Mikronukleus (MN) test

İnsan lenfosit kültürlerinin Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muamele edilmesi sonucu altı donorda gözlenen total MN sayısı, ‰ BNMN değerleri tablo 4.3.1.’de verilmiştir. Ayrıca tablolarda iki nukleuslu hücrelerde mikronukleus dağılımı, sitotoksisite indeksleri olarak sitokinezi-blok proliferasyon indeksi (CBPI) ve iki nukleuslu hücre frekansı (%BN) da gösterilmiştir. MN test yönteminde mikronukleus taşıyan iki nukleuslu hücrelerin (BNMN) ‰ oranları analiz edilerek genotoksisite değerlendirmesi yapılmıştır. Her bir konsantrasyon ve muamele süresi için 1000 iki nukleuslu hücre sayılarak kontrole göre anlamlılığı test edilmiştir.

Altı donordan elde edilen total verilere göre, MN sayısında 24 ve 48 saat muamele sürelerinin her ikisinde de kontrole göre anlamlı artış görülmektedir (Tablo 4.3.1.). BNMN ‰’sinde ise 24 saatlik muamelede 100 ve 200 µg/ml Triasulfuron, 48 saatlik muamelede 200 µg/ml Triasulfuron konsantrasyonları istatistiksel açıdan kontrole göre anlamlı BNMN oluşumuna yol açmıştır. 48 saatlik muamele grubunda muamele edilen konsantrasyon arttıkça ‰BNMN frekansının da arttığı görülmektedir. 48 saat muameleli gruplarda gözlenen sonuçlara göre, doz-cevap eğrisi şekil 4.3.1.’de gösterilmiştir (U testi U>1.96; Lineer regresyon analizi R2=84.1; Pearson korelasyon testi p=0.01).

MN test yönteminde insan lenfosit kültürüne 24 ve 48 saat süre ile muamele edilen tüm Triasulfuron konsantrasyonlarının CBPI’i düşürdüğü Tablo 4.3.1.’te görülmektedir. Şekil 4.3.2.’de 24 ve 48 saat muamele sonucu altı donordan elde edilen total BNMN ‰’si ve CBPI değerleri grafik üzerinde gösterilmiştir. Konsantrasyon ve süreye bağlı olarak çalışmamızda gözlenen KA ve MN frekansları şekil 4.3.3.’te gösterilmiştir. Lineer regresyon analizi ve Pearson korelasyon testine göre her iki muamele periyodunda MN‰’si ile KA%’si arasında anlamlı pozitif korelasyon saptanmıştır (24 saat için Lineer regresyon analizi R2= 88.8%, Pearson korelasyon p=0.001; 48 saat için Lineer regresyon analizi R2=95.3%, Pearson korelasyon p=0.005).

Çalışmada gözlenen MN’lara ait örnekler şekil 4.3.4, 4.3.5’te gösterilmiştir. MN test sonuçlarına göre; KA test yönteminde elde edilen MI değerlerini %50’den daha yüksek oranlarda inhibe eden toksik konsantrasyon olan 200 µg/ml

Triasulfuron konsantrasyonu, MN test yönteminde BNMN‰ frekansını hem 24 hem de 48 saat muamele süresinde anlamlı arttırdığı için genotoksik etkilidir. Triasulfuron’un tüm konsantrasyonları, bölünme indeksi olan PI değerlerini anlamlı düşürdüğü için test edilen herbisit sitotoksik etkilidir.

Tablo 4.3.1. Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muameleli insan lenfosit kültüründe altı donorda gözlenen toplam MN, BNMN ve CBPI değerleri. MN,toplam mikronukleus sayısı; BNMN, bir veya birden fazla mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre sayısı; BNMN‰±S.H., Ortalama 1000 iki nukleuslu hücrede gözlenen mikronukleus sayısı±Standart Hata; BN%, İki nukleuslu hücre yüzdesi; CBPI, sitokinezi- blok proliferasyon indeksi. *P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001 (BNMN için Fisher’s exact testi ve CBPI için X2 testi yapılmıştır.)

Süre (saat)

Konsant.

