi (0,6 gr doku başına 600µl lizis bufer). Sonrasında, dokular lizis bufer içinde sonikasyona tabi tutuldu (iki kez 10 saniye, 200-300 W, herbir sonikasyon için 10 saniye örnekler buzda bekletildi). Sonikasyon sonrası, 13,000 x g’de 10 dakika, 4°C’de santrifüj edildiler. Santrifüj sonrası elde edilen supernatan hücre sitoplazmik ekstraktı olarak kullanılırken, pellet kullanılmadı.
2.9.2. Protein Konsantrasyonunun Belirlenmesi (Bradford Yöntemi)
Bradfort yöntemi, solusyondaki protein konsantrasyonunun belirlenmesi için kullanıldı. Deneyde kullanılan Bradfort boyası 1:4 oranında distile su ile diluye edildi (1 hacim stok Bradfort boyası, 4 hacim distile su ). Diluye öncesi mavi olan boya, diluye işleminden sonra kahverengini aldı. Standart olarak, 0, 250, 500, 1000, 1500, 2000 µg/ml
konsantrasyonlarında Bovine serum albumin (BSA) kullanıldı. Hem standartlar hem de örnekler, PBS içerisinde hazırlandı ve 1ml lik diluye Bradfort solusyonu 20 µl örnek ve standart ile karıştırıldı. 5 dakika inkubasyon süresi sonunda 595nm absorbans altında spektrofotometrede ölçümler yapıldı.
2.9.3. 1D-SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Sodyum-dodesil-sülfat (SDS) poliakrilamid jel elektroforezi (Laemmli, 1970), hücre ekstraktlarındaki protein ekspresyonlarını belirlemek amacıyla kullanıldı. %18’lik ayırıcı jel solusyonu (375 mM Tris-HCl pH 8.8, %0.1 SDS, %18 akrilamid, %0.05 APS, %0.05 TEMED), 1 mm aralıklı iki cam plaka arasına döküldü. Polimerasyon sonrası, üst ayrıştırıcı jel solusyonu (125 mM Tris-HCl pH 6.8, %0.1 SDS, %4 akrilamid, %0.05 APS, %0.1 TEMED), bölgeye yerleştirilen taraklar üzerine döküldü. Örnekler ise, l x SDS jel yükleme solusyonu (62.5 mM Tris pH 6.8, %2 SDS, %5 gliserol, %0.3 bromofenol mavisi, %0.9 (v/v) β-merkaptoethanol) içerisinde hazırlanıp, 5 dakika kadar kaynatılıp proteinlerin denature olması sağlandı. Üst jelin polimerazyonu sonucu tarak jelden uzaklaştırılıp, elektroforez kabı içerisine yerleştirildi. Kab 1x SDS elektroforez solusyonu (25 mM Tris, %1.44 glisin, %0.1 SDS) ile doldurulup, tarağın uzaklaşması ile oluşan veller yıkanmış ve örnekler herbir vele teker teker yüklendi. Elektroforez, 150V altında yürütüldü.
İmmunoçöktürme için, örnekler NuPAGE % 4-12 lik gradient-jelllerde, elektroforez solusyonu olarak 1x MES solusyonu (50 mM MES, 50 mM Tris, 3.46 mM SDS, 1.025 mM EDTA) ve ya 1x MOPS (50 mM MOPS, 50 mM Tris, 3.46 mM SDS, 1.025 mM EDTA ) solusyonu kullanılarak 200 V’da 1saat yürütüldü.
2.9.4. İmmunoblotlama
Proteinler, jelde yürütülüp, iBlot blotlama stackları (İnvitrogen) kullanılarak kuru blotlama yöntemi ile PVDF membranlara transfer edildi. Proteinlerin membrana transferinden sonra, membran bloklama solusyonu (% 0.1 Tween-20 içeren PBS ile hazırlanmış %5 (w/v)’lik non-fat dry milk) ile oda ısısında 1 saat rotator üzerinde inkübe edildi. Hemen ardından, membran geceboyu oda ısısı veya 4°C’de bloklama medyumunda hazırlanmış primer antikorla inkübe edildi. Üç kez 10’ar dakika PBS-Tween ile yıkama
sonrası, membran 1 saat bloklama solusyonu içerisinde hazırlanmış sekonder antikor ile inkübe edildi. Üç kez 10’ar dakika, PBS-Tween ile yıkandıktan sonra, membran ECL Deteksiyon Ajanı ile (1:1 oranında (v/v) Ajan 1: Ajan 2) 2-5 dakika kadar inkübe edildi. Daha sonra, membran plastik folye arasına konulup, X-ray filmi üzerine ekspoz edilip, film geliştirildi.
