A. (J. Veteriner Fakültesi Bakteriyoloji ve Salgınlar Kürsüsü
YENİ METODLARLA MıKROP KÜLTÜRLERİNİN ÜRETİLMESt ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR Ömer Ertürk (*)
Giriş
Salahattm Can (**)
Heterotroph gruba dahil bir çok bakteriler, uygun miktarda karbon, nitrojen ve mineral tuzlar bulunduğu halde bile üreme kabili-yetine malik değildirler. Bu mikroorganizmalar maya ekstraktıveya kan serumu ile de temin edilebilen üreme faktörlerine veya vitamin-Iere ihtiyaç gösterirler. Bu vitaminIerin ekserisi B. Complex grubuna dahildir. (12). Bundan başka st~phylococ ve diplıtheri basili gibi bir çok mikroplar üremeleri için nicotinic aside ihtiyaçlar vardır. Yine bazı bakteriler üremeleri için saf halde tihianinemoleküllerine ihtiyaç gösterirler. Bağzılarıda pyrimidine ve thiazole molekülleri mua-cehesinde iyi ürerler (12).
Mikroorganizmalar her hangi bir üreme faktörü olmadan da üreyebilirler. Fakat bunlar ilave edildiğinde bu üremeleri bollaşır, fazlalaşır. Bu faktörlerin mikroorganizmaların üremelerinde stimu-lan bir etkileri vardır. Bu nokta göz önünde tutularak, çeşitli maksat-lar için bakterioloji laboratuvarlarında çeşitli mikroorganizmala-rın kültürleri hazırlanırken, bu maksatlara daha iyi ve elverişli bir şekilde erişebilmek için kültür vasatlarına değişik maddeler ilave edildiğinde bir fark meydana gelip gcImiyeceğini ortaya koymak ama Ci ile bu araştırma yapılmıştır.
Mikroorganizmaların üreme faaliyetlerinde çeşitli şekilde etki-leri olan başlıca maddeler şunlardır:
B- Complex vitaminIeri, Riboflavin, Vitamin B6 nitonicic asid ve nicotinamidc, Pantothenic asid, Biotin, Amino benzoic asid, Vitamin B12. (12).
---
.
• A.Ü. Veterİner Fakültesi Bakteriyoloji \T Salgınlar Kürsiisü Profesörii,
Ankara-Türkiye.
•• A.C. Etlik Veteriner Bakteriyoloji ve Seroloji Enstitüsü Uzman, \'et.Hek. Ankara-Türkiye.
Yeni Metotlarla Mikrop KijItürlerinin Üretilmesi 307
Yukarıda adı geçen maddelerden başka, bazı nevi mikroorga-nizmaların üremelerinde başka diğer maddelerin de aktiviteleri ol-duğu yapılan araştırmalar sonucunda anl~şılmıştır (6,9). Her ne
ka-i
dar hakiki vitaminIere nazaran daha fazla miktarda istenilmelerine ve müşterek bir etkileri belirtmemelerine Irağmen, inositol ve, choline bazen B-Complex grubuna dahil edilirler. Haemophilus'ların bazı nevileri tarafından hemin'e karşı bir ihtiyaç duyulur ve bu madde cytochrome ve demir-porphyrin ihtiva eden enzimIerIc birlqirler. Bundan başka coprogen, demir ihtiva eden bir pigment olup bir çok fungiler için yüksek derecede aktivitedir (7). Diğer bir demir bile-şimi de ferrichrome'dir. Buna karşı da bazı mikroorganizmalar ih-tiyaç hissederler (ı o).
Yapılan araştırmalar, tabiatta oksidativ enzimlerIc birleşmiş lipoic asid veya thioctic aside de mikroorganizmaların ihtiyaçları olduğunu meydana çıkarmıştır (ı ı). Yine bazı mikroorganizmaların vitamin K ile birleşik oleic asid (2,-8), bir veya daha fazla purine ve pyrimidine bazları veya bunların derivatlarına ihtiyaçları vardır(6). Asparagin, glutamin ve putrcscine de yine bazı neviler için lüzumlu olan maddelerdendir.