(µg/ml) BN hücrelerde MN dağılımı MN>4 MN MNBN ‰±S.H.BNMN Nukleus sayısına görehücrelerin dağılımı BN% CBPI±S.H.

0 1 2 3 4 >4 1 2 3 4 24 10 µl/ml_DMSO 5966 32 1 0 1 0 0 38 34 5,66±0,09 1268 1541 75 116 51,37 1,64±0,048 MMC 5733 240 19 4 1 3 16 310 ***267 ***44,5±7,13 2008 958 16 18 31,93 ***1,34±0,06 5 5919 74 6 1 0 0 0 89 ***81 13,5±2,81 1924 929 55 92 30,97 ***1,41±0,06 10 5923 70 5 1 1 0 0 87 ***77 12,83±2,23 1989 903 32 76 30,1 ***1,37±0,07 50 5920 73 6 1 0 0 0 88 ***80 13,3±3,0 1770 1055 59 116 35,17 ***1,47±0,02 100 5904 85 9 1 0 1 7 113 ***96 *16±4,68 1789 1021 72 118 34,03 ***1,47±0,04 200 5905 88 6 0 0 1 6 106 ***95 *15,8±3,83 2078 832 45 45 27,73 ***1,34±0,05 48 10 µl/ml_DMSO 5946 47 6 1 0 0 0 62 54 9±2,03 1853 1030 52 65 34,33 1,42±0,04 MMC 5237 668 79 11 4 1 6 881 ***763***127,2±13,₆₅ 2349 628 12 11 20,93 ***1,22±0,03 5 5943 51 4 1 1 0 0 66 57 9,5±1,31 1936 996 27 41 33,2 **1,38±0,03 10 5918 74 3 3 0 2 13 102 *82 13,67±2,57 2067 825 30 78 27,5 ***1,35±0,07 50 5904 79 14 1 2 0 0 118 ***96 16±2,5 2053 873 29 45 29,1 ***1,34±0,04 100 5890 97 10 2 0 1 7 130 ***110 18,3±3,2 1992 918 37 53 30,6 **1,37±0,04 200 5871 91 13 22 3 0 0 195 ***129 *21,5±4,41 2233 706 26 35 23,53 ***1,28±0,05

Şekil 4.3.1. Triasulfuron’un artan konsantrasyonları ile 48 saat muamele edilen periferik kan lenfositlerinde gözlenen MN sayısı ile konsantrasyon arasındaki ilişkinin doz-cevap eğrisi. (U testi U>1,96) (Lineer regresyon analizi R2=%84.1; Pearson korelasyon p=0.01). y = 0,0128e0,005x R2 = 0,982 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Konsantrasyon MN/hücre

A

B

Şekil 4.3.2. Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının insan periferik kan lenfosit kültüründe muamelesi sonucu altı donorda gözlenen total BNMN ‰ ve PI değerleri. A; 24 saat muamele sonuçları; B, 48 saat muamele sonuçları.

y = 5 ,2 0 9 5 L n (x ) + 7 ,1 4 7 6 R2 _{= 0 ,8 3 9 1} y = -0 ,1 1 5 1 L n (x ) + 1 ,5 7 6 3 R2 _{= 0 ,5 1 0 7} 4 6 8 10 12 14 16 18 10 µ l/ml D M SO 5 µ g/ml T rias. 10 µ g/ml T rias. 50µg/ml T rias. 100µg/ml T rias. 200µg/ml T rias. BNMN 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 CBPI B N M N ‰ C B P I Log. (B N M N ‰ ) Log. (C B P I) y = 0,10 7x2 _{+ 1 ,8 60 4x + 6 ,5 33} R2 _{= 0 ,9 82 5} y = -0,0 0 02 x2 _{- 0 ,0 19 9 x + 1 ,4 29} R2 _{= 0 ,7 15 6} 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 10 µl/ml D M SO 5 µg/ml T rias. 10 µg/ml T rias. 50µg/ml T rias. 100µg/ml T rias. 200µg/ml T rias. BNMN 1,25 1,27 1,29 1,31 1,33 1,35 1,37 1,39 1,41 1,43 1,45 CBPI BN M N ‰ CBPI