2.9.5. Komasi Mavi Boyası
Elektroforez sonrası, jel 1 saat fiksatif solusyonu (40% metanol içinde hazırlanmış %7 glasial asetik asit) içerisinde inkübe edildi. Boyama solusyonu ise, 4 volüm 1X Brilliant Blue G-Colloidal (Sigma) ve 1 volüm metanolün karışımı ile hazırlandı. Boyama solusyonu içerisinde, gece boyu rotator üzerinde inkübe edildi. Daha sonra jel, 60 saniye fazla boyanın uzaklaştırılması amacıyla boya uzaklaştırıcı solusyon I (destaining solusyon: % 25 (v/v)’lik metanol içinde hazırlanmış %10 asetik asit) ve ardından boya uzaklaştırıcı solusyon II (% 25 metanol) ile yıkandı. Jelin saklanması için, skan edilip, iki sephalon arasında kurumaya bırakıldı.
2.9.6. Immün-çökeltme (Ko-immunopresipitasyon)
Dokular proteinaz inhibitörü içeren 500 µl RIPA solusyonu (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM K2HPO4, %10 gliserol, %1 NP–40, %0.15 SDS,
1 mM Na3VO4, 1 mM sodyum molibdat, 20 mM NaF, 0.1 mM PMSF) ile lizis edildi.
Dokular, lizis solüsyonu içinde homojenize edilip, 21’lik insulin iğneleri ile süspansiyon haline getirilirler ve sonrada 10 dakika 4°C’de 13,000 x g de santrifüj edildiler. Santrifüj sonrası elde edilen supernatan (500µl), 1:2 oranında immunoçöktürme (IP) solusyonu [20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 20 mM NaF, proteaz inhibitor koktail (Sigma)] ile dilüye edildi. Bu arada, 30 µl Protein G-Sepharose 4B Fast Flow boncukları (Amersham), IP için kullanılacak 1-2 µg antikor ile odaısısı veya 4°C’de rotator üzerinde (10 r.p.m.) 3 saatten geceboyuna kadar inkübe edildi. Daha sonra, hazırlanan hücre ekstraktı, antikor ile yüklenmiş Protein G boncukları ile 4°C’de rotator üzerinde, 3 saatten geceboyuna kadar değişen sürelerde inkübe edildi. İnkübasyon sonunda, boncuklar 3 kez 1ml soğuk IP solusyonu ile yıkandı. Yıkama solusyonunun uzaklaştırılmasından sonra, boncuklar üzerinde toplanmış immun kompleksler, 25 µl’lik 3x
SDS–PAGE yükleme solusyonu ile süspanse edilip, 10 dakika 95°C’de kaynatılmış ve immun kompleksler NuPAGE % 4-12 Novex Bis-Tris jelinde (Invitrogen) yürütüldü. Amaca uygun olarak, elektroforez sonunda jel ya immunoblot için Nitrosellulöz membrana aktarıldı ya da kollaidal Komasi mavi boyası ile boyandı.
İSTATİKSEL ANALİZ
3.1. Semiquantitative HSCORE analizi
Herbir kesit için ışık mikroskobu altında 40X büyütmede birbirinden habersiz iki araştırmacı tarafından rastgele beş alan seçildi ve bu alanlar içinde hücrelerin boyanma yoğunluğuna göre [0 (boyanma yok), +1 (zayıf, fakat tespit edilebilir boyanma), +2 ( orta şiddetli boyanma) ve +3 (yoğun boyanma)] hücre sayımı yapıldı. Hesaplama için HSCORE formulü kullanıldı [∑Pi(i+ l): i boyanma yoğunluğu skorunu, Pi boyanan hücrelerin yüzdesini gösterir]. İki gözlemcinin hesapladığı skorların ortalaması alındı ve HSCORE değerleri grafikle gösterildi.
İstatiksel değerlendirmeler SigmaStat versiyon 3.5 (Jandel Scientific Corp., San Rafael, CA) kullanılarak ve anlamlılık p< 0.05 olarak değerlendirilmiştir. Farklı postnatal günlerde elde edilen dokularda ortaya çıkabilecek muhtemel farklılıklar karşılaştırmalı testler (ANOVA, t-test) ve korelasyon regresyon analizleri (Pearson, Spearman) ile değerlendirildi.
BULGULAR
4.1. Postnatal sıçan testisinde p97/VCP ekspresyonun belirlenmesi
Histolojik takipler sonucunda parafine gömülü 5, 15, 30 ve 60 günlük postanatal gelişimlerini tamamlamış sıçan testislerinde p97/VCP immunohistokimyası sonucunda, bu proteinin öncelikle gelişmekte olan testisde immunolokalizasyonu belirlendi. p97/VCP proteinin en fazla ve en güçlü gonosit, Sertoli hücreleri, spermatositler ve uzamış spermatidlerde immunoreakvitide gösterdiği belirlendi (Şekil Şekil 4.1.1’de).