Bir çok bakteriler amonyum tuzları ve glikozlu vasatlarda üre-meleri için bir veya daha fazla amino asidere ihtiyaçları vardır. Sen-tez yapamayan mikroorganizmalar için bu aminoasidler esas ünite-leri temsil ederler. Bazı mikroorganizmalarda sentez kapasitesi o kadar tahdit edilmiştirki sentetik bir kültÜr vasatına 17 veya ı8 ami-no asidinin ilavesi zarureti vardır.Bilhassa gram pozitiv bakteriler amino asidIeri sentez yapmak kabiliyetleri bakımından tahdit edil-mişlerdir ve bunlar dış bir kaynaktan bu ihtiyaçlarınıgidermek zo-rundadırlar (ı2).
Amino asid ihtiyacı ekseriyeıle kültür vasatının terkibinin tesiri altında bulunur. Bir mikroorganizmanın vitamin ve amino asid ihti. yacı arasındaki münasebet ekseriyetle birbiriyle karşı karşıya gelmek-tedir. Bu durum bilhassa pyridoxal, biotin, folik asid ve vitamin Bı2 de görülür.
Bakteriler, oksijen ihtiyaçları bakıırıından dört gruba ayrılır-ken. Obligat anaeroblar yalnız yüksek derecede oksijen kesafetinin
i
azaltıldığı durumlarda üreyebilirler. Eakültetiv anaeroblar hem de anaerob şartlarda üreyebiliroer. Obl~gat aerob'lar üren:ıeleri için oksijene ihtiyaçları vardır. Micro-aerophilic olanlar da en iyi şekilde
i
düşük oksijen kesafetinde ürerler (ı 2). Yüksek oksijen kesafeti
bun-i
ların üremelerine mani olmaktadır. Aerob olanlar 'kendilerine !üzum-i
:ıon Ümer Ertiirk .. SeIahaitin Can
lu olan enerjiyi karbon hidratların tam bir şekilde parçalanması su-retiyle temin ederler. Anaerob'lar hidratların kısmı olarak parçalan-masına veya fermentasyonuna tesir ederler. Aerob bakterilerde bul u-.nan katalase ve tam cytochrome sistemi anaerob bakterilerde nok-. sandırnok-.
Çeşitli araştırıcılar patogen leptospiralar için kullanılan kültür vasatlarındaki seruma az miktarda hemoliz olmuş eritrositlerin hemog lobin kaynağı olarak ilave edilmesini lüzumlu görmüşlerdir. C i -ıg). Bunu nla beraber diğer araştırıcılar arasında hemoglobinin üzerinde bir fikir birliği yoktur. Faine (g, 4, 5) yaptığı araştırmada, virulan ve avirulan Lcptospira icterohaemorrhagae suşlarının korthof va-satında az ürediğinİ, buna karşılık vasata Fe CL g veya demir por-phyrin ihtiva eden preparatların ilave edildiğinde bu üremenin faz lalaştığını tesbit etmiştir. Fe CIg veya hematin ilave edildiği zaman üremcnin, demir porphyrin ihtiva eden preparatların ilave edildiği zamana nazaran daha yavaş olduğu tesbit edilmiştir.
~ at e r y a
ı
v e ~ e t.o tDenemeler kullandığımız mikroorganizmalar laboratuvarları-mızda mevcut stok suşlardan olup aşağıdaki türlerden ibarettir.
avıum " " 1- Pasteurella a viseptica 2- Br. Abortus Hang g-" Melitcnsis 4-" Suis
5- Mycobacterium tuberculosis bovum
6- " "humanus
7-Denemelerimizde mikroorganizmaların sayımı ıçın (Faine) metodundan yararlandık (g).
Kültür vasatları:
Pasteurella kültürleri ıçın adi agar ve buyyon, Mycobacterium tuberculosis kültürleri için % 4 gliserinli buyyon, Bruceıla grubu mikroorganizmalar için adi agar kültür vasadarı kullanılmıştır. Yu-karıda adı geçen kültür. vasatlarında demir bulundurulmasını sağla-mak am~cı ilc Fe Clg, hernatin ve hemoglohin çeşitli nisbetlerde Seitz filitrelerİnen süzülrnek suretiyle sterilizasyon yapıldıktan sonra katı ve sıvı vasatlara ilave edildi. Bunun. için Fe Clg ün i/100, 1/1000, 1/2000, 1/5000 dilüsyonları yapıldı. Bu dilüsyonların her birinden i
Yeni Metotların ~ikrop Kültürlerinin Üretilmesi 309
ı
cc. iki~er adet petri kutusu na döküldü. 24 saatlik pasteureIla avisep-tieum kültüründen o. i cc ekim yapıldı. i Denemelerde hemoglobin kullanıldığı zaman bunun agarda 1/1000,1 1/10000, 1/20000
mahlül-leri yapıldı ve petri kutularına döküld~. Her dilüsyondan iki~er kutuya 24 saatlik pasteureIla aviseptieumkültürü~den o .i cc ekiIdi. Avrıea iki adet adi agarda da ekim yapıldı.