A

B

Şekil 4.3.3. İnsan periferik kan lenfosit kültürüne Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının muamelesi sonucu KA ve MN test yöntemlerinden elde edilen KA ve BNMN frekansları. A; 24 saat, B; 48 saat. 24 saatlik muamelede KA ve MN frekansı arasında ilişki Lineer regresyon analizine göre R2=%88.8, Pearson korelasyon testi p=0.001; 48 saatlik muamelede KA ve MN frekansı arasında ilişki Lineer regresyon analizine göre R2=%95.3 Pearson korelasyon testi p=0.005.

y = 31,276Ln(x) + 42,871 R2 = 0,8393 y = 9,8268Ln(x) + 1,5579 R2 _{= 0,9493} 0 5 10 15 20 25 10 µl/ml DM SO 5 µg/ml Trias. 10 µg/ml Trias. 50µg/ml Trias. 100µg/ml Trias. 200µg/ml Trias. Konsantrasyon KA 0 20 40 60 80 100 120 MN

KA% M N‰ Log. (M N‰) Log. (KA%)

y = 0,6429x2 _{+ 11,157x + 39,2} R2 _{= 0,9825} y = 0,4286x2 _{+ 1,8286x + 4,6} R2 = 0,9483 0 5 10 15 20 25 30 35 10 µl/ml DM SO 5 µg/ml Trias. 10 µg/ml Trias. 50µg/ml Trias. 100µg/ml Trias. 200µg/ml Trias. Konsantrasyon KA 0 20 40 60 80 100 120 140 MN

Şekil 4.3.4. Sitokinezi-blok MN tekniğine göre hazırlanmış preparatlarda birinci bölünme sonucu, 2 nukleuslu hücrede gözlenen 2 mikronukleus oklarla gösterilmiştir. 100 µg/ml Triasulfuron’un 6.donorun lenfosit kültürüne 48 saat muamelesi sonucu gözlenen MN’lar.

Şekil 4.3.5. 200 µg/ml Triasulfuron’un 4.donorun lenfosit kültüründe 24 saat muamelesi sonucu gözlenen mikronukleuslar oklarla gösterilmiştir.

5.TARTIŞMA

Pestisitlerin insanlar üzerindeki zararlı etkilerinin bilinmesi insan sağlığı açısından önemlidir. Bu nedenle çeşitli testler kullanılmaktadır. Kimyasal maddelerin insan kan lenfositlerindeki etkilerini araştırmakta kullanılan KA, KKD ve MN testleri en uygun analiz yöntemleri olarak kabul edilmektedir (Meng ve Zheng, 1992). Çalışmamızda da Sulfonylurea bileşiği olan Triasulfuron herbisitidinin genotoksik etkileri insan periferik kanında KA, KKD ve MN test yöntemleri kullanılarak araştırılmıştır.

Natarajan ve Obe 1980’de, 72 saatlik kültürlerin, hücrelerin iki hücre siklusu geçirmesine izin verdiğini ve birinci siklusta oluşan değişikliklerin ikinci siklusta hücresel onarıma girebileceğini bildirmişlerdir (Seligmann vd. 2003). Tucker ve Preston (1996) indüklenen kromozom aberasyon frekansının doğru tahmin edilmesi için sitogenetik değerlendirmelerin muameleden sonra kısa süre içinde; hücreler muameleden sonraki birinci mitoz bölünmelerini geçirirken yapılması gerektiğini söylemişlerdir. Bu bilgilere göre ikinci hücre siklusunda aberasyonlar onarılabilmekte ve aberasyonlar gerçek frekanslarının altında görülebilmektedir. Çalışmamızda olası in vitro onarım sistemi etkisinden korunmak amacı ile KA test yönteminde 48 saatlik kültür süresi uygulanmıştır.

Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarını insan periferik kan lenfosit kültürü ile muamele ederek genotoksisitesini araştırdığımız bu çalışmada; KA deneyleri total verilerine bakıldığında, Triasulfuron’un test edilen konsantrasyonlarının periferik kan kültüründe 24 ve 48 saat muamelesinin anlamlı KA oluşumuna neden olmadığı gözlenmiştir. Bu sonuçlara göre test edilen konsantrasyonlarda Triasulfuron klastojenik değildir. Nitekim daha önce Triasulfuron’un genotoksisitesini belirlemek amacı ile yapılan çalışmalarda; Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae ve fare lenfoma hücrelerinde nokta mutasyonlarına neden olmadığı, Çin Hamsterlerinde MN testinde, insan fibroblastları ve fare hepatositlerinde UDS testlerinde, Triasulfuron’un mutajenik, klastogenik olmadığı saptanmıştır (EPA, 1998a). Bundan başka Triasulfuron gibi triazinylsulfonylurea grubuna ait bazı herbisitlerin genotoksisite çalışmaları da negatif sonuçlar vermiştir; Tribenuron methyl’in insan lenfosit in vitro periferik kan

lenfosit kültüründe yapısal KA’larını indüklemediği (FAO, 2002), DPX-66037’nin (triazinylsulfonylurea) insan lenfosit kültüründe klastojenik olmadığı (PMRA 1999), Metsulfuron methyl’in in vitro sıçan kemik iliğinde KA’larını indüklemediği (EPA, 1998b), Chlorsulfuron’un in vitro sitogenetik testinde negatif sonuç verdiği (EPA, 2002), Ethametsulfuron’un sıçan kemik iliğinde KA’larına neden olmadığı (EPA, 1997a) bildirilmiştir. Diğer bir urea grubu bileşiği olan sulfosulfuron’un (sulfonylurea- pyrimidinyl sulfonylurea) in vitro insan lenfosit kültüründe KA frekansını arttırmadığı ve klastojenik olmadığı rapor edilmiştir. Elde ettiğimiz sonuçlar diğer araştırmacıların sonuçları ile uygunluk göstermektedir.

Triasulfuron’un ticari formülasyonu olan Logran hebisiti ile yaptığımız çalışmalarda; bu herbisitin fare kemik iliğinde ve insan lenfosit kültüründe kromozom kırıklarına neden olduğunu bildirmiştik (Muranlı ve Kaymak 2004, Göç ve Kaymak 2004). Bu sonuçlar şimdiki çalışmamızdan elde edilen sonuçlarla uygunluk göstermemektedir. Holland vd. (2002) çalışmalarında adjuvanların, ticari pestisitlerin çözünürlüğünü arttırmak ve aktif içeriğini güçlendirmek üzere onlara ilave edilen kimyasallar olduğunu, bu kimyasalların polivinil bileşikler, polioksietilenler, parafin yağları içerdiklerini ve özel olarak belirtilmediğini fakat “katkı maddeleri” kategorisi altında ticari pestisitlerin bu maddeleri içerdiğini belirtmişlerdir. Daha önceki çalışmalarımız ile bu çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçların farklı olmasının nedeni; ticari formlarda aktif içeriği güçlendiren ve çözünebilirliği arttıran katkı maddelerinin bulunuşu olabilir. Scassellati-Sforzolini vd. (1997)’nin urea herbisiti olan Linuron’un saf ve ticari formülasyonlarının in vivo şartlarda genotoksisitesini değerlendirdikleri çalışmalarından elde ettikleri sonuçlar bizim sonuçlarımızı destekler niteliktedir. Bu araştırıcılar, çalışmalarında saf ve ticari formülasyon ile elde ettikleri sonuçlar arasındaki kısmi farkın ticari formülasyondaki zararlı katkı maddelerinden kaynaklanabileceğini, bunun da ticari formülasyonların zararlı maddeleri içerdiğinin göstergesi olduğunu rapor etmişlerdir.