Şekil 4.1.1: Postnatal 5 (A), 15 (B), 30 (C ve D) ve 60 (E ve F) günlük sıçan testisinde p97/VCP lokalizasyonları. A: 5 günlük sıçan testisinde p97/VCP’nin en fazla gonositlerde (GC) ve daha az olarakta intertisyal hücrelerde immunoreaktivitesi gözlenmektedir. Bu resmin üstündeki küçük karade, p97/VCP antikoru kullanılmadan yapılan immunohistokimya sonucundaki negatif kontrol kesiti görülmektedir. B: 15 günlük sıçan testisinde Sertoli (Se) ve spermatogonia (Sg) hücrelerinde nüklear immunoreaktivite ve Spermatositlerde (Sc) sitoplazmik immunoreaktivite izlenmektedir. C ve D: 30 günlük sıçan testisinde, Se, Sg, Sc ve uzamış spermatidlerde (eSt) p97/VCP immunolokalizasyonu saptanmıştır. Küçük sağ kare: Negatif kontrol E ve F: 60 günlük ergin sıçan testisinde Se, Sc ve eSt deki belirgin immunoreaktivite gözlenmektedir. Bar: 50 µm.
4.2. Postnatal sıçan testisinde p97/VCP ile ilişkili proteinlerin ekspresyonun belirlenmesi
Postnatal sıçan testisinde p97/VCP ile ilişkili proteinlerden ilk olarak çalıştığımız protein Jab1/CSN5’dır. Öncelikle bu proteinin postnatal gelişmekte olan testisde p97/VCP ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için, Jab1/CSN5’nın immunoekspresyonunu araştırdık. Yapılan immunohistokimyasal çalışmalar sonucunda, Jab1/CSN5 proteininin, gonosit, spermatosit, Sertoli hücreleri ve uzamış spermatidlerde immunolokalizasyonu belirlenmiştir (Şekil 4.2.1). Jab1/CSN5 ekspresyonunun postnatal gelişime bağlı olarak dereceli bir şekilde arttığı yapılan Hscore analizi ile gösterilmiştir (Şekil 4.2.1-M).
Şekil 4.2.1. Postnatal 5 (G), 15 (H), 30 (I) ve 60 (J-L) günlük sıçan testisinde Jab1/CSN5 lokalizasyonları. G: 5 günlük sıçan testisinde Jab1/CSN5’nin sadece gonositlerde (GC) immunoreaktivitesi gözlenmektedir. Bu resmin üstündeki küçük karade, Jab1/CSN5 antikoru kullanılmadan yapılan immunohistokimya sonucundaki negatif kontrol kesiti görülmektedir. H: 15 günlük sıçan testisinde Sertoli (Se), spermatogonia (Sg) ve Spermatositlerde (Sc) immunoreaktivite izlenmektedir. I: 30 günlük sıçan testisinde, Se, Sg, Sc ve uzamış spermatidlerde (eSt) Jab1/CSN5 immunolokalizasyonu saptanmıştır. J-L: 60 günlük ergin sıçan testisinde Sg, Sc ve eSt deki belirgin immunoreaktivite gözlenmektedir. Küçük sağ kare: Negatif kontrol M: Gelişime bağlı olarak 5, 15, 30 ve 60 günlük sıçan testisinde p97/VCP ve Jab1/CSN5’nın karşılaştırmalı Hscore analizleri gözlenmektedir. Bu proteinlerin ekspresyonlarında, 5 günlükten 60 günlüğe doğru anlamlı bir artış saptanmıştır (p<0.05). Bar: 50 µm.
4.3. p97/VCP ve Jab1/CSN5 birlikte lokalizasyonlarının postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde belirlenmesi
p97/VCP’e bağlandığı ve onun fonksiyonları etkilediğini bildiğimiz Jab1/CSN5’in postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde birlikte lokalize olup olmadıklarını ve lokalize iseler hangi testikular hücrelerde koekspre edilmekte olduklarını anlamak için floresan immunohistokimyası kullanıldı. 5 günlükten 60 günlüğe kadar olan sıçan testislerinde, heriki protein içinde (p97/VCP ve Jab1/CSN5) positivite gösterdiği hücreler belirlendi (Şekil 4.3.1). Gonositler, Spermatositler, Sertoli hücreleri, Spermatogonia ve uzamış spermatidlerde bu proteinlerin birlikte lokalizasyonları saptandı.