Hematin'in jelözde i/2000, i/5000, i/10000 dilüsyonları yapıldı
ve petri kutularma döküldü. Her dilüsyondan iki~er tanesine 24 sa-atlik pasteurella kültüründen o. i cc miktarında dim yapıldı. 5 gün süre ile etüvde bırakıldı. Bu ekimin adi jelöz ve kanlı jelöz de kontrolları yapıldı. Yukarıda açıklandığı gibi, Fe C13, hametin ve hemoglobin aynı nisbetlerde sulandırılarak aynı ~ekilde BruceIla ve tüberküloz mikroplan için hazırlanan kültür vasatlarına ilave edil-mış ve kontrollarla biıliktc ekimleri yapılmıştır.
SonuÇıa~ i
Aşağıdaki ccelvcllerin incelenmesinden de anlaşılacağı gibi, denemelerimizden şu sonuçlar elele edil~iştir:
i) Fe CI3 ile yapılan denemelerde, Pasteurelle aviseptica ekilen vasatlarda kontrollarda üreme görüldüğü halde, Fe CI3 m çeşitli dilüsyonlanndan ilave edilen vasatların hiç birinde üreme tesbit edilememiştir. Buna karşılık gerek üç nevi BruceIla gerekse tüberkü-loz mikropları ile yapılan ekimlerde kontrollara nazaran Fe CL3 ilave edilen vasatlarda bol üremc görülmüştür.
2) Hematin ile yapılan denemclerqc, Pasteurella aviseptiça ekilen vasatlarda kontrollarda üreme gö~'üldüğü halde hernatinin
Mikrob nevi
eedvel i
Fe CL3 ile yapılan denemelerde alınan sonuç
Çeşiıli slilandırmalarda üreme
1[100 Pasleurella avisepıiea Br. Abortus Bang
L
i[2~00 ı[2000 1[5000 Ko_~ı ++-'-+ 1+-,-+ ++ ! + _____ 1 Br. Su;s Br. Melilensis , -I -i i -I i-I- --'-+ -1-:- 1--I ! ; i ! + + + --t -li -\-
+ Mycobacıeriııııı lubl'reulosis bonım ,- i- -1--1-i -,-
+ -'- i 1- -1- i -! +i -:
--1----Mycobacıerium ıubercyulosis humanus i + -,-+ + i ++ + i + + + +
i
Mycobacıeriunı lubercıılosis avium -ı---
--I-:-~-I:
! -H-1-++- ---
---:;:--~lO Ümer Ertürk - Selahattin Can eedvel 2
Hematin ile yapılan denemelerde alınan sonuç
Mikrob Nevi Çeşitli sulandırmalarda Dreme
ı
Pasteurella aviseptiea i flOOG 1/2000 1/.1000 i flOOOO Ikontrol i- - - - ++ Br. Abortus Bang ++ i
--
\ +++ -,-++ \ +-\-++ + ... --- ---- _.--Br. Melitensis ++++ ~-+++ +.+-! t ....:....-t-...L-i- ++ Br. Su is -,-++ \ ' - .-+ +~ j + ++++ .l. .. t-T-r -- --M yeobaeterium tubereulosİs - - - - ++ bovium Mycobaeterium tubereulosis - - - - +-,-humanus --- --- ---Myeobaeterium tubereulosis i _. - - - ++ avium i i eedvel 3Hemoglobin ile yapılan denemelerde alınan sonuç.