In vitro KA deneylerinde MI indüklenen hücresel toksisiteyi izlemek için kullanılır. MI, hücre siklusunda metafazdaki hücre yüzdesini verir. Azalmış MI, hücre siklusu ilerlemesinde inhibisyonu ve/veya proliferatif kapasitedeki kaybı gösterir. Amorim vd. 2000’de sitotoksisite derecesinin tespit edilmesinin, uygun preparasyon zamanını ve test konsantrasyonlarını seçmek için gerekli olduğunu ve özellikle

sonuçların insanların maruz kalabileceği bileşiklerin risk değerlendirmesi için kullanıldığında önem taşıdığını bildirmişlerdir (Seligmann vd. 2003). Çalışmamızda donorlar total olarak değerlendirildiğinde; 24 ve 48 saat muameleli gruplarda ve tüm konsantrasyonlarda, Triasulfuron MI’i anlamlı olarak düşürmüştür. 48 saatlik uygulama periyodunda MI’i % 50 oranında düşüren toksik konsantrasyon 100 µg/ml iken, 24 saatlik uygulama periodunda 100 µg/ml MI’i %28, 200 µg/ml MI’i %33 oranında düşürmüştür. 24 saatlik uygulama periodunda, MI’i %50 oranında düşüren konsantrasyonun daha yüksek olabileceği düşünülmektedir. Dolayısı ile KA test yönteminde, hücrelerin 48 saat Triasulfuron muamelesine maruz kalmaları bu hücrelerin toksik açıdan daha fazla etkilenmelerine neden olmaktadır. 48 saat muamele sonucu gözlenen toksisite 24 saat muamele sonucu gözlenen toksisiteden fazladır (Şekil 4.1.1.). Triasulfuron hücre siklusu ilerleyişini inhibe ederek toksik etki göstermiştir.

Çalışmamızın sonuçlarına göre Triasulfuron muamelesi sonucu gözlenen toksik etki, muamele süresine bağlı olduğu gibi konsantrasyon artışı ve KA frekansına bağlı olarak da değişim göstermiştir.

Konsantrasyon artışı ile mitotik indeksin azalması yani hücresel toksisite arasında negatif ilişki saptanmıştır. Triasulfuron ile 24 ve 48 saatlik muameleli gruplarda, muamele süresinin artışına bağlı olarak KA frekansının da arttığı fakat muameleli gruplar arasındaki farkın önemli olmadığı görülmüştür. Gözlenen sonuçlara göre; konsantrasyon arttıkça toksisite ve buna bağlı olarak kromozom aberasyonları artmıştır. Bu da daha yüksek konsantrasyonlardaki Triasulfuron muamelesinin insan periferik kan kültüründe KA frekansını anlamlı olarak arttırabileceğini düşündürmektedir.

WHO’nun 1985’teki bildirisine göre; KKD test yöntemi genotoksisite değerlendirmesinde kullanılan hassas bir metottur (Ribas vd. 1996). KKD test yönteminde kardeş kromatid değişimlerini gözleyebilmek için ikinci hücre bölünmesini geçiren metafaz hücrelerini elde etmek gereklidir. Bundan dolayı çalışmamızda KKD test yönteminde 72 saat kültür süresi kullanılmıştır.

KKD, DNA replikasyon ürünlerinin homolog bölgeleri arasında DNA kırılması ve yeniden birleşmesi sonucu parça değişiminin sitolojik göstergesidir. Tucker vd. 1993 yılındaki bildirilerine göre; KKD sıklığı genotoksik etkinin belirtisidir yorumu ya KKD sayısının kontrole göre iki katına çıkması veya herhangi bir dozda istatistiksel anlamda

artış olması (p<0.05) temeline dayanmaktadır (Rodriguez-Mercado vd. 2003). KKD genellikle kimyasal etkilenmeye sitogenetik cevabın değerlendirilmesi amacıyla kullanılır ve sitogenetik tartışma KKD değerlendirilmesi yapılmadan eksik kalır (Rodriguez-Mercado vd. 2003, Tucker ve Preston 1996).