Şekil 4.3.1. Jab1/CSN5 ve p97/VCP’nin gelişmekte olan postnatal sıçan testisinde birlikte lokalizasyonları. Jab1 proteini yeşil floresan veren FITC ile işaretlenirken, p97/VCP proteini kırmızı floresan veren rhodamine ile işaretlenmiştir. Her iki proteinin birlikte lokalizasyonunu gösteren kırmızı ve yeşilin birleşmesi (merged) ile sarı renkli işaretli hem Jab1/CSN5 hem de p97/VCP pozitif hücreler üçüncü kolonda gösterilmiştir. Hücre DNA’nı boyayan floresan DAPI ile ise 4. kolanda kolalize proteinlerin mavi renkli çekirdek boyanmaları izlenmektedir. Bar: 50 µm.
4.4. Postnatal gelişmekte olan Sertoli hücrelerinde p97/VCP ve Jab1/CSN5’nın immunolokalizasyonları
Ergin testis tübüllerinde, Sertoli hücrelerini etraftaki germinal hücrelerden ayırmak kolaydır. Fakat gelişmekte olan sıçan testisinde, ergin morfoloji tam oturmadığı için Sertoli hücrelerinde protein lokalizasyonunu belirlemek için Sertoli hücre markerlarına ihtiyaç duyulur. Biz de çalışmamızda sitokeratin 18 (erken dönem Sertoli hücre markerı) ve p27 (geç dönem Sertoli hücre markerı) antikorları kullanarak, Sertoli hücrelerinde p97/VCP ve Jab1/CSN5’nın spesifik lokalizasyonlarını belirledik (Şekil 4.4.1).
Şekil 4.4.1. Postnatal gelişmekte olan sıçan testisindeki Sertoli hücrelerinin immunpositivitesi (A-C) ve p97/VCP ve Jab1/CSN5’in bu hücrelerdeki lokalizasyonu. Sitokeratin 18 (CK) ve p27 Sertoli hücrelerini 15 (A), 30 (B) ve 60 (C) günlük testis tübüllerinde pozitif olarak
işaretlemektedir. 60 günlük testis tübüllerinde (D-I), VCP ve Jab1’nın (kırmızı floresan rhodamine ile işaretli) ve p27 (yeşil floresan FITC ile işaretli) ile kolokalizasyonu gösterilmektedir. Bar: 50
4.5. Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde übikütin immunolokalizasyonları
Bundan önceki sonuçlar, Jab1/CSN5’ın p97/VCP ile ortak lokalizasyonunu göstermiştir. p97/VCP’ye bağlandığı bilinen bir başka molekül ubikütindir. Ubikütin birbiri ardı sıra dizilerek p97/VCP’nin N domainine bağlanabilen moleküldür ve übikütinlenmiş proteinler p97/VCP aracılığıyla proteazoma taşınmaktadır. Bu nedenle, gelişmekte olan sıçan testisinde übitütinin lokalizasyonu araştırıldı (Şekil 4.5.1). Yapılan çalışmalar sonucunda, übikütinin Sertoli hücreleri, intertisyal hücreler, spermatosit ve uzamış spermatidlerde lokalize oldukları bulundu. Ayrıca, übikütinin 5 günlükten 60 günlüğe doğru ekspresyonunda bir artış belirlendi.
Şekil 4.5.1. Postnatal 5 (A), 15 (B) ve 60 (C) günlük sıçan testisinde übikütin lokalizasyonları. A: 5 günlük sıçan testisinde ubikütin’nin gonositlerde (GC) intersitisyal hücrelerde ve Sertoli hücrelerinde immunoreaktivitesi gözlenmektedir. B: 15 günlük sıçan testisinde spermatogonia (Sg) ve Spermatositlerde (Sc) immunoreaktivite izlenmektedir. C: 60 günlük sıçan testisinde, Sg, Sc ve uzamış spermatidlerde (eSt) ubikütin immunolokalizasyonu saptanmıştır. Ubikütin ekspresyonunda, 5 günlükten 60 günlüğe doğru anlamlı bir artış saptanmıştır (p<0.05). Bar: 50 µm.
4.6. Postnatal gelişmekte olan sıçan epididimisinde. p97/VCP immunolokalizasyonları Çalışmamızın bir başka amacı, p97/VCP proteinin testiküler doku yanında testisle direk bağlantılı spermin olgunlaştığı erkek üreme kanalı olan epididimisde ekspresyonun olup olmadığını ve varsa da hangi bölgelerde ve hücrelerde bu proteinin lokalize olduğunu saptamaktı. Epididimis anatomik olarak testise yakınlığına göre kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA) 3 bölgeye ayrılmaktadır. Epididimisin bu bölgelerinin ayrı ayrı sperm olgunlaşmasında, depo edilmesinde ve sekresyon fonksiyonunda görevleri bulunmaktadır.
