1.GİRİŞ
Günümüzde hızlı endüştrileşmeye bağlı olarak çevre kirliliğinin giderek artması canlıların daha fazla fiziksel ve kimyasal etmene maruz kalmasına neden olmaktadır. Fiziksel ve kimyasal etmenlerin canlılar üzerindeki zararlı etkileri araştırmacıların son derece ilgisini çekmektedir. Toksik, mutajenik, kanserojenik veya teratojenik etkili olabilen bu etmenlerin zararlarını tespit etmek ve önlemler almak gerekmektedir. Bu amaçla çeşitli testler geliştirilmiştir.
1970’ten beri dünya genelinde yaklaşık 28 milyon kg pestisit etken maddesi piyasaya sunulmuştur. Bu da 900 aktif içerik ve 50000 ticari pestisit formülasyonunu kapsamaktadır (Pan American Health Organization, 2002). Zararlıları ve otları kontrol etmek amacı ile tarımsal alanlarda pestisitlerin kullanılmasının amacı; ürün verimini arttırarak, hasatta kayıpları düşürmektir. Zirai uygulamalarla beraber pestisitlerin halk sağlığında, temizlik işlemlerinde, kağıt yapımında, boyalarda ve yüzme havuzu sularında kimyasal karışımlar olarak kullanıldığı bilinmektedir (Al-Saleh 1994). Bu bileşiklerin birçok alanda, yüksek miktarda kullanılması çevre kirliliğine yol açmaktadır. Yoğun kullanımları sonucu pestisitlerin artıklarına ve metabolitlerine içme suları ve besinlerde rastlanmıştır (Al-Saleh 1994). Bu da kimyasalların insan vücuduna girip sağlığını etkileyeceği, genetik materyalde potansiyel tehlike oluşturacağı endişesini arttırmıştır (Ribas vd 1996).
Tarımda pestisitlerin yüksek miktarda kullanılması, bu bileşiklerin farklı test sistemleri ile genotoksik açıdan değerlendirilmesini gerekli kılmaktadır. Birçok araştırıcı modern tarımda bitki zararlılarını kontrol etmek amacı ile kullanılan pestisitlerin mitotik ve mayotik hücre bölünmelerini etkilediği, insanlarda, hayvanlarda ve ekonomik önemi olan bitkilerde genetik hasara neden olduğunu bildirmişlerdir (Ribas vd. 1996, Agrawal vd. 1996, Chauhan vd. 1998, Cicchetti vd. 1999, Soloneski vd. 2002, Zeljezij ve Garaj-Vrhovac 2004, D’Souza vd. 2005, Chauhan ve Gupta 2005). Saflas vd. 1987’de ve Brown vd. 1990’da yaptıkları çalışmalara göre; insanların tarımsal kimyasallarla karşı karşıya kalması ile kanser sıklığındaki artış arasında bir ilişki bulunmaktadır (Ribas vd. 1996).
Brown ve Wu 1977’de Triasulfuron gibi sulfonylurea grubu ilaçlarından biri olan Chlorpropamide’in in vitro V79 Çin hamster hücrelerinde KKD sayısını arttırdığını (Renner ve Münzner, 1980), Watson vd. (1976) Chlorpropamide’in insan lenfositlerinde kromozom aberasyonlarına sebep olduğunu saptamışlardır. Renner ve Münzner 1980’de Çin hamster ve farede Chlorpropamide ve tolbutamide’in KKD’leri doza bağlı olarak arttırdığını aynı zamanda Chlorpropamide’in MN oluşumunu indüklediğini, fakat KA testinde yüksek konsantrasyonlarda bile negatif sonuç gösterdiğini saptamışlardır. Nokta mutasyonlarını gösteren Ames testinde Chlorpropamide ve Tolbutamide’in mutajenik olmadığı bildirilmiştir (Renner ve Münzner, 1980). Urea grubu herbisitlerinin birçoğu genotoksisite testlerinde negatif etki göstermesine rağmen bazıları pozitif etki göstermiştir. Seiler 1978’de Fluometuron’un fare kemik iliğinde MN oluşumunu indüklediğini saptamıştır (Behera ve Bhunya, 1990). Isoproturon’un in vivo KA, MN ve sperm şekli anormallikleri testlerinde konsantrasyona bağlı mutajenik etkili olduğu, Diuron’un fare kemik iliğinde MN oluşumunu indüklediği (Agrawal vd. 1996), Linuron’un insan lenfosit kültüründe MN sıklığını doza bağlı arttırdığı ve klastojenik olduğu bildirilmiştir (Papapaulou vd. 2001).
Fiziksel ve kimyasal maddelerin DNA üzerindeki etkilerini görmek için in vivo ve in vitro testler kullanılır (Natarajan ve Obe,1982; Carrano ve Natarajan, 1988). Genotoksik ajanların canlılar üzerindeki sitogenetik etkilerinin anlaşılması için en önemli kriterler, bir maddenin kromozom aberasyonları (KA), kardeş kromatid değişimleri (KKD) ve mikronukleus (MN) oluşturabilme özelliğidir.
KA’ları insanların genotoksik ajanlara maruz kalmasından sonra ortaya çıkan önemli biyolojik sonuçlardan birisidir (Obe vd. 2002). Bonassi vd. 1995’te, Hagmar vd. 1998’de yaptıkları epidemiyolojik çalışmalara göre; periferik kan hücrelerinde yüksek KA frekansı olan insanlarda yüksek oranda kanser gelişim riski bulunmaktadır (Obe vd. 2002). Özelliği bilinmeyen kimyasal maddelerin KA’larını indükleyebilmeleri açısından test edilmesinin mutajenik/kanserojenik maddelerin stratejik açıdan taranmasında önemi olduğu bildirilmiştir (Kirkland, 1998).
Latt vd. 1981’de, Littlefield vd. 1982’de, Takehisa 1982’de yaptıkları çalışmalara göre; kardeş kromatid değişimleri (KKD) testi, mutajenik kanserojenleri belirlemek üzere kabul edilen hassas bir metottur (Morimoto vd. 1985). WHO 1993’te kardeş kromatid değişimlerinin, replikasyon sırasında kardeş kromatidlerin homolog
lokusları arasında resiprokal (karşılıklı) DNA değiş-tokuşlarından orijinlendiğini, tüm hücrelerde kendiliğinden ve belli oranda oluşmalarına rağmen, bazı kimyasal ve fiziksel ajanların DNA’da hasar oluşturarak KKD frekansında artışa sebep olduğunu bildirmiştir (Laffon vd. 2001).
MN’lar hücre bölünmesi sırasında ana nukleuslara dahil olmayan tam bir kromozom veya asentrik kromozom fragmentlerinden oluşur. Sitokinezi-blok MN yöntemi; hücrelerin kimyasal ile etkilenmesinden sonraki sadece birinci bölünmede, yeni meydana gelen hücrelerin iki nukleuslu görünümleri ile MN’ların tanınmasını (Fenech ve Morley, 1985), MN tekniği sonunda elde edilen hücrelerin sayım kolaylığı; binlerce hücrenin sayılmasını, kimyasal muamele görmüş hücreler ile kontrol hücreleri arasında küçük farklılıkların belirlenmesini sağlar. Bundan dolayı Elhajouji vd. 1995 yılı çalışmalarına göre; MN testi ile çeşitli pestisitlerin ve ilaçların genotoksisite testlerinde klastojenik ve aneugenik etkili olabilecek seviyeleri tespit edilebilmektedir (Natarajan, 2002).
Pestisitlerin en büyük grubunu oluşturan herbisitler istenmeyen bitkileri yok etmek amacı ile yaygın olarak kullanılan kimyasallardır. Modern tarımda çok önemli rol oynarlar ve büyük miktarlarda kullanılırlar. Triasulfuron, yıllık veya çok senelik geniş yapraklı veya otsu zararlıların kontrolü için herbisit olarak kullanımına izin verilen sulfonylurea bileşiğidir. Triasulfuron’un düşük akut toksisite gösterdiği ve genotoksisite çalışmalarında bu herbisitin klastojenik ve mutajenik olmadığı bildirilmiştir (EPA, 1998a). Triasulfuron’un Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae ve fare lenfoma hücrelerinde nokta mutasyonlarını, Çin hamsterlerinde MN testinde KA’larını, insan fibroblastları ve fare hepatositlerinde program dışı DNA sentezini (UDS) indüklemediği saptanmıştır (EPA, 1998a). 1000 ppm konsantrasyonlarında köpek (Ciba-Giegy, 1986a), tavşan (Ciba-Giegy, 1986b) ve sıçanda (Ciba-Giegy, 1985) toksik olduğu bildirilmiş, bu maddenin insan için kanserojenik potansiyeli olduğu konusunda tamamlanmış ve belirlenmiş bir çalışmaya rastlanmamıştır. Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, fare lenfoma, Çin hamsterleri ve insan fibroblastlarında Triasulfuron’un genotoksik etkisine bakılmış olmasına rağmen, kültürü yapılan insan lenfositlerinde KA, KKD, MN indüksiyonuna etkisi üzerine bir bilgi bulunmamaktadır.
Tarımda otsu zararlılarla mücadelede kullanılan Urea’lar ile yapılan toksisite çalışmalarından çelişkili sonuçlar alınmış ve literatür çalışmalarında urea grubuna ait
Triasulfuron herbisitinin insan lenfositlerine etkisi üzerine bilgiye rastlanmamıştır. Bu nedenle çalışmamızda kültüre edilen insan periferik kan hücreleri Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile muamele edilerek, KA, KKD, MN test sistemlerinde bu bileşiğin farklı genetik hasarların meydana gelmesi üzerindeki etkisinin araştırılması ve kimyasalın genotoksik aktivitesinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Bu çalışmanın sonucunda; Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının insan periferik kan lenfosit kültüründe muamelesi ile bu konudaki bilgi eksikliği giderilmiş aynı zamanda konsantrasyona bağlı etkisi gözlenerek hangi konsantrasyonlarda toksik veya genotoksik olabileceği saptanmış olacaktır. Dolayısı ile farklı test sistemlerinde, genetik aktivite profili ortaya çıkarılarak en düşük etkili konsantrasyonları hakkında bilgi edinilmiş olacaktır. Bu bilginin besinlerde kabul edilebilir kalıntı konsantrasyonlarını ve profesyonel kullanımda tehdit sınırlarını belirlemede yararlı olabileceğini umuyoruz.