Çeşitli sulandırmalarda üreme
Pasteurella avİseptiea
-i
Mikrob Nevi i 1/1000 ++.i -+-i flOOOO -;--\++ 1/20000 -I \ +-:-1/20000 ++++-i
kontroli
-'-+ ---Br. Abortus Bang Br. Melitensis Br. Suis -,--'--\+ -+++ +++ -- ++-\--'-+--++ +-;-++ ++i+ -- +-j -\-+++-1 +-++ _1+++ ,+++-++ +\ Myeobaeterium tubereulos;s -'-+-1-+ ..L\ -- + +'! + bovum 1--Mycobaeterium tuberculosis + -\ + + --_J.+ -\- ++++ humanus1----Myeobaeterium tuberculosus i-\--,- +-j -i- - -\-+ -- +
+-\-avium i -.-++~ +-++ +-,--i-+ \+ -I
!-çeşitli dilüsyonlarında ilave edilen vasatların hiç birinde üreme tes-pit edilememiştir. Aynı sonuç tüberküloz miktrobları ile yapılan denemelerde de elde edilmiş, buna karşılık her nevi Brucella mikrob-ları ile yapılan ekimlerde kontrollara nazaran hematin ilave -edilen vasatlarda koloni sayımı bakımından bol bir üreme tesbit edilmiş-tir.
3) Hemoglobin ile yapılan denemelerde, Pasteurella avisep-tica ekilen vasatlarda, hemoglobin çeşitli dilüsyonlarından ilave
Yen; Metotlarla Mikrop Kültürlerinin' trelilme,i 31ı
edilen vasatlarda kontrollara nazaran gerek koloni gerekse mikrob sayımı bakımından daha bol üreme tesbit edilmiştir. Her nevi tüber-küloz ve Brucella mikrobları ile yapılan denemelerden de aynı sonuç-lar elde edilmiş ve hemoglobin'in bu mikl'orlar içinde bir üreme
fak-törü olduğu anlaşılmıştır. i
Tartışnıa
Bu günkü bilgilerimize göre mikroorganizmalar her hangi bir üreme faktörü. olmadan da değişik derecelerde üreyebilirler. Fakat bazı üreme faktörleri kültür vasatlarına iM.ve edildiğinde mikroor-ganizmaların üremeleri fazlalaşmaktadır. i (9,6). Son zamanlarda' bazı demir bileşiklerinin de üreme faktörü olarak kullanıldıkları bildirilmektedir (3,4, 5, 7, ıo). Bazı araştırıcılar hemoliz olmuş erit-rositlerin hemoglobin kaynağı olarak kul~anılabileceğini ileri sür-mektedirler (ı, ı 3) Bununla beraber diğer' başka araştırıcılararasın-da hemoglobinin üreme faktörü olduğu hkkkında bir fikir birliği yoktur. Kanaatımızca ayrılıkları, her araştirıcının denemelerinde çe şitli mikroorganizmalar kullanmalarından i ileri gelmektedir. Eğer her araştırıcı denemelerinde aynı mikroorganizma ve aynı kültür vasatlarını kullanmış olsalardı bu ayrımlar meydana gelmeyebilirdi. Çünkü her bir üreme faktörü her mikroorgflnizmaya karşı ayni tesi-re malik olamaz. Bu konu üzerinde yaptığımız ve yapıacak araştır-malar ancak hangi maddeyi hangi mikroorgaizmaya karşı ve hangi şartlar altında kullanabileceğini meydana çıkaracaktırki, csasen gerek bizim ve gerekse diğer araştırmalardkn beklenen amaçta tbu-dur. Yaptığımız bu araştırma, bu konuda i bu güne kadar üzerinde denemeler yapılmayan mikroorganizmalar 'üzerinde çeşitli madde-lerin ne gibi etkiler husule getirdiğini me)\dana çıkarmıştır.
Öze t
ı
i) Fe CL3 ile yapılan denemelerde, p~sreurella aviseptica, eki-len kültür vasatlarının kontrollarında üremd tespit edildiği halde Fe CL3 in çeşitli dilüsyonlarından ilave edilen kültür vasatlarının hiç birisinde üreme tesbit edilememiştir. Buna :karşılık, Brucella grubu ve üç nevi tüherküloz mikropları ile yapılan; ekimIerde kültür vasat-larında kontrollara nazaran Fe CL3 ilave eqilenlerde bol bir üreme meydana geldiği görülmüştür. . lı
2) Hematin ile yapılan denemelerde, pasteurella aviscptica ekilen kültür vasatlarında kontrollarda ürerhe görüldüğü halde
he-312 Ümer Ertürk "- Selahattin Can
matının çeşitli dilüsyonlarından" ilave edilen kültür vasatlarının hiç birinde üreme görülmemiştir. Aynı sonuç üç nevi tüberküloz mikrop-ları ile yapılan denemelerden de elde edilmiştir. Buna kqılık Bru-cella grubu mikroorganizmaları ile yapılan denemelerde kontrollara nazaran hematin ilave edilen kültür \"asatlarında koloni sayıP1ı bakı-mından bol üreme tespit edilmiştir.