Bizim çalışmamızda in vitro muameleli insan lenfosit kültüründe Triasulfuron’un test edilen tüm konsantrasyonları 24 ve 48 saatlik muamele süresinde ortalama KKD/hücre sayısında kontrole göre anlamlı artışa neden olduğundan dolayı bu herbisidin insan lenfositleri için muhtemel genotoksik olduğu saptanmıştır. Triasulfuron muamelesi sonucu KKD frekansının artması, diğer urea grubu herbisitler ile elde edilen sonuçlarla uygunluk göstermektedir. Piridisulfonylurea herbisiti olan DPX E9636’nın in vitro sığır lenfosit kültüründe (Lioi vd. 1998a) ve insan lenfositlerinde (Lioi vd. 1998b) KKD sayısını arttırdığı ve genotoksik olduğu bildirilmiştir. Urea grubu herbisitlerinin genotoksisitesi Allium cepa test sistemi kullanılarak da tespit edilmiştir. Badr ve Elkington (1982) Isoproturon’un Allium cepa ve Hordeum vulgare’de iğ ipliği aparatında bozulmaya sebep olduğunu, bitki test sisteminde klastojenik olduğunu, Chauhan vd. (2001) Isoproturon’un faklı konsantrasyonlarının Alium cepa kök meristem hücrelerinde mitotik aberasyonlara neden olduğundan dolayı genotoksik etkili olduğunu bildirmişlerdir.

İlk kez Nicholas vd. (1979) diğer test sistemlerinde mutajenik olmayan bir kimyasalın KKD’leri indüklediğini saptamışlardır. Bu farkın sebeplerinden birisi; KKD’lerin düşük konsantrasyonlardaki kimyasal muameleler ile de indüklenebildiğidir. KA ve MN’lar daha yüksek konsantrasyonlardaki muameleler sonucu meydana geldiklerinden bu test yöntemlerine göre değerlendirilen bir kimyasal madde mutajenik olarak görülmezken, aynı kimyasal madde KKD test yöntemine göre mutajenik olabilir (Nicholas vd. 1979). Çalışmalarında toksik olmayan veya letal olmayan konsantrasyonların KKD’leri indüklediğini, kromozom kırıkları veya diğer genetik etkileri gözlemek için gereken konsantrasyonların letal olabileceğini bildirmişlerdir (Nicholas vd. 1979). Bizim çalışmamızda test edilen konsantrasyonlar KKD oluşumuna neden olmuş ancak aynı konsantrasyonlar KA’larına neden olmamıştır. Sonuçlarımıza göre konsantrasyon artışına bağlı olarak KA sayısı artma eğilimindedir. Bu sonuçlar da çalışmamızda kullandıklarımızdan daha yüksek konsantrasyonların KA testine göre insan lenfositlerinde genotoksik etkili olabileceğini düşündürmektedir. Bu sonucumuz

Nicholas (1979)’ın ileri sürdüğü görüşü destekler niteliktedir. Cid ve Matos (1984) insektisid olan Aldicarb’ın insan lenfosit kültüründe anlamlı KKD oluşumunu indükleyerek genotoksik olduğunu bildirmişlerdir. Ancak Blevins vd. 1977’de yaptıkları araştırmalarına göre; bu kimyasal insan fibroblastlarında DNA hasarı oluşturmamakta, Seiler’ın 1977’de elde ettiği sonuçlara göre; farede MN oluşumuna neden olmamakta, Dunken ve Simmon’un 1980’de yaptıkları çalışmaya göre; Ames testinde bu kimyasal ile negatif sonuçlar elde edilmektedir (Cid ve Matos, 1984). Bu sonuçlar aynı kimyasal maddenin farklı test yöntemleri ile farklı sonuçlar verdiğinin göstergesidir. Bu da bizim çalışmamızı doğrular niteliktedir.