2. GENEL BİLGİLER
Her canlı türünün kendine özgü genetik bilgisinde gen rekombinasyonundan başka sebeplerle ve ani olarak meydana gelen kalıtsal değişmelere mutasyon denir. Mutasyonlar doğada kendiliğinden meydana geldiği gibi mutagen adı verilen fiziksel ve kimyasal etkenler tarafından da meydana getirilebilirler. Mutagenler DNA molekülünde çeşitli hasarlar oluştururlar. Bu hasarlar hücrede DNA onarım mekanizmaları tarafından onarılmaya çalışılır. Meydana gelen hasarların çoğu onarılmaktadır. Bazen hücrenin ölümden kurtulabilmesi için DNA’da meydana gelen hasar mecburen yanlış olarak onarılır. Ya da onarım mekanizmalarının çalışmasını kontrol eden genlerin mutasyona uğraması ile veya beslenme, ısı ve yaş gibi çevre şartlarının etkisiyle DNA’da meydana gelen hasar onarılmadan kalabilir. Bu durumda o hücrede mutasyon, buna bağlı olarak kanser oluşumu hatta hücre ölümü meydana gelebilir. Mutasyonlar bazen canlıda üstün bir karakterin ortaya çıkmasına neden olduğu halde genellikle canlılar için dezavantaj olan özellikleri ortaya çıkarmaktadır.
Canlıların DNA’larında meydana gelen hasarlar; Ames testi, in vivo memeli fare kemik iliği kromozom aberasyon testi, in vivo memeli eritrosit mikronukleus testi, in vitro memeli hücre gen mutasyon testi, bakteri kullanarak yapılan geri mutasyon testleri ile belirlenmektedir. In vitro memeli kromozom aberasyon testi, kardeş kromatid değişimleri testi ve mikronukleus testi, DNA’da meydana gelen hasarın ve genotoksik etkilerin sitogenetik açıdan araştırılmasında kullanılan test yöntemleridir.
2.1. Kromozom Aberasyonları
Kromozomların sayısı ve yapısındaki değişimlere kromozom aberasyonları (KA) denir. Kromatid kırık, kromozom kırığı, fragment, disentrik kromozom, halka kromozom, kardeş kromatid birleşmesi, translokasyon, inversiyon, izokromozomlar yapısal kromozom aberasyonlarıdır. Bazı araştırıcılar tarafından KA olarak kabul
edilmeyen ancak yine de bir anormallik sonucu oluşan yapısal bozukluklar ise gap, spiral çözülmesi, kromozom kontraksiyonudur.
İlk defa 1918 yılında de Vries Oenothera’da translokasyon tipi anormalliklerin varlığını saptayarak, kromozom yapısında değişikliklerin meydana gelebildiğini göstermiştir. Morgan 1922’de ve Bridges 1923’te Drosophila’da translokasyon ve inversiyon tipi anormalliklerin olduğunu gözlemişlerdir. Delesyon, duplikasyon, inversiyon, translokasyon gibi kararlı aberasyonların Drosophila tükrük bezi kromozomlarında ve mısır pakiten kromozomlarında kendiliğinden oluştuğu gösterilmiştir. Disentrik ve halka oluşumu gibi kararsız aberasyonların McClintock’un 1942’de mısırda yaptığı çalışmalar sonucunda, genetik materyalin kırılması, birleşmesi, köprü oluşumu sonucu meydana geldiği saptanmıştır. KA’ları organizmaların evriminde rol oynamaktadır (Natarajan, 2002).
Kromozomlar sentez fazı (S fazı) sırasında replike olurlar. Replikasyon sırasında tüm DNA molekülleri açılmaktadır. Bu DNA molekülleri metafaz kromozomları ile karşılaştırıldığında veya interfaz kromatinin fibrilli yapısı ile karşılaştırıldığında çok büyüktürler. Örneğin Du Praw’ın (1970) yaptığı hesaplamalara göre insanın 1. kromozomu 7.5 cm uzunluğunda DNA molekülü içerir. Bu DNA molekülü interfazda 1350 µm fibriller yapısına paketlenir ve metafazda yaklaşık 10 µm uzunluğundadır. Dolayısı ile DNA molekülleri, hem interfaz hem de S evrelerinde çok büyük boyutları nedeni ile mutasyonlara neden olan fiziksel ve kimyasal ajanların açık hedefleridir. Oluşacak olan DNA hasarı sonucunda mikroskopta görülebilen yapısal KA’ları oluşur (Obe vd. 2002).
Yapısal kromozom aberasyonları, aberasyonun kromozomun bir kromatidinde veya her iki kromatidinde görülmesine bağlı olarak iki gruba ayrılır. Eğer aberasyon tek bir kromatidde görülüyorsa buna kromatid tip, her iki kromatidinde de görülüyorsa kromozom tip aberasyon denir. Bu aberasyon tipleri mutajen uygulamasının yapıldığı hücre siklusu safhasına ve kullanılan mutajenik ajanın tipine bağlıdır. İyonize ışınlar gibi ajanlar hücre G1 safhasında iken etki ederse kromozom tip aberasyonlar meydana gelir, eğer hücre G2 safhasında iken etki ederse kromatid tip aberasyonlar ve iyonize ışınlar, S safhasında iken etki ederse her 2 tip aberasyonlar meydana gelebilir (Natarajan ve Obe, 1982). Şekil 2.1.1. ve 2.1.2.’de sırasıyla G1 ve G2 fazında yapılan ışınlama sonucu oluşan KA’ları görülmektedir (Özalpan, 2001). Şekil 2.1.1.’de görülen terminal
delesyon, kromozomun tek bir kolunda kırılma olması ile oluşmuştur. Kırılan parça ilk mitozda asentrik fragment şeklinde görülür. Asimetrik parça değişimi, aynı kromozomun iki kolunda kırılma olması ve kromozomun kırılan iki kolunun birbirine, kırılan iki parçanın da birbirine yapışması ile oluşur ve mitozda halka kromozom ve fragment şeklinde görülür.
Şekil 2.1.1. G1 fazında yapılan ışınlamalar sonucu meydana gelebilecek kromozom tipi aberasyonlar ile bunların çeşitli yapışma olasılıkları ve S fazını izleyen mitozda saptanan görüntüleri. (Özalpan, 2001)
a)Terminal delesyon,
b)Aynı kromozomda simetrik parça değişikliği, c)Aynı kromozomda asimetrik parça değişikliği,
d)Farklı kromozomlar arasında simetrik parça değişikliği, e)Farklı kromozomlar arasında asimetrik parça değişikliği.
Homolog olmayan kromozomlar arasında olan karşılıklı parça değişimine translokasyon denmektedir. Farklı kromozomlar arasında simetrik parça değişiminde sonraki mitozda görülebilir bir değişiklik olmazken, asimetrik parça değişiminde sonraki mitozda bir disentrik kromozom ve iki asentrik fragment görülür.
Şekil 2.1.2.’de G2 safhasında; ışınlama sonucu meydana gelen, kromatid aberasyonlar, terminal delesyon, izokromatid delesyon, aynı veya farklı kromozomlar arasında simetrik ve asimetrik parça değişiklikleri ve triradialler görülmektedir.
Şekil 2.1.2. Kromozom eşleşmesi tamamlandıktan sonra, G2 fazında yapılan ışınlamalar sonucunda meydana gelebilecek kromatid tipi aberasyonlar ile bunların çeşitli yapışma olasılıkları ve sonraki mitozda saptanan görüntüleri. (Özalpan, 2001)
a)Terminal delesyon, b)İzokromatid delesyon
c)Aynı kromozomda simetrik parça değişikliği, d)Aynı kromozomda asimetrik parça değişikliği,
e)Farklı kromozomlar arasında simetrik parça değişikliği, f)Farklı kromozomlar arasında asimetrik parça değişikliği, g)Triradial aberasyon.
Şekildeki terminal delesyon, sonraki mitozda terminal kromatid delesyon ve asentrik fragment şeklinde görülür. İzokromatid delesyonlar, bir kromozomun iki kardeş kromatidinde aynı hizada kırılma meydana gelmesi sonucu oluşmaktadır. Bunun sonucunda mitoz anafazında köprü ve asentrik fragment oluşabilir. Diğer bir olasılıkta ise sadece fragmentler birbirine yapışır, metafazda bir fragment şeklinde görülür. 3.
olasılıkta, kırılan kromozomun iki kromatidinin sadece uçları yapışır ve kırılan parçalar yapışmaz. 4. olasılıkta, hiçbir yapışmanın olmaması durumu ile karşılaşılabilir.
Simetrik parça değişikliği bir kromozomun aynı kromatidinde kırılma meydana gelmesi ve kırılan parçaların karşılıklı yer değiştirmesi ile oluşur. Mitozda görülebilir bir değişiklik olmaz. Eğer kromatidlerin kırık uçları birbirine, kırılan iki asentrik parça da birbirine yapışırsa asimetrik parça değişikliği gerçekleşir. Bunu izleyen mitozda kardeş kromatidlerden birisi normal diğeri halka kromozom ile asentrik fragment şeklinde görülür. Farklı kromozomlar arasında simetrik ve asimetrik parça değişiklikleri görülmektedir. Simetrik değişiklikte, iki ayrı kromozomun birer kromatidinden kopan parçalar karşılıklı yer değiştirirler (Şekil 2.1.2. e). Mitozda görülebilir bir değişiklik olmaz. Eğer kırılan parçalar birbirlerine ve kromatidlerin de kırılan uçları birbirlerine yapışırsa (Şekil 2.1.2. f), takip eden mitozda bu durum bir disentrik kromozom ve asentrik fragment şeklinde görülür. Triradial aberasyonlar, bir kromozomun tek kromatidinde, diğer kromozomun iki kromatidinde (izokromaid) kırılma meydana gelmesi ve izokromatid kırılma sonucu meydana gelen asentrik parçaların, tek kromatid kırılması ile oluşan kırık uçlara yapışmasıyla meydana gelir. Mitozda 3 kollu bir kromozom ile izokromatid delesyon şeklinde izlenir.
Bunlardan başka oluşan kromozom aberasyonlarından biri olan inversiyonlar, bir kromozomun kopan bir parçasının 180º dönüp tekrar aynı kromozoma yapışmasıyla oluşur. İzokromozomlar ise kromozomun sentromer bölgesinden kromozom tipi enine bir kopmanın olması sonucu oluşur. Her iki kromatidinin genetik bilgileri aynı olan yeni bir kromozom meydana gelir.
Gap, kromozomda kromatid kalınlığına eşit ya da ondan daha dar boyanmamış (akromatik) bölgelere verilen isimdir. Kromozomdaki boyanmamış bölge kromatid kalınlığından fazla ise kromatid kırık olarak kabul edilmektedir (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 1995). Gaplar da kırıklarda olduğu gibi izokromatid veya kromatid gap şeklinde olabilir. Her iki kromatidde de gap varsa izokromatid gap, tek bir kromatidde gap varsa kromatid gap denir. Elektron mikroskopu çalışmalarında, gap bölgelerinde (akromatik bölgelerde) bağlantının olduğu saptanmıştır. Özellikle DNA sentezini inhibe eden bazı kimyasallar, yüksek sıklıkla gaplara neden olurlar (Natarajan ve Obe, 1982).