Şekil 4.6.1. Postnatal 5 (A-C), 15 (D-F), 30 (G-I) ve 60 (J-L) günlük sıçan
epididimislerinin kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA) bölgelerindeki p97/VCP immunolokalizasyonları. 5 günlük sıçan epididimisinde p97/VCP epididimal hücrelerde (EC) ekspre edilirken, 15,30 ve 60 günlük epididimisde principal hücreler (PC) ve basal hücrelerde (BS) ekspre edildiği görülmektedir. Herbir fotografın kenarındaki küçük karaler ise primer antikor kullanılmadan yapılan negatif kontrol kesitleri gözlenmektedir. P97/VCP immunreaktivitesi, epididimisin kaput ve kauda bölgelerinde daha yoğun iken, kauda epididimisde daha az yoğun olarak görülmektedir. Epididimisin epitelyal hücrelerinden clear hücreler de (C) ise hiç bir p97/VCP immunoreaktivitesine rastlanılmamıştır. Bar: 50 µm.
Bu nedenle çalıştığımız proteinlerin farklı bölgelerde lokalizasyonun belirlenmesi, proteinlerimizin bu bölgelerin fonksiyonlarında görevleri olabileceğini göstermektedir. Şekil 4.6.1, epididimisin bu 3 bölgesinde p97/VCP ekspresyonunu sergilemektedir.
4.7. Postnatal gelişmekte olan sıçan epididimisinde Jab1/CSN5 immunolokalizasyonları
p97/VCP proteinin epididimisdeki lokalizasyonu incelediğimiz şekilde, Jab1/CSN5 proteininde epididimisin kaput, korpus ve kauda bölgelerindeki immunoekspresyonu araştırıldı.
Şekil 4.7.1. Postnatal 5 (A-C), 15 (D-F), 30 (G-I) ve 60 (J-L) günlük sıçan
epididimislerinin kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA) bölgelerindeki Jab1/CSN5 immunolokalizasyonları. 5 günlük sıçan epididimisinde Jab1/CSN5 epididimal hücrelerde
(EC) ekspre edilirken, 15,30 ve 60 günlük epididimisde principal hücreler (PC) ve basal hücrelerde (BS) ekspre edildiği görülmektedir. Herbir fotografın kenarındaki küçük karalerde ise primer antikor kullanılmadan yapılan negatif kontrol kesitleri gözlenmektedir. Jab1/CSN
immunreaktivitesi, epididimisin kaput ve kauda bölgelerinde daha yoğun iken, kauda epididimisde daha az yoğun olarak görülmektedir. İmmunoreaksiyonun 30. ve 60. günlerde sitoplazmada da yoğunlaştığı izlenmektedir. Bar: 50 µm.
Postnatal epididimisin bu 3 bölgesindeki principal hücrelerde ve basal hücrelerde Jab1/CSN5’nin ekspre edildiğini ve bu ekspresyonun hem sitoplazmik hem de nüklear olduğu ortaya konulmuştur.
5 günlük sıçan epididimisinin, üç bölgesindede Jab1/CSN5’nin uniform olduğu yani her üç bölgede immunoreavtivite bakımından bir farklılık görülmezken, 15. Günde ve daha sonraki postnatal günlerde kaput ve korpusda Jab1/CSN5’nin daha fazla ekspre edildiği belirlendi. Bu da Jab1/CSN5’nin epididimisin bu bölgelerinin sperm olgunlaşması görevinin yerine getirilmesinde rol alabileceğini vurgulamaktadır.
4.8. Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde Bone morfogenetik protein (BMP) ailesi üyelerinin p97/VCP ile ilişkisinin belirlenmesi
Çalışmamızda BMP ailesi üyelerinden Smad1 ve fosfo-Smad1 (p-Smad1)’in p97/VCP’ye bağlanıp bağlanamayacağını ve pSmad1’in p97/VCP’nin bir substarı olarak p97/VCP tarafından yıkılıp yıkılamayacağını anlamak için öncelikle bu iki proteinin testiküler hücrelerde gerçekten birlikte lokalize olup olmadığını inceledik (Şekil 4.8.1).