Latt vd.’nin 1980’de yaptıkları araştırmaya göre; normal DNA onarım şeklinin göstergesi olan kardeş kromatid değişim yöntemi, birçok fiziksel ve kimyasal maddenin potansiyel DNA hasarının indirekt olarak değerlendirilmesini sağlamak için kullanılmaktadır (Schwartz vd. 1990). Wolff 1978’de, Lin ve Wertelecki 1982’de, Hedner vd. 1982’de KKD’lerinin kromozom kırılmasından bağımsız bir mekanizma sonucu oluştuğunu bildirmişlerdir (Schwartz vd. 1990). Perry ve Evans 1975’te, Popescu vd. 1977’de, Fornace vd. 1981’de, Latt ve Schreck 1980’de, Natarajan vd. 1980’de, Evans ve Vijayalaxmi 1981’de yaptıkları çalışmaların sonuçlarına göre; KKD’leri spesifik lokus mutasyonları ile klastojenik etkilere göre daha fazla ilişkilidirler ve fiziksel ajanlara göre kimyasal ajanlar tarafından daha fazla indüklenmektedirler (Schwartz vd. 1990). Çalışmamızda KKD indüksiyonu görülmesine rağmen, test edilen kimyasalın KA’larına neden olmaması KKD’lerin kromozom kırıkları nedenli olmayıp farklı bir mekanizma ile oluştuğunu göstermektedir. Gri vd. (2003), test edilen kimyasalın indüklediği KKD frekansının doz cevap ilişkisinin olmaması ve KA oluşumu ile doz cevap ilişkisinin bulunmasının bunların farklı mekanizmalar tarafından oluşabileceğinin göstergesi olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Bizim çalışmamızda da KKD test yönteminde doz-cevap ilişkisi tespit edilmemesine rağmen, KA test yönteminde 48 saatlik muamele grubunda doz cevap ilişkisi bulunmuş; anormal hücre yüzdesi ile konsantrasyon arasında ilişki tespit edilmiştir (Lineer regresyon analizine göre R2_{= %88.2, Pearson korelasyon p=0.005).} Aynı zamanda çalışmamız sonuçlarına göre MN testinde MN sayısı konsantrasyon arttıkça anlamlı artış gösterirken KKD sayısında doz-cevap ilişkisi görülmemektedir.

Bu da klastojenik ve aneujenik nedenli MN oluşumu ile KKD’lerin oluşumunun farklı mekanizmalar tarafından meydana geldiğinin göstergesi olabilir.

Tucker vd. (1993) ökaryotik hücrelerde KKD frekansının, DNA replikasyonu ile etkileşime girerek DNA hasarını indükleyen genotoksik ajanların etkisi ile arttığını bildirmişlerdir. Yager vd. 1993’te, Giri ve Cahtterjee 1998’de, Shaham vd. 2001’de, Giri vd. 2002’de KKD frekansını genotoksik ajanları tanımlamak üzere kullandıklarını bildirmişlerdir (Giri vd. 2003). Çalışmamızda test ettiğimiz farklı konsantrasyonlardaki Triasulfuron herbisiti tarafından indüklenen KKD frekansındaki anlamlı artış, bu kimyasalın hücresel DNA replikasyonu ile etkileşime girdiğini ve DNA hasarına yol açtığını göstermektedir.

MN test yönteminde bir kez bölünmüş olan iki nukleuslu hücreler değerlendirmeye alınmıştır. Ancak bu yöntemde, hücre kültürünün 48. saatinde hücreler bir kez bölünmüş olmalarına rağmen, hem daha fazla iki nukleuslu hücre elde elde etmek hem CBPI oranını saptamak için 68 saatlik kültür süresi uygulanmıştır. Bazı hücreler sonradan uyarılarak mitoza girdiğinden dolayı 68.saate kadar ortamda sadece bir kez bölünmüş olan hücre sayısı artacaktır.

Çalışmamızda MN verileri incelendiğinde total BNMN‰’sinde 24 saatlik uygulamada 100 ve 200 µg/ml, 48 saat muamelede 200 µg/ml Triasulfuron ile anlamlı MN indüksiyonu gözlenmiştir. Benzer olarak phenylurea herbisiti olan Isoproturon da memeli in vivo MN test sisteminde yüksek dozlarda anlamlı MN oluşumuna neden olmuştur (Behera ve Bhunya, 1990). Seiler 1978’de fluometuron’un, Sharma vd. 1985’te siduron’un, Garret vd. 1986’da monuron’un fare kemik iliğinde MN oluşumuna neden olduğunu bildirmişlerdir (Behera ve Bhunya, 1990). Aynı şekilde Agrawal vd. (1996) Diuron’un fare kemik iliğinde MN oluşturduğunu saptamışlardır. Buna karşın Triasulfuron’un Çin hamsterlerinde Tribenuron methyl ve ethametsulfuron’un in vivo fare kemik iliği MN testinde negatif sonuç verdiği bildirilmiştir.