Spiral çözülmesi, kromozomda soluk boyanan bölgelerdir. Gap’a göre daha geniş bir alanı kapsar. Kromozomların kontrole göre boylarının çok kısalması ve
kalınlığının artmasına kromozom kontraksiyonu denir. Bu olay kimyasal maddenin histon proteinlerine etki ettiğini göstermektedir. (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 1995)
2.1.1. KA testleri
Mutajenik ajanlara maruz kalan insan populasyonlarını izlemek için periferik kan lenfositlerinde, KA ve MN’lar kullanılır. Hagmar vd. 1998’de insan populasyonlarında kendiliğinden oluşan KA’ları ile sonradan oluşan kanser sıklığı arasında pozitif bir ilişkinin olduğunu belirlemişlerdir (Natarajan, 2002). Boveri 1914 yılı bildirisinde; kararlı kromozomal değişiklikler ile farklı kanser tipleri arasında ilişki olduğunu ileri sürmüştür (Natarajan, 2002).
Son yıllarda, kromozomları gözlemek üzere geliştirilen tekniklerle, kromozom araştırması alanında büyük gelişme gösterilmiştir. Bunlar memeli hücrelerine hipotonik muamelesi, E.M., kromozom bantlama, en son olarak FISH gibi tekniklerdir. Natarajan (2002) bundan sonra kromozom aberasyonları alanında yapılacak araştırmaların, içerdikleri mekanizmalar üzerinde odaklanacağı düşüncesindedir.
2.2. Mikronukleus (MN)
Kimyasal ajanların mikronukleus oluşturması açısından değerlendirilmesi, bu kimyasalların genotoksisitelerinin tespit edilmesinde kullanılan diğer bir kriterdir. MN’lar hücrenin mitoz bölünmesi sırasında ortaya çıkan, esas çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom veya asentrik kromozom fragmentlerindan köken alan oluşumlardır. Bu durumda bu parça mikronukleus adını alır ve interfazda kolayca görülebilir. MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom düzensizliklerinin indirekt göstergesi olarak değerlendirilmektedir. MN’lar ya
klastojenlerin neden olduğu kromozom kırığı sonucu asentrik kromozom fragmentlerinden, ya da aneujenlerin neden olduğu sentromer bölünme hataları ve iğ ipliği fonksiyon bozukluğu sonucu anafaz sırasında geri kalan tam bir kromozomdan oluşurlar (Fenech ve Morley, 1985). Mikronukleus analizi için mutajen muamelesi görmüş hücrelere sitokalasin–B uygulanarak sitoplazma bölünmesi engellenir ve bu yolla 2 yavru nukleusun birlikte bulunduğu iki nukleuslu hücreler ve bu hücrelerin sitoplazmaları içinde yer alan mikronukleuslar değerlendirilirler.
2.2.1. MN tekniğinin gelişimi
MN’lar ilk kez 1 yy kadar önce Howell tarafından eritrosit sitoplazmasında görülmüş ve bu yapılara “nukleer materyal fragmenti” denmiştir. Bunlar 1900’lü yılların başlarında Jolly terminolojisinde “intraglobuler korpuskuller” olarak tanımlanmıştır. Bu yapılar “Howell-Jolly cisimcikleri” olarak bilinir. Benzer yapılar 1937’de Brenneke tarafından fare, sıçan embriyolarında ve 1951’de Thoday tarafından Vicia faba’da da görülmüştür (Kirsch-Volders vd. 2003). Bunlara “fragment nukleuslar” veya “mikronukleuslar” denmiştir. Evans vd. 1959’da Vicia faba kök uçlarında MN’ları radyasyona maruz kalan hücrelerde gördüklerini, asentrik fragmentlerden orjinlendiklerini ve mitozun son safhasında iki yavru nukleustan ayrılarak oluştuklarını bildirmişlerdir. Vicia faba kök uçlarında nötron ve gamma ışınlarının etkisini karşılaştırdıkları çalışmada, sitogenetik hasarın belirteci olarak MN’ların kullanılabilirliğini tespit etmişlerdir (Kirsch-Volders vd. 2003).
İlk kez MN test yöntemini öneren Boller ve Schmid 1970’te ve Heddle 1973’te ajanların genotoksik potansiyellerini ölçmek için kemik iliği eritrositlerinde MN’u test yöntemi olarak kullanmışlardır (Kirsch-Volders vd. 2003). Daha sonra 1980’de MacGregor vd. tarafından bu metod periferik kanda dolaşan polikromatik eritrositlerde denenmiş ve en az kemik iliği metodundaki kadar hassas olduğu gözlenmiştir. Bu metod hayvanları öldürmeden fazla sayıda örnek alınmasına olanak verdiği için daha avantajlı sayılmıştır (Almassy vd. 1987). Countryman ve Heddle 1976 yılında yaptıkları
çalışmada, lenfositlerde MN oluşumunu belirleyerek, kromozom hasarının meydana çıkarılmasında diğer bir uygulanabilir hücresel sistem ileri sürmüşlerdir (Kirsch-Volders vd. 2003). Von Ledebur ve Schmid 1973’te, Högstedt ve Karlsson 1985’te geliştirdikleri modifiye metodlarla, aneuploidiye yol açan ajanlar ile klastojenleri birbirinden ayırmada, MN büyüklük farkından yararlanmışlar; klastojenlerce uyarılan MN’ların asentrik kromozom fragmentleri içeren küçük, aneujenlerce uyarılan MN’ların tam kromozomlar içerdiğini ve daha büyük ebatlı olduğunu göstermişlerdir (Demirel ve Zamani, 2002). Daha sonraları 1985 ve 1986 yıllarında Fenech ve Morley tarafından Sitokinezi-Blok (Cytokinesis-Block) Metodu geliştirilmiştir (Demirel ve Zamani, 2002). MN araştırmalarında in situ hibridizasyon (ISH) tekniği, ilk defa kromozomların sentromerini tanımlamak için Norppa vd. tarafından 1993’te uygulanmıştır (Demirel ve Zamani, 2002). Daha sonra Richard vd. 1994’te floresan in situ hibridizasyon (FISH) tekniği ile MN oluşturan kromozomların her birinin kimliğini belirleyebilecek teknolojik gelişmeler sağlamışlardır (Demirel ve Zamani, 2002). Sentromerik problu floresan in situ hibridizasyon metodu, aneuploidiyi indükleyen bileşiklerin değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (Papapaulou vd. 2001).
2.2.2. MN test yöntemi ve uygulama amacı
MN yönteminin geliştirilmesinde en önemli adım; MN oluşumuna izin veren, bir çekirdek bölünmesini tamamlamış hücrelerin sayılmasının esas alınmasıdır (Fenech vd. 1999). Sitokinezi-blok mikronukleus metodunu geliştiren Fenech ve Morley 1986’da, hücre kültürüne mitoz sırasında sitoplazma bölünmesini durduran aktin inhibitörü cytochalasin-B (Cyt-B) ilave ederek çekirdek bölünmesini tamamlamış, ancak sitoplazmik bölünmesini gerçekleştirememiş çift çekirdekli hücreler elde etmişlerdir (Fenech vd. 1999, Kirsch-Volders vd. 2003). İncelenen alanda kültür süresi içinde ikinci bölünmesini tamamlamış 4 çekirdekli hücrelere de rastlanmaktadır; ancak MN sayımında Heddle ve Countryman’in (1976) kriterleri kullanıldığından bu hücrelerde
görülen MN’lar değerlendirme dışı bırakılmaktadır (Demirel ve Zamani, 2002). Heddle ve Countryman’in (1976) kriterlerine göre:
1- MN esas nukleus ile aynı yapıda olmalıdır. 2- MN esas nukleustan küçük olmalıdır.
3- MN esas nukleustan ayrı, yuvarlak veya yaklaşık yuvarlak şekilli olmalıdır. 4- Nukleer olmayan partiküllerden farklı olarak ışığı yansıtmamalıdır.
5- MN feulgen pozitif veya diğer DNA’ya özel reaksiyonlarda pozitif reaksiyon göstermelidir.
6- MN’lar sitoplazması iyi gözlenen hücrelerde sayılmalıdır. 7- MN oluşumu doza bağlı olmalıdır (Almassy vd. 1987).
Sitokinezi-blok Mikronukleus (CBMN) tekniği in vitro genotoksisite testleri, insan populasyon taramasında kolayca uygulanabilecek bir tekniktir (Fenech vd. 1999). MN tekniği, en çok çeşitli kimyasallara ve fiziksel ajanlara maruz kalmış bireylerin taranması amacı ile, bireyler arasında genetik hasarın temel seviyesini anlamak (Fenech vd. 1999) ve çeşitli ajanların klastojenik ve aneujenik potansiyellerini değerlendirmek amacı ile insan lenfositlerini de içeren farklı tip hücrelerde geniş çapta kullanılmaktadır (Fenech ve Morley, 1985).
2.2.3. MN testi avantajları
MN test yöntemini sitogenetik anormallikleri belirlemede etkili bir metod yapan; farklı hücre tiplerinde in vitro şartlarda yaygın uygulanabilirliği ve sayım kolaylığıdır. Ayrıca elde edilen verilerin çok sayıda olması istatistiksel dayanağının güçlü olmasını sağlar (Fenech vd. 1999). Fenech 1997’de, Kirsch-Volders 1997’de, Eastmond ve Tucker 1989’de MN test yönteminde kinetekor veya sentromeri belirleyen metodlar kullanarak; kromozom kırığı nedenli MN ile kromozom geri kalması nedenli MN’ları birbirinden ayırmanın kolay olduğunu belirtmişlerdir (Fenech vd. 1999). İmmünokimyasal işaretleme metodları ile CBMN test yöntemi, MN oluşumundan sorumlu esas mekanizmanın anlaşılmasını sağlar. Çift iplik DNA kırıkları, asentrik
fragmentli MN oluşumuna ve mitotik apereydeki hata, tam kromozomlu MN oluşumuna neden olmaktadır (Kirsch-Volders vd. 2003). Kirsch-Volders vd. 1997’de, Fenech vd. 1997’de yaptıkları çalışmaların sonuçlarına göre; bu yöntem klastojenik ve aneujenik etkileri birbirinden ayırabilmekte ve Elhajouiji vd.’nin 1997 yılı çalışma sonuçlarına göre ayrıca; doz-cevap eğrisi, tam kromozom ve kromozom ayrılmaması sonuçlarına uygulanabilmektedir (Kirsch-Volders vd. 2003). Bundan dolayı in vitro MN test yöntemi bilimsel olarak yeterli ve güçlü kabul edilmektedir (Kirsch-Volders vd 2003).