Şekil 4.8.1. Postnatal 5 (A, B, G), 15 (C, D, H), 30(I) ve 60 (E, F, I) günlük sıçan testisinde Smad1 ve fosfo-Smad1 lokalizasyonları. G: 5 günlük sıçan testisinde Smad1 ve pSmad1’in gonositlerde (GC) ve Sertoli hücrelerinde (Se) immunoreaktivitesi gözlenmektedir. 15 günlük sıçan testisinde Sertoli (Se), spermatogonia (Sg), Spermatositlerde (Sc) ve intertisyal hücrelerde (I) immunoreaktivite izlenmektedir. 15 günlük testis tübüllerine Smad1 ve p-Smad1 immunoreaktivitesi arasında lokalizasyon farkı görülmektedir. Smad1 sitoplazmik iken p-Smad1 nüklear bölgede aktif haldedir. 60 günlük ergin sıçan testisinde Sg, Sc ve Se’deki belirgin Smad1 ve p-Smad1 immunoreaktivite gözlenmektedir. Zigoten spermatosit (zSc) ve pakiten spermatositlerde (pSc) Smad1 ekspresyonu izlenmektedir (E). Se, Sc ve Sg’larda nüklear pSmad immunoreaktivitesi ve K ve L karalerinde I şeklinin büyültülmüş hali izlenmektedir. Küçük kareler: Negatif kontrol J: Gelişime bağlı olarak 5, 15 ve 60 günlük sıçan testisinde Smad1 ve p-Smad1’in karşılaştırmalı Hscore analizleri gözlenmektedir. Bu proteinlerin ekspresyonlarında, 15.günde anlamlı bir artış saptanmıştır (p<0.05). Bar: 50 µm.
Şekil 4.8.1’da öncelikle Smad1 ve p-Smad1 lokalizasyonları belirlenmiştir. Şekilaltı açıklamalarında da belirtildiği gibi, 5, 15 ve 60. günlerde Smad1 ve p-Smad1’in gonosit, Sertoli hücreleri, spermatositlerde lokalize olduğu ve en yüksek immunoreaktivitenin 15. günde ortaya çıktığı belirlenmiştir (Şekil 4.8.1 1-J).
İki proteinin birbiriyle etkileşebilmesi ve ya birbirine fiziksel olarak bağlanabilmesi için öncelikle hücrenin aynı bölgesinde birlikte lokalize olması gerekmektedir. p97/VCP ile Smad1 ilişkisini kurabilmek için, ikinci adım olarak p97/VCP ve p-Smad1’in birlikte lokalize olup olmadıklarının saptanabilmesi gerekmektedir. Bunun içinde bir sonraki bölümde bahsedilecek immunofloresan çalışmaları yapılmıştır.
4.9. p97/VCP ve Smad1’in birlikte lokalizasyonlarının postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde belirlenmesi
p97/VCP ve Smad1’in birlikte lokalizasyonlarını belirlemek amacıyla, her iki proteini, aynı hücrede ve aynı hücrenin aynı bölgesinde birlikte işaretlemek gerekmektedir. Çalışmamızda p97/VCP proteini kırmızı floresan renk veren rhodamine, Smad1 proteini ise yeşil renk veren FITC ile işaretledik. Testiküler tübüldeki hücrelerde, heriki proteinin de pozitif olduğu alanlar kırmızı ve yeşilin birleşmesiyle sarı renki olarak görüntülenmiştir. Hücre nukleuslarını işaretlemk amacıyla ise nüklear boya olan DAPI kullanılmıştır ( Şekil 4.9.1).
Şekil 4.9.1. Smad1 ve p97/VCP’nin gelişmekte olan postnatal sıçan testisinde birlikte lokalizasyonları. Smad1 proteini yeşil floresan veren FITC ile işaretlenirken, p97/VCP
proteini kırmızı floresan veren rhodamine ile işaretlenmiştir. Her iki proteinin birlikte lokalizasyonunu gösteren kırmızı ve yeşilin birleşmesi (overlay) ile sarı renkli işaretli hem Smad1 hem de p97/VCP pozitif hücreler üçüncü kolonda gösterilmiştir. Hücre DNA’nı boyayan floresan DAPI ile ise kolalize proteinlerin mavi renkli çekirdek boyanmaları izlenmektedir. En belirgin kolakalizasyon Sertoli (Se), spermatosit (Sc) ve spermatogonia (Sg)’da gözlenmektedir. Bar: 50 µm.
4.10. Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde Smad1 ve p97/VCP proteinleri arasındaki etkileşimin birlikte çökeltme (ko-immunopresipitasyon ) ile belirlenmesi
İki protein arasındaki ilişki, bazen heriki protein birlikte aynı hücrede hatta aynı
Şekil 4.10.1. Smad1’in p97/VCP’ye gelişmekte olan sıçan testisi ve epididimisinde in vivo bağlanması.5, 15 ve 60 günlük sıçan testisi (A) ve epididimisi (B) hücre ekstratlarındaki, p97/VCP ve Smad1 proteinlerinin ekspresyonları immunoblot (IB) ile
(başlangıç materyali: input, sıra 1, 2,3). incelenmiştir. Hücre ekstraktları, anti-p97/VCP antikoru (4, 5, 6) ve izotip kontrol antikoru (kontrol, sıra 7, 8, 9) ile inkübe edilerek, p97/VCP çöktürüldü. (B) VCP, Anti-VCP antikoru (4, 5, 6) ile çöktürüldü. İzotip kontrol IgG (sıra 7. 8. 9) ile ise çöktürme gözlenmemiştir. VCP ile birlikte çöktürülen proteinler, anti-VCP ve anti-Smad1 antikorları ile saptandı. Cve D’de ise koimmunopresipitasyon aynı yöntem ile p-Smad1 ve p97/VCP arasındaki etkileşimi saptamak için uygulandı. Western blotların yanlarında gösterilen bar grafiklerde ise testis ve epididimis dokularında, 15. günde (yıldız ile işaretli ) belirtilen dokularda anlamlı artışlar saptandı.