3) Hcınoglobin ile yapılan denemelerde, pastemella aviseptica ekilen vasatlardan hemoglobinin çe~itli dilüsyonlarından ilave edilen lerde kontrollara nazaran kolani sayımı bakımından daha bol bir üreme görülmüştür. Her üç nevi tüberküloz ve Brucalla grubu mik-roorganizmaları ilc yapılan denemelerden de aynı sonuçlar elde edil-miş ve hemoglobinin bu mikroorganizmalar için de bir üreme fak-törü olduğu tesbit edilmiştir.
4) Yaptığımız denemeler sonucunda, çeşitli mikroorganizma-ların kültür vasatmikroorganizma-larında ürctilmderindc hemoglobinin daha elverişli bir şekilde üreme faktörü olarak kullanılabileceği anlaşılmıştır.
Summary
Researches on the Growing of Culture Media Using
New Methods
ı) In experiments made with Fe CL3 the microorganisms of pasteurella aviseptica did grow in control ınedia, but not grow in media prepared with different solutions of
fe
C13. However, the mic-roorganisms of Brucclle group and Mycobacterium tubcrculosis did grow abundant in mcdia prepared with Fe C13, if compared with controls.2) In experiments made with Hacmatin, the microorganisms of pasteurella aviceptica did grow in control media, but did not in media prepared with different Solutions of haematin. Same results were obtained with group of Mycobacterium tuberculosis microor-ganisms. Hoı;vever, the microorganisıns of Brucella group did grow abundant in median prepared with hacınatin, if compared with controls.
3) In experiments made with haeınoglobin, the microorganis-sıns of pasteurella avisseptica did grow abundant in mcdia prepared with different solutions of Haeınoglobin, if compared witlı contro1s. Same results was obraincd with groups of Bruceıla and Mycobactı~-rium tubcrculosis microorganisms it is also understood that haemog-lobin is a growth factor for tlıese grolIpS.
Yeni :-'Iet.oıl"rla :-'likroJ' Kiiltiirlerinin. tret.ilıııe,i JB
4) lt was understod with results of ourlexperiments, that haemog lobin is the best of growh factor for obtaining abundant growth in culture media of different kind microorganisms.
Literatü~ i
i - Alston, j,M. and Broom., j. C. 19h): Leptospirosis in Man and Animals. Edinhurgh: E. and S'. Livingstona Ltd. 2 - Francis, j., and others. (I 953): Biochem .
.i.,
55: 596.:3 -
Faine, S. (1957): Brit..1.
exp. Path 38,1.4 - Faine, S. (1958): R Proc. Univ. odgo med. Sch. 36, 27.
. i
5 - Faine, S. (1959): }. gen. Microbiol. 20, 247-251.
6 - Guirard, B.M., a and Snell. E.E. (I 962): chap. 2 ın the Bacteria, Vol. iV, New York, Acc:demic Press.
7 - Hesseltine, C.W., and others. (1953): Mycologia.45:7. 8 - Hunter, S. H., and HaIz, G.,G. (19~2): Ann. Rev. Microbiol.,
16: 189. i
9 .- Lichstein, H.G. (I 959): SymposlUm on initation of bacte-ni at 6 rowth. Bact. Rev., 23: 26i ~
io - Neilands, j. B. (I 957): Same spects at microbial i i on meta-bolism Bact. Rev., 21: ıoı.
i
i i --Reed, L. j. ( 1962): Vi tami ns anti Homones, 20:i •
i
12 - Sm.ith, David T., Conant, Norınan F. and overm.an,
john R. (1964): Zinsser Microbilogy. 13 th. Edition. Applc-ton-Century-Crofts. l\cw York. '
13 -
woırr,
j. j. W. (1964): The lahor~tory Diagnosis of Leptos-pirasis. Springfield, Ohio: caea lj']lOmas.i