2.2.4. MN ve kanser ilişkisi
MN frekansı ile kanser gelişimi arasındaki direk ilişki birçok bulgu ile desteklenmektedir. Cheng vd. 1996’da, Duffaud vd. 1997’de yaptıkları çalışmalara göre; kanser hastalarında periferik lenfositlerde olduğu gibi hedef dokuda da MN frekansı artmaktadır (Fenech vd. 1999). Rudd vd. 1988’te, Rosin ve German 1985’teki bildirilerine göre; Bloom sendromu veya ataxia telangiectasia gibi hastalıklardan etkilenen bireyler, yüksek MN frekansı ve kanser riski taşımaktadırlar (Fenech vd. 1999). Sorsa vd. 1992 yılında yaptıkları araştırmaya göre; bazı ajanlar insan ve hayvanlarda MN frekansını arttırabilmekte, kanserojenite ve genotoksisite arasında bir ilişki bulunmaktadır ve bu ajanlar; iyonize radyasyon, benzen, sigaradır (Fenech vd. 1999). Fenech ve Rinaldi 1995’te, Fenech vd. 1997’de, Blount vd. 1997’de, Fenech vd. 1998’de, MN’un kandaki vitamin ve folate konsantrasyonu ile çok kuvvetli ilişkisi bulunduğunu, bunların azlığı bazı kanser tiplerinde artışa neden olduğunu bildirmişlerdir (Fenech vd. 1999). Bu bulgular açıkça MN ve kanser arasında bağ olduğunu göstermektedir.
KA ile kanser sıklığı arasında anlamlı ilişki vardır. Ancak bu ilişki KKD de bulunmamıştır. MN için henüz veriler yeterli sayıda değildir (Fenech vd. 1999).
2.3. Kardeş Kromatid Değişimi (KKD)
2.3.1. Kardeş kromatid değişim mekanizması
Kimyasal ve fiziksel ajanların mutajenite ve karnserojenitesinin test edilmesinde değerlendirilen diğer kriter, kardeş kromatid değişim (KKD)’leridir. Latt vd. 1981’de KKD’lerin tek bir kromozomun iki kromatidi üzerinde homolog bölgelerdeki kırılma ve yeniden birleşme ile oluşan DNA replikasyon ürünlerinin sitolojik göstergesi olduğunu, Tucker vd. 1993’te KKD’lerin hassas genotoksik aktivite indikatörleri olarak geniş alanda kullanıldığını bildirmişlerdir (Villarini vd. 1998).
KKD’ler, tek bir kromozomun iki kromatidi arasında gerçekleşen karşılıklı değişimlerdir. Bu değişimler hücre siklusunun metafaz safhası sırasında görülebilirler ve KKD’lerin meydana gelmesi için enzimatik kesim, translokasyon ve en az iki DNA heliksinin kaynaşması gerekir.
Pommier vd. (1985) araştırmalarında; KKD’lerin meydana gelişinde Topoizomeraz II enziminin etkili olduğunu ileri sürmüşlerdir.
Topoizomeraz II enzimi DNA’ya bağlanarak bir kompleks oluşturur. DNA’ya etki eden ajanlar bu kompleksin oluşumunu engellemektedirler. Enzim iki alt birimden oluşur (dimer). Bu dimer DNA’ya iki şekilde bağlanabilir; ya bir kovalent bağ içerir, bu bağ enzim molekülü ile DNA çift ipliğinden bir tanesinin 5’ ucu arasındadır ve bu enzim aracılığı ile DNA ipliğinden biri koparılır, ya da aynı şekilde karşılıklı kovalent bağ içerir. Bu durumda topoizomeraz II:DNA kompleksi iki DNA:protein bağı ve bir çift iplik kırığı (DSB) içerir (Şekil 2.3.1.1.). Her iki durumda da DNA’ya etki eden ajanlar tarafından topoizomeraz II:DNA kompleksi bozulur ve normal enzim fonksiyonu inhibe edilmiş olur.
İleri sürülen hipotez KKD’lerin S fazına bağlı bir olay olması, yeni replike olmuş DNA ipliklerinin DNA çift iplik kırık bölgelerinde değiş tokuşu sonucu oluşmasıdır. Çünkü bu enzim yeni replike olmuş DNA ipliklerini tekrar organize ederken, DNA’da çift iplik kırıkları oluşturur ve bunları tekrar birleştirir. DNA’ya etkili ilaçlar topoizomeraz II kompleksini etkileyerek, kırılan DNA çift ipliğinin tekrar
birleşmesini önler. Bu kırıklar kardeş kromatidlerin değiş tokuşuna neden olur (Pommier vd. 1985).
DNA replikasyonundan sonra DNA topoizomeraz II homodimerleri, yeni replike olmuş DNA ipliklerine, DNA yapısını tekrar organize etmek için bağlanırlar. DNA’ya etki eden ajanlar (intercalator); her bir DNA çift ipliği üzerinde iki DNA topoizomeraz II homodimerlerinin birbirinden ayrılmasına (moleküllerin dimerlerinin ayrılması) ve 2 homolog enzim molekülünün karşılıklı olarak değiş tokuşuna neden olabilirler (Şekil 2.3.2.). Alt üniteler karşılıklı yer değiştirmekte, buna bağlı olarak A' ve B' DNA çift iplikleri de yer değiştirmektedir. Yer değiştirmiş A' ve B' DNA çift iplikleri, sırasıyla B ve A DNA çift iplikleri ile bağlanmakta ve bunun sonucunda KKD meydana gelmektedir (Pommier vd. 1985).
KKD’ler doza bağlı olarak genotoksik bileşiklere cevap verirler, ve açıkça DNA hasarı olduğunu gösterirler (Perry ve Evans, 1975). KKD tam DNA çiftsarmalı değiş tokuşunu izleyen her iki DNA ipliğinin kırılmasını içerdiğinden dolayı KKD, DNA kırılmasının sitolojik göstergesidir.
Birçok çalışmada FPG tekniği kullanılarak, kimyasalların KKD’leri indüklemesi açısından değerlendirilmeleri sağlanmıştır. Klasik KA sayımına göre KKD sayımı tercih edilir. Çünkü KKD sayımı, KA sayımına göre daha kolaydır. Ayrıca KA sayımı, farklı sınıflardaki aberasyonları tanımada deneyim gerektirir ve en az 100 metafaz hücresinin sayılması gerekir. Ancak KKD belirlemede 20-25 hücre yeterli olmaktadır. Diğer taraftan şu açıktır ki bir kimyasalın mutajenitesini test etmek için KKD sayımı, KA sayımının yerini tutamaz. Direkt DNA iplik kırıklarını indükleyen ajanlar (ör: iyonize radyasyon, bleomisin ve streptonygrin), KA’larını indükledikleri oranda KKD frekansını arttırmazlar. Bu nedenle sitogenetik çalışmalarda hem KA, hem de KKD’lere bakılması, o maddenin etkinliğinin anlaşılması açısından önemlidir (Natarajan ve Obe, 1982).
Şekil 2.3.1.1. Memeli topoizomeraz II:DNA kompleksinin olası durumları. ●, kırık bölgelerinde topoizomeraz II ile DNA’nın 5’ terminal ucu arasında kovalent bağ (Pommier vd. 1985).
Şekil 2.3.1.2. KKD’lere neden olan DNA’ya etkili ajanların etki mekanizması modeli (Pommier vd. 1985).
2.3.2. KKD indükleyen ajanlar
Kendiliğinden oluşan KKD frekansı, hücrenin DNA içeriği ile ilişkilidir. Örneğin Uggla ve Natarajan (1982) KKD frekansının Vicia faba’da hücre başına 62 olacak kadar yüksek (DNA 54 pg/hücre) ve Drosophila melanogaster’de hücre başına 0.14 olacak kadar düşük (DNA 0.54 pg/hücre) olabildiğini bildirmişlerdir (Natarajan, 2002).
KKD, S fazında meydana geldiğinden dolayı, DNA replikasyonu sırasında etkili olan ve DNA hasarı oluşturan kimyasallar KKD’leri indükler. Bu kimyasallar KA’larına göre daha düşük konsantrasyonlarda KKD’lere neden olurlar.
S fazına bağlı ajanların (ör: UV ve alkilleyici ajanlar), KKD’lerinin potansiyel indükleyicileri olduğu buna karşın S fazına bağlı olmayan ajanların (ör: X-ışınları ve Bleomisin) KKD’lerin zayıf indükleyicileri oldukları saptanmıştır.
KKD’lerin, nokta mutasyonları, gen amplifikasyonları ve sitotoksisiteye neden olabilecekleri bildirilmiştir (Perry and Evans, 1975).
2.4. Urea Herbisitleri
Urea herbisitleri tarım alanlarında geniş yapraklı ve diğer otsu zararlıların kontrolünde kullanılırlar. Bitki kökleri tarafından alınarak hızla bitkinin üst kısımlarına iletilir ve genellikle yapraklarda gözlenen fitotoksik semptomlar oluştururlar. Herbisit sınıflandırmasında urea herbisitleri; fenylurea herbisitleri, sulfonylurea herbisitleri, thiadiazolylurea herbisitleri olmak üzere 3 sınıfa ayrılırlar. Sulfonylurea herbisitleri kendi içinde pyrimidinylsulfonylurea ve triazinylsulfonylurea herbisitleri olmak üzere 2 sınıfa daha ayrılmaktadır (Classification of herbicides, 2005). Triasulfuron, triazinylsulfonylurea sınıfına ait bir herbisittir.
Hay 1990’da Sulfonylurea’ların (SU) herbisidal aktivitesinin ilk kez 1966’da fark edildiğini bildirmiştir (Cox, 1993). SU’lar herbisitlerin gelişen sınıfıdır. Bunlar ilk
olarak 1970’lerin ortalarında üretilmiştir. İnsanlar ve hayvanlara zararlı olmadığı için SU’lar güvenli herbisitler olarak piyasaya sunulmuştur. SU herbisitleri DuPond Crop Protection tarafından 1982’de üretilmiştir. Tarım alanlarında 100 g/ha oranında uygulanırlar. Memeli toksisitesi düşüktür ve uygulamadan sonra zararsız bileşiklere bozulur. Geniş yapraklı zararlıların, tahıl ve saf ürünlerde otların ve endüstriyel zararlıların kontrolünde kullanılmaktadır. Yaklaşık 25 SU herbisitine tarım alanlarında kullanım izni verilmiştir. 2 heterosiklik halka arasında SU köprüsü varlığı ile karakterizedirler. SU’lar kimyasal ve termal olarak kararsızdırlar. Asidik solüsyonlarda, hidrolitik kırılma ile sulfonylurea köprüsü oluşur; nötralden hafif alkali solüsyonlara doğru birçok sulfonylurea kararlılık gösterir ve bir urea hidrojen atomunu kaybederek aniyonik formda kalır. Bu bileşikler genellikle organik çözücülerde kararlıdır ve hidrokarbonlardan başka temel organik çözücülerde 1 mg/100 ml’den daha yüksek seviyelerde çözünürler (Powley, 2003).
Kimyasal aktivite ile bitkileri öldürmekten ziyade, SU herbisitleri asetolaktat sentaz (ALS) enzimini inhibe ederek amino asit zincirinde temel dalların sentezini bloke ederler (lösin, izolösin, valin). Bu nedenden dolayı, bu kimyasallar SU/ALS veya nadiren ALS herbisitleri olarak refere edilirler. ALS enzimleri, hayvanlarda bulunmadığı için SU herbisit üreten firmalar onların ürünlerinin hayvanlar ve insanlar için güvenilir olduğunu iddia ederler (Flogel, 1998).