hücrenin aynı bölgesinde olsa bile her zaman positif olmayabilir. Yani, iki proteinin birbiriyle fiziki anlamda etkileştiğini göstermek için sadece kolakalize olmaları yetmez. Kolakalize olabilirler ama birbirine bağlanmaya da bilirler. Bu nedenle, daha ileri teknikler kullanılarak protein-protein etkileşimini belirlemede kullanılan ko-immunopresipitasyon yöntemi iki proteinin gerçek anlamda birbirine bağlanıp bağlanmadığı ve dolayısıyla etkileşimde olup olmadığı anlaşılır.
Çalışmamızda öncelikle Smad1 ve p97/VCP proteinleri 5, 15 ve 60 günlük testikular hücre ekstratlarında Western blot yöntemiyle belirlendi (Şekil 4.10.1). Hazırlanan hücre ekstratının bir kısmı ise VCP antikoru ile önceden inkübe edilmiş Protein G boncuklarıyla inkübe edildi. Hücre ekstratlarından p97/VCP proteini çökeltilerek, Smad1 proteini için immunoblot üzerinde deteksiyon gerçekleştirildi. Böylelikle VCP’ye direk olarak bağlanan Smad1 için pozitif belirgin bantlar saptandı (Şekil 4.10.1).
4.11. Smad1’ın übikütinlenmesi ve p97/VCP ile bağlanması
Buraya kadar ki çalışmalarımızda p-Smad1-p97/VCP ilişkisini birlikte lokalizasyon ve ko-immunopresipitasyon ile gösterdik. p97/VCP ile etkileşimde olan bir çok proteinin übikütinlenmesi (übikütin zincirlerinin proteine eklenmesi) gerekmektedir. Giriş kısmında anlatıldığı gibi p97/VCP übikütinlenmiş olan pproteinlere bağlanarak onları proteasoma taşır. Bu nedenle çalışmamızın bir kolunda, übikütinlenmiş Smad1 ve ya p-Smad1’in p97/VCP ile etkileşip etkileşmediklerini araştırdık. Bunun için ilk olarak, hücre ekstratlarından p-Smad1’in çöktürülmesi ve übikütinlenmesini, ikinci olarak da übikütinlenmiş p-Smad1’in p97/VCP ye bağlanmasını gösterdik (Şekil 4.11.1).
Şekil 4.11.1. Sıçan testisinde ubikütünlenmiş p-Smad1’in p97/Valosin-containing protein (p97/VCP) ile bağlanması. 15 ve 60 günlük sıçan testislerinden elde edilen hücre ekstartları (input: başlangıç materyali) kullanılarak Smad1 (IP: immunopresipitasyon: p-Smad1) ve izotip kontrol antikorları (IP: immunopresipitasyon: kontrol) çöktürüldü. Sonrasında, p-Smad1, p97/VCP immunoblotlama ile saptandı. Beta aktin ise yükleme kontrolu olarak kullanıldı. Optikal densitometre ile bantlar quantifiye edildi.
TARTIŞMA
Çalışmamız, postnatal gelişmekte olan testis ve epididimis dokularında, UPS proteinleri, BMP sinyal yolağına ait bazı proteinleri ve bunların birlikte ekspresyonlarını göstermesi nedeniyle orijinal bulgular içermektedir. Bu projede, immunohistokimya, immunofloresan, Western blot ve koimmunopresipitasyon metodları kullanılmıştır.
Sonuçlarımız UPS proteinlerinden, p97/VCP ve Jab1/CSN5’in 5, 15, 30 ve 60 günlük testislerde ve epididimiste gonosit, spermatosit, Sertoli hücreleri, spermatidler ve epididimal epitelyal hücrelerinde birlikte ekspre edildikleri göstermiştir. 5 günlük sıçan testisinde, UPS proteinlerinin gonositlerde ekspresyonunun diğer günlere göre daha az olduğu saptanmışır. Bu proteinlerin bu kadar erken gelişim döneminde bu proteinlerin fonksiyonlarının henüz belirgin olmadığını ya da az olduğunu göstermektedir. Fakat 5. günden sonra UPS proteinlerindeki ekspresyon birden artış göstermiştir ve 30. günde en yüksek seviyelere ulaşmıştır. Daha önceki çalışmalar postnatal 4. günden 30. güne kadar sıçan testis ve epididimisinde hızlı bir proliferasyonun ve büyümenin olduğunu göstermektedir (Clermont ve Peley, 1957). p97/VCP ve Jab1/CSN5’in ekspresyonlarında da testiküler ve epididimal büyümeye paralel olarak görülen bu artış, p97/VCP ve Jab1/CSN5’nin testis ve epididimis büyümesi için gerekli olabilecek proteinler arasında olduğunu göstermektedir. Gerçekten de literatüre bakıldığında, Jab1/CSN5’in hücre büyümesi için temel bir protein olduğu ve hızlı büyüme ile ilişkisi gösterilmiştir (Bounpheng ve arkd., 2000).