Aşağıda bazı urea grubu herbisitlerinin toksikolojik ve mutajenik çalışmalarına yer verilmiştir.
Tribenuron methyl (triazinylsulfonylurea)
Salmonella typhimurium ve Çin hamster over (CHO) hücrelerinde in vitro gen mutasyonları negatif sonuç vermiştir. Sıçanlarda sitogenetik testler, farede MN testini içeren yapısal kromozom hasar testleri negatif sonuçlanmıştır. In vitro sıçan hepatositlerinde program dışı DNA sentez (UDS) testi negatiftir (EPA, 1989).
FAO (2002), tribenuron methyl’in mutajenite profil bildirisinde; bu kimyasalın Salmonella thphimurium in vitro bakteri gen mutasyon testinde S9 metabolik aktivasyon varlığında ve yokluğunda negatif mutajenik aktivitesi olduğunu, insan lenfositleri in vitro periferik kan kültüründe S9 varlığında ve yokluğunda yapısal KA’larını indüklemediğini, CHO hücreleri in vitro memeli gen mutasyon testinde S9
metabolik aktivasyon varlığında ve yokluğunda CHO/HGRPT (hipoksantin guanin fosforibozil transferaz) gen mutasyonlarını indüklemediğini, sıçan primer hepatositlerinde in vitro UDS testinde negatif olduğunu, dişi ve erkek sıçanda KA için in vivo kemik iliği testinde UDS oluşturmadığını, dişi ve erkek farede in vivo kemik iliği MN testinde negatif olduğunu bildirmiştir.
Triflusulfuron methyl (triazinylsulfonylurea)
Ames testinde, memeli (CHO) gen mutasyonları testinde, fare kemik iliği MN testinde 5000 mg/kg’a kadar negatif sonuç vermiştir. Kültüre edilen sıçan hepatositlerinde UDS negatiftir (EPA, 1996). Ancak insan lenfositlerinde metabolik aktivasyon varlığında 1500 µg/ml den yüksek dozlar içini pozitif sonuçlar gözlenmiştir. İnsan lenfositlerinde aktivasyonsuz şartlarda KA çalışmaları yetersizdir (EPA, 2001).
DPX-66037 (Triflusulfuron methyl) metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda 62.5,125,250,500,1000 µg/petri konsantrasyonlarında Salmonella typhimurium TA98,100,1535,1537,1538 suşlarında Ames testinde, 2000 µg/ml’ye kadar CHO/HGPRT gen mutasyon testinde mutajenik değildir. İnsan lenfositlerinde 50, 100, 200 µg/ml DPX 66037-59 aktivasyonsuz şartlarda, 100,200,400 µg/ml aktivasyonlu şartlarda denenmiş ve klastojenik olmadığı saptanmıştır. Sonuçlar güvenilir bulunmadığından dolayı bu test değerlendirilmeye alınmamıştır. Ayrıca insan lenfositleri sitogenetik testi ile 0.5, 1.5, 1.7, 1.85, 2.00 mg/ml DPX 66037-59 konsantrasyonları aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda denenmiş ve 1.85 mg/ml konsantrasyonda kontrolden daha düşük MI oranı tespit edilerek sitotoksik etki gözlenmiştir. Triflusulfuron methyl’in metabolik aktivasyon ile 2 mg/ml’de klastojenik olduğu tespit edilmiştir (PMRA, 1999).
Metsulfuron methyl (triazinylsulfonylurea)
Ames testi, memeli gen mutasyon (CHO/HGPRT) testi, UDS, in vivo kemik iliği sitogenetik testleri, in vivo fare MN testi negatif sonuç vermiştir. Methsulfuron methyl sadece 1000 mg/l’den yüksek konsantrasyonlarda CHO hücrelerinde in vitro KA’larını indüklemiştir fakat in vivo sıçan kemik iliğinde KA’larını indüklememiştir. Fare kemik iliği eritrositlerinde MN oluşumunu indüklememiştir. Metsulfuron methyl ne genotoksik ne de mutajeniktir (EPA, 1998b).
Donovan’ın 1984 yılında yaptığı çalışmaya göre, Salmonella typhimurium’da in vitro Ames mutajenite testinde 0-10 µg/ml konsantrasyonlarında; Fitzpatrick’in 1982’de yaptığı çalışmaya göre, CHO hücrelerinde CHO/HPRT mutajenite testinde 0-2670 mg/l konsantrasyonlarında; Vincent’in 1983’teki araştırmasına göre, sıçan primer hepatositlerinde UDS testinde 0-38 mg/l konsantrasyonlarında, Bentley’in 1990 yılında yaptığı araştırmaya göre sıçan primer hepatositlerinde UDS testinde 0-3000 µg/ml konsantrasyonlarında; Cortina’nın 1983’teki araştırma sonuçlarına göre, sıçan kemik iliğinde in vivo KA indüksiyonu testinde 0-5000 mg/kg konsantrasyonlarında; Vlachos’un 1984 yılında yaptığı çalışmaya göre, fare kemik iliğinde MN indüksiyonu testinde 0-5000 mg/kg konsantrasyonlarında negatif sonuç göstermiştir (DAR, 2004). Ancak Vlachos’un 1983’te 0-3000 mg/l Metsulfuron methyl konsantrasyonlarını CHO hücrelerinde denediği çalışmada KA testinde 1 mg/ml’nin üzerindeki konsantrasyonlarda metsulfuron methyl’in pozitif etki gösterdiğini saptamıştır (DAR, 2004).
Chlorsulfuron (triazinylsulfonylurea)
Chlorsulfuron in vitro mutajenitesinin çalışıldığı Ames ve CHO/HPRT testlerinde, in vitro sitogenetik testinde, in vitro DNA onarım testinde, in vitro UDS testinde negatif sonuç vererek genotoksik ve mutajenik etki göstermemiştir (EPA, 2002).
Ethametsulfuron methyl (triazinylsulfonylurea)
Mutajenik ve genotoksik etkilerini gözlemek amacı ile yapılan testler sonucunda ethamethsulfuron methyl genotoksik ve mutajenik değildir. Bu testler; bakterilerde Ames, CHO hücrelerinde mutajenite testleri, sıçanlarda izole edilen kemik iliği hücrelerinde KA testi, fare kemik iliğinde MN testi ve kültüre edilen sıçan karaciğer hücrelerinde DNA hasarı ölçüm testidir (EPA, 1997a).
Sulfosulfuron (pyrimidinylsulfonylurea)
In vitro Ames /Salmonella mutajenite testinde EPA (1997b) kullanılan 5 temel suşta negatif mutajenite olduğunu bildirmiş, Pest management Regulatory Agency metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda 1500 µg/petri dozlarında
sulfosulfuron’un sitotoksik olduğunu, toksik olmayan dozlarda sulfosulfuron’un mutajenik etki göstermediğini bildirmiştir (PMRA, 1998). Sulfosulfuron nokta mutasyonları için mutajenik değildir (PMRA, 1998). In vitro memeli hücresi gen mutasyon testinde CHO/HGPRT negatif sonuç vermiştir (PMRA 1998, EPA 1997b). Sulfosulfuron’un mutajenik olmadığı, nokta mutasyonlarına, çerçeve kayması mutasyonlarına ve delesyonlara neden olmadığı bildirilmiştir (PMRA, 1998). In vitro sitogenetik testinde kültüre edilen insan lenfositlerinde hem metabolik aktivasyonlu hem de aktivasyonsuz şartlarda, 100, 250, 500, 750, 1000 µg/ml konsantrasyonlarda etkisi incelenmiştir. Mitotik indekste %14,9’dan %66,7’ye kadar bir azalma gözlenmiştir. Bununla beraber KA’lu hücre sayısında veya poliploid hücre sayısında artış gözlenmemiştir. Elde edilen sonuçlara göre sulfosulfuron metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda insan lenfosit kültüründe klastojenik değildir (PMRA 1998, EPA 1997b ).
Çin hamster fibroblastlarında in vitro metodunda 2000 µg/ml ve daha yüksek dozlarda, metabolik aktivasyonsuz şartlarda, kromozom yapı aberasyonlu hücre sayısında artış gözlenmiştir. Bu şartlarda klastojenik olduğu bildirilmiştir (PMRA, 1998). In vivo memeli MN testinde farelerde klastojenik olmadığı bildirilmiştir (PMRA 1998, EPA 1997b). EEC (2000), Çin hamsterlerinde in vitro şartlarda uygulanan konsantrasyonların, in vivo şartlarda sitotoksik etkisinden dolayı uygulanamayacağını, dolayısı ile in vitro ve in vivo grupların karşılaştırılmayacağını bildirmiştir.
In vitro CHO/HGPRT gen mutasyon testinde, kültüre edilen memeli hücrelerinde KA testinde, insan lenfositlerinde in vitro KA testinde, farede in vivo kemik iliği MN testinde negatif sonuçlar elde edildiğinden dolayı sulfosulfuron genotoksik veya mutajenik etki göstermemektedir (EPA, 1997b). Sulfosulfuron’un akut toksisitesi düşük olduğu için genotoksik olmadığı, üreme, gelişim ve sinir sisteminde toksik olmadığından dolayı insan sağlığını tehdit etmediği kabul edilmektedir (Healy vd. 2004).
Rimsulfuron DPX-E9636 (piridisulfonylurea)
Piridilsulfonylurea herbisidi olan Rimsulfuron’un ticari formülasyonu DPX-E9636’in in vitro sığır lenfosit kültüründe aberasyon sayısında ve aberasyonlu hücre yüzdesinde anlamlı artışa neden olduğu ve KKD’leri doza bağlı olarak anlamlı
indüklediği ve bu herbisidin in vitro sığır lenfosit kültüründe genotoksik olduğu bildirilmiştir (Lioi vd. 1998a). DPX-E9636’nın insan lenfosit kültüründe yapılan çalışmasında da benzer sonuçlar elde edilmiştir. Bu kimyasalın doza bağlı olarak aberasyonlu hücre yüzdesini ve hücre başına düşen KKD sayısını arttırdığı bildirilmiş mitotik indeksi düşürdüğü tespit edilmiştir (Lioi vd. 1998b).
Sulfometuron methyl (pyrimidinylsulfonylurea)
DuPont (1979) (1981a) (1981b) Sulfonylurea methyl’in Salmonella’da ve CHO hücrelerinde mutajenik olmadığını, DuPont (1984) ve (1987) sıçan ve farede kanserojenik etki gözlenmediğini bildirmiştir. DuPont’a göre Sulfometuron methyl’in kanserojenik etkisi yoktur ve genetik hasar oluşturmaz (Cox, 1993).
Primisulfuron methyl (pyrimidinylsulfonylurea)
Primisulfuron methyl Ames mutajenite testinde Salmonella TA98 suşunda 1024 µg/petri konsantrasyonuna kadar metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda pozitif etki göstermemiştir. Çin hamsterlerinde 5000 mg/kg’a kadar MN oluşumunu indüklemediği ve toksik olmadığı gözlenmiştir. Sıçan karaciğer hücreleri (hepatositler) UDS testi 400 µg/ml’ye kadar negatif, insan lenfositleri ile UDS 1000 µg/ml’ye kadar aktivasyonsuz şartlarda negatif sonuç vermiştir (EPA, 1990).
Tebuthiuron (thiadiazolylurea)
Tebuthiuron’un Ames mutajenite testinde, fare MN analizi yapılarak yapısal KA testinde negatif sonuç gösterdiği, mutajenik ve kanserojenik olmadığı bildirilmiştir (EXTOXNET, 1996a)
Diazolidinyl urea (imidazolidinylurea)
Dimethylol urea teskstil endüstrisinde katkı maddesi olarak, diazolidinylurea (DZU) ise kozmetik alanında kullanılan urea bileşikleridir. DZU’nın Salmonella typhimurium mutajenite testinde mutajenik olmadığı (Liebert, 1990), fare kemik iliği in vivo MN testinde MN oranında artışa neden olmadığı görülmüştür. Ancak daha sonra Pfuhler ve Wolf (2002) DZU ve DMU’nun Salmonella typhimurium mutajenite testinde
TA98, 100, 102 suşlarında pozitif sonuç gösterdiğini saptamışlardır. Aynı araştırıcılar in vitro MN testinde de V79 Çin hamster hücrelerinde MN oluşumunu indükleyerek genotoksik etki gösterdiklerini bildirmişlerdir.
Fluometuron (phenylurea)
Weed Science Society of America 1994’te, fluometuron’un, Ames mutajenite testi, KA’ları için hücre kültürü testi, insan fibroblast hücreleri ve sıçan karaciğer hücrelerinde DNA onarım inhibisyon testleri gibi mutajenite ve genotoksisite testlerinde aktivite göstermediğini bildirmiştir (EXTOXNET, 1996b). EPA’nın 1988’de Fluometuron ile yaptığı bir çalışmaya göre; fareye verilen 2000 mg/kg’lık yüksek doz sonrası DNA sentezi ile etkileşim gözlendiğini saptamıştır (EXTOXNET, 1996b). Bu çalışmalara dayanarak Fluometuron’un mutajenik olmadığı görülmektedir. Weed Science Society of America 1994’te Fluometuron’un kanserojenik etkisini araştırmak amacı ile 2 yıl boyunca farelere 87 mg/kg/gün verilen çalışma sonucunda; karaciğer tümörü, lösemi, beyaz kan hücresi sayısında kontrolsüz büyüme gözlenmiştir (EXTOXNET, 1996b). Diğer bir çalışmada, National library of medicine’ın 1995’te ve EPA’nın 1988’deki bildirilerine göre; erkek farede karaciğer hücre tümörü sıklığında artış gözlenmiş, fakat dişi fare ve sıçanlarda her iki eşeyde de kanserojenik etki gözlenmemiştir (EXTOXNET, 1996b). Seiler 1978’de fare kemik iliğinde yaptığı çalışmada, fluometuron’un MN oluşumuna neden olduğunu göstermiştir (Behera ve Bhunya, 1990).
Isoproturon (phenylurea)
Isoproturon’un genotoksik etkilerinin in vivo KA, MN ve sperm şekli anormallikleri test yöntemleri ile araştırıldığı çalışmada bu herbisidin KA ve sperm şekli anormallikleri testlerinde doza bağlı olarak pozitif sonuç verdiği, MN testinde yüksek dozda (200 mg/kg) etkili olduğu saptanmış ve sonuçta memeli in vivo test sisteminde isoproturon’un genotoksik özelliği olduğu bildirilmiştir (Behera ve Bhunya, 1990).
CHOK1 hücrelerinde SCGE testinde DNA hasarı oluşturmadığı ve anlamlı KA’larına neden olmadığı bildirilmiştir (Vigreux vd. 1998).
Isoproturon’un bitkiler üzerindeki sitogenetik etkileri araştırıldığında; Badr ve Elkington (1982) Isoproturon’un Allium cepa ve Hordeum vulgare’de mitotik aktiviteyi düşürdüğünü, iğ ipliği aygıtında bozulmaya sebep olduğunu, C-metafaz, kromozom sayısının ikiye katlanması, kalgın kromozomlar, multipolar anafaz ve telofaz oluşumunu arttırdığını, bu sonuçlara göre bitki test sisteminde sitotoksik ve klastojenik olduğunu, Chauhan vd. (2001) Isoproturon’un farklı konsantrasyonlarının (35-280 ppm) Allium sativum kök meristem hücrelerinde MI’i doza bağlı anlamlı olarak inhibe ettiğini, kromozom kırıkları/mitotik aberasyonlara neden olduğunu, Isoproturon’un genotoksik olduğunu, Chauhan ve Gupta (2005) Isoproturon’un Deltamethrin (insektisid) ile kombine kullanımının Allium cepa kök meristem hücrelerinde kromozom kırıkları, yapışıklık, multipolar anafaz, kromozom köprüleri, kalgın kromozomlar, kromozomların dengesiz ayrılması, iki ve çok nukleuslu hücrelere neden olduğunu, kombine muamelelerin organellerde ultrastrukturel değişimlere neden olduğunu ve bitki hücrelerinde geri dönüşümsüz hasarlar meydana getirdiğini bildirmişlerdir.
Diuron (phenylurea)
Diuron Allium cepa kök ucu hücrelerinde hücre bölünmesini doza bağlı olarak inhibe etmiş ve kromozom kırıkları, C-metafaz, kromozom yapışıklığı, kalgın kromozomlar, multipolar düzensizlikler, anafaz köprüleri gibi çeşitli mitotik anormalliklere ve kök uçlarında morfolojik değişikliklere neden olmuştur (Chauhan vd. 1998). Daha sonra Saxena vd. (2004), Diuron’un Allium sativum kök ucu hücrelerinde sitogenetik etkilerini araştırmak üzere yaptıkları çalışmada, mitotik anormallikler ve KA’larında doza bağlı anlamlı artışın olduğunu ve Diuron ile DNA molekülü arasında muhtemel bir etkileşim olduğunu ileri sürmüşlerdir. Diuron’un insan spermatozoa hücreleri üzerinde etkisini görmek için yapılan bir başka çalışmada bu urea herbisidinin spermatozoa üzerinde yapısal ve fonksiyonel etkileri olduğu, spermatozaların canlılık ve hareket kabiliyetini azalttığı bildirilmiştir (Malpuech-Brugere vd. 2001).
Diuron’un fare kemik iliğinde MN oluşumuna neden olduğu (Agrawal vd. 1996), Swiss albino farelerde dominant letal test sisteminde mutajenik olduğu (Agrawal ve Mehrotra, 1997), sıçanlarda maternal toksisiteyi ve anormal fetus sıklığını arttırdığı gösterilmiştir (Khera vd. 1979).
Fenilurea herbisitlerinin sıçanlarda hematoksik etkilerinin araştırıldığı çalışmada Monuron, Diuron ve Fenuron ile dişi fareler muamele edilmiş; monuron ve diuron muameleli sıçanlarda dalak ağırlığında doza bağlı artış dışında, organ ağırlıklarında doza bağlı etkinin görülmediği, eritrosit morfolojisinde değişiklikler meydana geldiği, histolojik açıdan lezyonlar oluştuğu ve hemolitik anemi ve methemoglobinomeni’ye bağlı olarak dalakta pigmentasyon artışı görüldüğü, dolayısı ile dalakta toksik olduğu bildirilmiştir (Wang vd. 1993). Diuron’un albino sıçanlarda kronik muamelesi sonucu yüksek oranda mortalite ve ağırlık kaybına sebebiyet vererek sıçan karaciğerinde anlamlı histolojik değişikliklere neden olduğu hepatotoksik etkisi olduğu gözlenmiştir (Agrawal ve Kumar, 1999).
Linuron (phenylurea)
EPA 1988’de akut memeli toksisite çalışmalarında Linuron’un düşük aktivite gösterdiğini ve CHO hücrelerinde ve Salmonella typhimurium’da gen mutasyon testi, UDS testi ve in vivo sıçan kemik iliği gibi birçok in vitro ve in vivo yöntemde genotoksisite göstermediğini bildirmiştir (Papapaulou vd. 2001). Sıçanlarda in vivo kemik iliği kromozom çalışmasında, aberasyon frekansında artış gözlenmemiş, in vitro sıçan hepatositlerinde UDS negatif sonuç vermiştir (DPR, 1987).
Atrazine ve Linuron herbisitlerinin ayrı ayrı ve kombine şekilde insan lenfositlerinde test edildiği çalışmada, bu kimyasalların ayrı ayrı verilen dozlarda çok az kromozom hasarına neden olduğu, kombine verilen dozlarda anlamlı kromozom hasarını indüklediği saptanmıştır. Aynı çalışmada faredeki etkilerini gözlemek üzere aynı şekilde verilen kimyasallar kemik iliği hücrelerinde tüm gruplarda kromozom hasarını indüklemediklerini fakat kültüre edilen dalak hücrelerinde tüm gruplarda hasar gözlendiğini bildirmişlerdir (Roloff vd. 1992).
Scassellati-Sforzolini vd. (1997) in vivo şartlarda linuron’un saf bileşik ve ticari formülasyonunun genotoksisitesini araştırdıkları çalışmalarında mikronukleuslu polikromatik eritrosit sayısında artış olmadığını, bununla beraber linuron’un hepotosit canlılığını etkilediğini bildirmişlerdir. Bu sitotoksisitenin karaciğerde DNA tek iplik kırıklarına neden olduğunu ileri sürmüşlerdir. Sıçan testis hücrelerinde sitotoksik olduğunu göstermişlerdir (Scassellati-Sforzolini vd. 1997).
Linuron’un insan lenfosit kültüründe MN sıklığını doza bağlı olarak lineer şekilde arttırdığı ve CBPI’i düşürerek doza bağlı sitotoksik etkili olduğu, elde edilen FISH sonuçlarından klastojenik ve aneujenik kimyasal olduğu tespit edilmiştir (Papapaulou vd. 2001).
Birçok SU diabet hastalarını tedavi etmek için kullanılmaktadır. Bazı SU sınıfı ilaçlar (carbutamide, chloropropamide, glibenclamide, glipentide, glipizide, tolbutamide) NIDDM (insüline bağımlı olmayan diyabet) hastalarına verilmiştir. NIDDM hastası pankreası insülin üretir fakat vücut ihtiyacını karşılamaz. Sulfonylurea ilaçları pankreası daha fazla insulin üretmek üzere düzenler, şekerin vücut hücrelerine girmesi için insuline yardım eder ve kandan atılma hızını düşürür (Flogel, 1998). Bu SU ilaçlarından olan ve hipoglisemik ajan olarak kullanılan Chlorpropamide’in in vivo sitogenetik etkili olduğu saptanmıştır. Kontrole göre anlamlı kromatid aberasyonları ve kromatid değişim aberasyonları gözlenmiştir. Kromatid değişim tipi aberasyonların fazla olması sulfonylurea’ların kromozom kırıkları oluşturma etkisini göstermektedir (Watson vd. 1976). Kromatid değişim tipi aberasyonlar kromozomların kırılması ve yeniden birleşmesi ile oluşur. Disentriklerin anlamlı artışı hücrelerin klastojenik ajana maruz kaldığını gösterir. Chlorpropamide’in DNA molekülü ile direkt reaksiyona girecek veya hasar verecek bir mekanizması olmadığından, direkt DNA üzerine etki etmesi pek olası görünmez. Kuvvetle serum proteinine bağlanarak enzim fonksiyonunu etkiler ve indirekt olarak etkisini göstermektedir (Watson vd. 1976).