Postnatal gelişim boyunca, sıçan testisi çeşitli gelişimsel basamakları gösterir (Malkov ve arkd., 1998). Postnatal 0-5. günlerde, testiküler tübüller sadece gonosit ve somatik hücrelerden oluşmuştur. 6-7. günlerde, spermatogonyumlar görülmeye başlar. 13-23.günlerde, spermatositler belirir ve 24-25. günlerde yuvarlak spermatidler ortaya çıkarlar. 30. günde uzamış spermatidler ve 36. günde uzamış spermatozoalar testis tübüllerinde gözlenir. p97/VCP ve Jab1/CSN5’nin yukarıda saydığımız tüm basamaklarda görülmesi bu proteinlerin gelişmekte olan testis için önemlerini vurgulamaktadır. Örneğin: p97/VCP ve
Jab1/CSN5’nın yuvarlak ve uzamış spermatidlerde görülmesi, bu proteinlerin akrozom ve spermin kuyruk gelişimi ile ilgili bir fonksiyonunun olabileceğini aklımıza getirmektedir. Ayrıca bu proteinlerin olgunlaşan spermatositlerde görülmeleri yine bu proteinlerin spermatosit gelişimi için gerekli proteinler olabileceklerini göstermektedir.
Sertoli hücreleri ile yapılan ultrastruktural çalışmalar sonucunda sitoplâzmalarında birçok fagositik vakuollerin bulunduğunu göstermiştir (Hutchison ve arkd., 2008). Sertoli hücrelerinin spermatogenez boyunca germ hücrelerinin sitoplazmik artıklarını fagosite ettikleri bilinmektedir (Russell ve arkd., 1983; Sakai ve arkd., 1988). p97/VCP’nin ise, otofagozom maturasyonunda görev yaptığı gösterilmiştir (Dai ve Li, 2001; Meusser ve arkd., 2005). Fakat ilk olarak bizim çalışmamızda, p97/VCP’nin Sertoli hücrelerindeki varlığı belirlenmiştir. Çalışmamız fonksiyonel deneyler içermediği için, p97/VCP’nin Sertoli hücresinde ne gibi fonksiyon gösterdiğini belirleyememiştir. Fakat p97/VCP’nin Sertoli hücresinde übikütinlenmiş substratların yıkımı için gerekli bir protein olduğu muhtemeldir.
Çalışılan proteinlerin epididimisde gelişime bağlı olarak artış göstermeleri, bu proteinlerin sperm maturasyonuyla ilgili fonksiyonları olabileceğini göstermektedir. Özellikle de p97/VCP ve Jab1/CSN5’nin, epididimisin kaput ve korpus epididimis bölgelerinde ekspresyonlarının fazla bulunması, bu proteinlerin sperm olgunlaşmasında fonksiyon görebilen proteinler olabileceklerini vurgulamaktadır. Defektif spermatozoanın epididimisde elimine edildiği bilinmektedir (Sutovsky, P; 2003; Baksa, M; 2008). Fakat eliminasyonun nasıl olduğu, hangi proteinlerin bu işde görev yaptığı bilinmemektedir. Çalıştığımız epididimisde varlığı saptanan proteinler muhtemelen defektif spermatozoanın ortadan kaldırılmasına yardımcı proteinler olabilir. Jab1/CSN5’nin daha önce bilinen görevleri göz önüne alındığında, yapısında bulunan JAMM domaini metalloproteinaz aktivitesine sahiptir. p97/VCP’ye direk olarak bağlanan Jab1/CSN5 ubikütinlenmiş defektif proteinlerin uzaklaştırılmasında görev yapabileceği muhtemeldir.
Spermatogenezin düzenlenmesinde çeşitli sinyal molekülleri ve çoklu-sinyal yolakları vardır. Moleküler mekanizmanın özelliklede sinyal moleküllerinin ve yolakların tam olarak anlaşılması spermatogenez düzenlenmesinde gereklidir ve erkek infertilitesi için yeni tedavi hedefleri sunarak önemli etkilere sahiptir. Smad sinyal yolağı insan embriyonik