Renner ve Münzner (1980) çalışmalarında Brown ve Wu’nun Chlorpropamide ile muameleli in vitro Çin Hamster V79 hücrelerinde KKD sayısını arttırdığını bulmuşlardır. Çin hamster hücrelerinde ve farede Chlorpropamide ve Tolbutamide’in doza bağlı olarak KKD’lerini indüklediklerini, KA’larını neden olmadığını, sıçan ve Çin Hamster eritrositlerinde MN’ları indüklemediğini ancak farede MN oluşumuna yol açtığını bildirmişlerdir (Renner ve Münzner, 1980). Chlorpropamide ve Tolbutamide nokta mutasyonlarını gösteren Ames testinde mutajenik değildir. In vivo testler içinde KKD testi en hassas olanıdır ve Chlorpropamide ve Tolbutamide pozitif etki göstermiştir (Renner ve Münzner, 1980).
2.5. Triasulfuron
Triasulfuron 1992’de tescil edilerek tarım alanlarında kullanım izni alınmış, buğday, arpa üretiminde geniş yapraklı otların kontrolünde kullanılan bir herbisittir (EPA, 1992).
Triasulfuron akut muamele sonrası bir çok laboratuar hayvanında toksik değildir. Test edilen konsantrasyonlarda ne sıçan ve tavşanlarda teratojenik ne de farede onkogeniktir. Mutajenite testleri de negatif sonuçlar göstermiştir (PMRA, 1995). Triasulfuron düşük akut toksisite gösterir. Triasulfuron’un genotoksisitesini belirlemek amacı ile Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae ve fare lenfoma hücrelerinde nokta mutasyonlarını, Çin Hamsterlerinde MN testi uygulanarak KA’larını, insan fibroblastları ve fare hepatositlerinde düzensiz DNA sentezini indüklemesi açısından testler uygulanmış ve sonuç olarak Triasulfuron’un mutajenik, klastojenik olmadığı ve UDS’ni indüklemediği saptanmıştır (EPA, 1998a).
Triasulfuron bitkiler tarafından biotransformasyona uğrar. Akuatik sistemli sularda kalıcıdır. Besin kaynaklarında akut veya kronik tehlikesi olmadığı, memeli ve kuş üremesi üzerinde riskinin düşük olduğu tahmin edilmektedir. Triasulfuron’un birçok karasal ve akuatik bitkide toksik olduğu tahmin edilmektedir. Su mercimeği ve yeşil alglerde riski çok yüksektir (PMRA, 1995).
2.5.1. Triasulfuron’un bitki metabolizması
Triasulfuron toprağa uygulanan sulfonylurea herbisididir. Buğday, arpa üretiminde ilkbahar ve sonbaharda çıkış öncesi veya çıkış sonrası uygulanan tek yıllık ve iki yıllık geniş yapraklı otların kontrolünde kullanılan bir pestisittir (EPA, 1992). Bitki kök ve sürgün kısımlarından alınır. Kök ve sürgün gibi bitkinin hızlı büyüyen kısımlarına taşınması sonucunda, hücre bölünmesini inhibe eder. Çimlendikten sonra muameleli topraktaki tohumlar toprak yüzeyine çıkamazlar. Triasulfuron’un buğdaydaki
mekanizması Fenil halkasının hidroksilasyonu ve urea köprüsünün hidrolitik ayrılması ile işler. Hidrolitik ayrılmadan sonra oluşan kalıntı esas Triasulfuron’dur ve düzenleyici olarak etki eder. Buğdaydaki metabolik mekanizma yabancı otlarda da aynı şekilde işler, ve otlar için düzenleyici olarak etki eden kalıntı esas bileşiktir (Pesticide Petition Filing, 1998).
3.MATERYAL METOD
Yaptığımız tez çalışmasında materyal olarak insan periferik kanı, test maddesi olarak Triasulfuron kullanılmıştır. Denek olarak sağlıklı, sigara kullanmayan, 26-31 yaşları arasında 3 bayan ve 3 erkek donor seçilmiştir. Bu kimyasal maddenin periferik kan kültüründeki genotoksisitesini tespit etmek amacı ile kromozom aberasyonları (KA), kardeş kromatid değişimi (KKD) ve mikronukleus (MN) test yöntemleri kullanılmıştır. Uygulanan test yöntemleri ile KA, KKD ve MN sayıları saptanmış ve bölünme indekslerini tespit etmek için sırası ile MI, PI ve CBPI oranları belirlenmiştir. Pozitif kontrol olarak mitomisin C (MMC), eritici kontrol olarak ise Triasulfuron’u çözen Dimetil sulfoksit (DMSO) kullanılmıştır.
Periferik kanın Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları (5, 10, 50, 100, 200 µg/ml) ve pozitif kontrol (MMC) ile 24 ve 48 saat muamelesi sonucu elde edilen veriler, eritici kontrol (DMSO) ile muamele sonucu elde edilen veriler ile istatistiksel olarak karşılaştırılmış ve sonuçlar değerlendirilmiştir.
3.1. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddelerin Hazırlanışı
3.1.1. Triasulfuron konsantrasyonlarının seçimi
Çalışmada uygulanacak Triasulfuron konsantrasyonlarının seçimi için ön çalışma yapılmıştır. Uygulanacak konsantrasyonlar MI inhibisyonu (MI)>%50 temeline dayanılarak seçilmiştir (Sivikova ve Dianovski, 2000). 48 saat muamelede % 50 inhibisyona neden olan konsantrasyon 100 µg/ml, % 61 inhibisyona neden olan konsantrasyon 200 µg/ml olarak tespit edilmiştir. % 50 inhibisyona neden olan 100 µg/ml’nin iki katı 200 µg/ml ve yarısı 50 µg/ml çalışmamızda uygulanacak olan diğer
konsantrasyonlar olarak seçilmiştir. Bundan başka, konsantrasyon artışına bağlı olarak anormallik oranını tespit etmek amacı ile uygulanacak olan yüksek konsantrasyonların alt katları olan 5 ve 10 µg/ml çalışmamızda uygulayacağımız düşük konsantrasyonlar olarak seçilmiştir.
Çözücü olarak kullanılan DMSO’in konsantrasyonu toksik olmayan miktarda, daha önce yapılan araştırmalara dayanarak seçilmiştir (Borroto vd 2001, Laffon vd 2001, Borroto vd 2002,). Kültür ortamındaki son konsantrasyonu %1’ i geçmemektedir.
3.1.2. Triasulfuron konsantrasyonları ve kimyasal yapısı
Bu tez çalışmasında; KA, KKD ve MN test yöntemleri ile insan periferik kan hücreleri üzerindeki genotoksisitesi araştırılan Triasulfuron’un, kullanılan konsantrasyonları (5, 10, 50, 100, 200 µg/ml) DMSO’te hazırlanmıştır. Çalışmamızda kullanılan Triasulfuron % 99 saflıktadır (CAS no: 82097-50-5 RIEDEL Kod:33383). Triasulfuron’un kimyasal yapısı aşağıda verilmiştir (PMRA, 1995).
İsim:Triasulfuron Kod No: CGA-131036
Kimyasal İsmi: 1-[ 2-(2-chloroethoxy)phenylsulphonyl]-3-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl)urea
CAS No: 82097-50-5
Moleküler Formülü: C14H16ClN5O5S Molekül ağırlığı: 401.83
Fiziksel formu: Katı kristal Renk: Beyaz-gri
Triasulfuron’un moleküler yapısı
3.1.3. Eritici kontrol konsantrasyonu
Triasulfuron organik çözücülerde çözünen bir kimyasal formülasyona sahiptir. Organik çözücü olarak DMSO kullanılmıştır (Sigma CAS No: 67-68-5) Doku kültüründe DMSO’e bağlı anormallikleri, DMSO’te çözünmüş Triasulfuron’un neden olduğu anormalliklerden ayırmak amacı ile DMSO eritici kontrol olarak seçilmiştir. DMSO’in kültür ortamında fazla miktarda bulunması, bu kimyasala bağlı anormalliklere neden olacağından ortamdaki konsantrasyonu %1’i geçmemektedir (Laffon vd. 2001, Borroto vd. 2001, Borroto vd. 2002).
3.1.4. Pozitif kontrol konsantrasyonu
Laboratuar şartlarımızda periferik kan kültürü metodunun standartlar ölçüsünde uygulandığını göstermek amacı ile daha önceden pozitif etkisi kanıtlanmış, anormallik yapan, genotoksik bir madde kullanılmıştır. Bunun için KA, KKD ve MN testlerinde pozitif sonuçlar veren MMC seçilmiştir (Sigma CAS No:50-07-7). Kan kültürüne MMC muamelesi sonucu anormallik sayısının istatistiksel açıdan anlamlı olması yöntemin
doğru uygulandığını göstermektedir. Yapılan ön çalışmalar sonucunda; KA ve KKD test yöntemi için 0.1 µg/ml MMC, MN test yöntemi için 0.25 µg/ml MMC’nin aberasyonlara neden olduğu tespit edilmiş ve pozitif kontrol olarak bu konsantrasyonlar kullanılmıştır. MMC flakonları (2 mg) 5 ml’lik steril distile su ile sulandırılmıştır. Elde edilen ana stoktan 1 ml alınarak 80 ml’ye distile su ile tamamlanmıştır. Hazırlanan bu solüsyondan KA ve KKD test yönteminleri için kültür ortamındaki son konsantrasyonu 0.1 µg/ml olacak şekilde 0.1 ml, MN test yöntemi için ise son konsantrasyonu 0.25 µg/ml olacak şekilde 0.25 ml alınarak kültür ortamına ilave edilmiştir.
3.1.5. Sörensen Fosfat Tamponunda Giemsa boyasının hazırlanışı
Önce Sörensen fosfat A ve Sörensen fosfat B tampon çözeltileri ayrı ayrı hazırlanmıştır. %10’luk giemsa boyası; 10 ml Giemsa (Merck) boyası, 5’er ml fosfat A ve B tamponu, 80 ml distile su karıştırılarak hazırlanmıştır(pH 6.8). Boya süzülerek kullanılmıştır.
Buffer A: 11.34 gr KH2PO4 + 250 ml su (pH 4.8)
Buffer B: 14.83 gr Na2HPO4.12H2O + 250 ml su (pH 9.3)
3.1.6. 5-Bromo-2- deoksiuridin (BrdUrd) hazırlanışı
KKD test yönteminde kullanılan BrdUrd’in (Sigma CAS No: 59-14-3) kültür ortamındaki konsantrasyonu 10 µg/ml’dir. Bunu hazırlamak için BrdUrd’den 0.0025 gr tartılmış 5 ml steril distile su ilave edilerek mikropor filtrasyon (por çapı 0,2 µm) ile steril edilmiştir. Solüsyon dondurularak saklanmıştır. Kullanılacağı zaman bu solüsyondan 0.1 ml alınarak 5 ml’lik kültür ortamına ilave edilmiştir.
3.1.7. 2 x Standart Saline Citrate (SSC) solüsyonunun hazırlanışı
17.532 gr NaCl ve 8.823 gr Sodyum sitrat alınmış, steril distile su ile 1 lt’ye tamamlanmıştır (pH 6.8).
3.1.8. Hoechst 33258 hazırlanışı
0.0012 gr Hoechst 33258 (Sigma CAS No: 23491-44-3) 12 ml distile su eklenerek hazırlanan stok solüsyon +4 C0’de karanlıkta saklanmıştır. KKD yönteminde kullanılan Hoechst solüsyonu hazırlanırken, 100 ml 2xSSC solüsyonuna stok Hoechst solüsyonundan 0.05 ml ilave edilmiştir.
3.1.9. Cytochalasin B (Cyt-B) hazırlanışı
Cyt-B (Sigma CAS No: 14930-96-2 ) stok solüsyonu 2 mg/ml olacak şekilde DMSO’te eritilerek hazırlanmıştır. Bunun için 10 mg Cyt-B 5 ml DMSO’te eritilmiş, elde edilen solüsyon 1’er ml olacak şekilde 5 tüpe bölünerek tüpler –70 C0’de saklanmıştır. MN test yönteminde kullanılacağı zaman 1’er ml’lik dondurulmuş stoklardan biri alınarak 20 ml’ye steril distile su ile tamamlanmıştır. Cyt-B’nin kültür ortamında son konsantrasyonu 6 µg/ml olacak şekilde seyreltilmiş solüsyondan 0.30 ml alınarak 5 ml’lik kültür ortamına ilave edilmiştir.
3.1.10. Antibiyotiklerin hazırlanışı
Kültür ortamında oluşacak kontaminasyonu önlemek amacı ile Streptomisin ve Penisilin antibiyotikleri kullanılmıştır. 1 gr’lık Streptomisin sulfat (İ.E. Ulagay) flakonuna 5 ml steril distile su ilave edilerek eritilmiş, 0.05 ml’si 100 ml’lik besiyerine eklenmiştir. 500 IU’lik penisilin (Bilim İlaç) flakonuna 5 ml steril distile su ilave edilerek eritilmiş, 0.1 ml’si 100 ml’lik besiyerine eklenmiştir.
3.1.11. Phytohaemagglutinin M (PHG) hazırlanışı
1.2 mg’lık PHG-M (Biochrom) 5 ml steril distile su ilave edilerek eritilmiştir. 5 ml’lik kültür ortamına eritilmiş PHG’ten 0.07 ml eklenerek hücre stimülasyonu sağlanmıştır.
3.1.12. Kolkisin hazırlanışı
0.002 gr kolkisin (Sigma) 100 ml distile suda eritilmiş mikropor filtrasyon ile steril edilerek saklanmıştır. Kültür süresi bitmeden 4 saat önce son konsantrasyonu 0,6 µg/ml olacak şekilde kültüre kolkisin ilave edilmiştir.
3.1.13. Fosfat tamponunda giemsa boyası hazırlanışı
0.34 gr K2PO4 distile suda eritilerek 100 ml’lik solüsyon hazırlanmıştır. pH 6.8 olana kadar %50 NaHO ile titre edilmiştir. %5’lik giemsa boyası 5 ml giemsa ve 95 ml fosfat tamponu karıştırılarak hazırlanmıştır.
3.1.14. Hipotonik solüsyon hazırlanışı
Hipotonik solüsyon taze olarak kullanıldığından preparasyon sırasında 0.279 gr KCl tartılarak 50 ml disitle suda eritilerek 0.075 M KCl hazırlanmıştır. Hazırlanan solüsyon 37 C0’lik etüvde bekletilmiştir.
3.1.15. Kültür ortamının hazırlanışı
79 ml Ham’s F-10
20 ml Fetal Calf Serum (FCS) 0.05 ml streptomisin sulfat 0.1 ml penisilin
1.4 ml PHG
Yukarda verilen maddeler steril şartlarda karıştırılarak, hazırlanan 100 ml’lik besiyeri 25 ml’lik steril şişelere 5’er ml olacak şekilde paylaştırılmıştır. Hazırlanan besiyeri 5 gün içersinde kullanılmıştır. 5 ml’lik kültür ortamına donordan 1/10 oranında heparinli enjektör ile alınan kandan 0.3 ml ilave edilmiştir.
3.2. Kromozom Aberasyonu Sitogenetik Analiz Yöntemi
Kromozom aberasyonu izlemek amacı ile hücre kültürünün yapılması ve preparatların hazırlanması.
3.2.1. Hücre kültürünün yapılması
Triasulfuron’un neden olduğu kromozom aberasyonlarını izlemek amacı ile yapılan periferik kan kültürüne 48 saatlik inkübasyon süresi uygulanmıştır.
Kanın 0,3 ml’si ilave edilerek hazırlanan kültür 37 C0’lik etüvde 48 saat inkübe edilmiştir. 48 saatlik muamelele için etkisi incelenecek kimyasal madde inkübasyon süresinin başlangıcında kültür ortamına eklenmiş, hasat işlemine kadar ortamda kalmıştır. 24 saatlik muamele için etkisi incelenecek kimyasal madde, inkübasyonun 24. saatinde kültür ortamına ilave edilmiş, hasat işlemine kadar ortamda kalmıştır. Bu işlem tüm Triasulfuron konsantrasyonları (5, 10, 50, 100, 200 µg/ml), eritici ve pozitif kontrol için 6 donorda uygulanmıştır.
3.2.2. Preparatların hazırlanması
Kültür ortamına inkübasyon süresi (48 saat) dolmadan 4 saat önce, son konsantrasyonu 0.6 µg/ml olacak şekilde Kolkisin ilave edilerek, metafaz blokajı sağlanmıştır. İnkübasyon süresi sonunda sırası ile aşağıdaki işlemler uygulanmıştır.
1. Kültürler santrifüj tüplerine alınmış 2. 2000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiş
3. Süpernatan dikkatlice alınarak atılıp tüpün dibinde biriken hücreler pipetaj yapılarak dağıtılmış
4. Hücre süspansiyonu üzerine taze hazırlanmış, 37 C0’lik etüvde bekletilmiş 10 ml hipotonik eriyik (0.075 M’lık KCl) damla damla ilave edilmiştir.
5. Tüpler 37 C0’lik etüvde 12 dk bekletilmiştir. 6. 2000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir.
7. Süpernatan atılarak hücre kümesi pipetaj yapılarak dağıtılmıştır
8. Hücre süspansiyonu üzerine taze hazırlanmış +4 C0’de soğutulmuş 10 ml fiksatif (3/1 Metanol:Glacial acetic acid) damla damla karıştırarak ilave edilmiştir
9. Tüpler 20-30 dk +4 C0’de bekletilmiştir. 10. 2000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir
11. Süpernatan atılarak tüpün dibindeki hücre kümesi pipetajla dağıtılmıştır 12. 5 ml fiksatif ilave edilmiştir
13. Santrifüjden sonra süpernatanın atılıp pipetajın yapılması ve hücre kümesi üzerine 5 ml fiksatif ilave edilmesi işlemi iki defa daha tekrarlanmıştır 14. Son süpernatanın atılmasından sonra hücre kümesi üzerine 1 ml fiksatif ilave
edilmiştir
15. Fikse edilmiş materyal yaklaşık 50 cm yükseklikten temizlenmiş soğuk lamlar üzerine damlatılarak kromozom preparatları hazırlanmıştır.
3.2.3. Boyama işlemi
En az bir gece kurutulan preparatlar Sörensen buffer’da hazırlanan %10’luk giemsa ile 5 dk boyanmıştır. Boyadan çıkan preparatlar distile suda çalkalanmıştır. Boyanan preparatlar en az 1 gece kurutulmuş, entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir.
3.3. Kardeş Kromatid Değişimi Sitogenetik Analiz Yöntemi
Bir kromozomun kardeş kromatidlerinin farklı boyanması için FPG (Fluorescence Plus Giemsa) tekniğinin modifiye edilmiş şekli kullanılmıştır (Perry ve Wolff, 1974).
3.3.1. Kardeş kromatid değişiminin saptanması
KKD test yöntemi kimyasal ve fiziksel ajanların sebep olduğu sitogenetik hasarın incelenmesinde kullanılan hassas bir metoddur.
Bu test insanda, genellikle periferik kan lenfositlerine uygulanır. Periferik lenfositler hücre siklusunun G0 dinlenme evresinde oldukları için, fitohemaglutinin gibi mitojen tarafından bölünmeye girmesi için uygulanır. Yeterli sayıda mitotik hücre sayısı elde etmek ve fiksasyondan önce hücreleri (pro)metafazda durdurmak için iğ ipliği inhibitörü eklenir. KKD test yönteminde; kardeş kromatidler arasında meydana gelen değiş tokuşu mikroskopta görebilmemiz için kültür ortamına DNA’ya bağlanan ve farklı boyanma özelliği gösteren BrdUrd (5-bromo-2-deoxyuridine) eklenir. BrdUrd kromozoma yerleşen Timin analoğudur. İki tam hücre siklusu boyunca kültür ortamına BrdUrd eklenir. Böylece replikasyon sırasında, Timin bazı yerine, onun analoğu olan BrdUrd, DNA ipliğine yerleşmiş olur. Kromatidlerde DNA’nın bir ipliğine (polinükleotid zincirine) BrdUrd yerleşmişse mikroskopta Giemsa boyası ile koyu boyalı şekilde görülür. Eğer DNA’nın 2 ipliğine (polinükleotid zincirine) BrdUrd yerleşmişse mikroskopta açık renk görünür. Eğer bisbenzimidazole boyası olan Hoechst 33258 (bu bileşik DNA’da A+T baz çiftlerine bağlanır) kullanılırsa, DNA’nın her iki iplikçiği normal Timin içeriyorsa fluoresan mikroskopunda çok parlak görülür, DNA çift ipliğinin biri Timin diğeri BrdUrd içeriyorsa daha az parlak görülür. Böylece kardeş kromatidler birbirlerinden farklı boyanma özelliği gösterirler. Kardeş kromatid değişiminin olduğu noktada farklı boyanan kromatidler karşılıklı yer değiştireceğinden