Çalışmamızda 48 saat muamele grubunda KA testinde KA frekansı ile konsantrasyonlar arasında, MN testinde MN frekansı ile konsantrasyonlar arasında anlamlı ilişki tespit edilmiştir. Aynı zamanda KA frekansı ile MN frekansı arasındaki ilişkinin 24 saat muameleli grupta (Pearson correlation p=0.001) ve 48 saat muameleli grupta (Pearson correlation p=0.005) anlamlı olduğu tespit edilmiştir. Dolayısı ile

Fenech ve Morley (1985)’in bölünmeyen hücreler ile bir veya birden fazla bölünen hücreleri birbirinden ayırmak ve sitokinezi durdurmak üzere Cyt-B kullanarak geliştirdikleri MN testi, klastojeniteyi belirlemek için hassas bir yöntem olarak kabul edilmektedir.

Çalışmamızda kullanılan dozlarda total verilerde Triasulfuron anlamlı KA oluşumuna neden olmadığı halde yüksek konsantrasyonlarda anlamlı MN oluşumuna neden olmuştur. MN oluşumu klastojenik veya aneujenik nedenli olabilmektedir. KA testinde kullanılan konsantrasyonlarda klastojenik etki görülmemiş olması ancak yüksek dozlarda MN oluşumun gözlenmesi Triasulfuron’un yüksek dozlarda aneugenik olabileceğini düşündürmektedir. Dolayısı ile FISH tekniği ile daha ileri çalışma yapılarak Triasulfuron’un klastojenik ve/veya aneujenik etkisi araştırılabilir.

Çalışmamızda Triasulfuron ile elde edilen sonuçlar Linuron (phenylurea) ile elde edilen sonuçlara uygunluk göstermektedir. Her ikisi de akut memeli toksisiste çalışmalarında düşük aktivite gösteren herbisitlerdir. EPA’nın 1988 yılındaki bildirisine göre; Linuron CHO hücrelerinde, Salmonella typhimurium’da UDS ve in vivo sıçan kemik iliği gibi birçok in vitro ve in vivo yöntemde genotoksisite göstermemektedir (Papapaulou vd. 2001). Linuron, fare kemik iliği hücrelerinde çok az sayıda kromozom hasarına neden olmuştur (Roloff vd. 1992). Triasulfuron, Linuron ve diğer sulfonylurealar gibi negatif sonuçlar vermiştir. Triasulfuron ile S. typhimurium, S. cerevisiae ve fare lenfoma hücrelerinde nokta mutasyonları testinde, Çin hamsterlerinde MN testinde, insan fibroblast ve fare hepatositlerinde UDS testlerinde negatif sonuçlar elde edilmiştir. Ancak Papapaulou vd. (2001) Linuron’un insan lenfosit kültüründe MN frekansını doza bağlı şekilde lineer olarak arttırdığını ve CBPI’i düşürerek doza bağlı sitotoksik etkili olduğunu bildirmiştir. Çalışmamızın verilerine göre de Triasulfuron, insan lenfosit kültüründe MN frekansını doza bağlı arttırmıştır (U testi U>1.96) ve CBPI’ı düşürerek sitotoksik etki göstermiştir.

Fenech’in 1997’deki bildirisine göre; KKD ve MN testlerinde elde edilen PI ve CBPI ortalama değerleri hücre siklusu kinetiğinin ölçülmesini sağlamakta ve bu ölçümler belli kimyasal veya fiziksel ajanların sitotoksik etkileri hakkında önemli verileri yansıtmaktadır (Laffon vd. 2001). İndekslerdeki anlamlı azalma, yeni bir DNA replikasyon prosesi başlamadan önce indüklenen genotoksik hasarı onarmak üzere onarım sistemlerine izin veren hücre siklusu gecikmesini göstermektedir (Laffon vd.

2001). Hücre bölünme kinetiğini ifade eden bir parametre olan PI, test edilen bileşiğin sitotoksisitesini analiz etmek üzere kullanılır. Çünkü test edilen kimyasal maddenin hücre siklusu ile etkileşime geçmesi bu indeksi hızlandırır veya geciktirir (Sivikova ve Dianovsky, 2000). Çalışmamızda test edilen kimyasal in vitro insan lenfosit kültüründe MN testinde 24 ve 48 saat muameleli gruplarda tüm konsantrasyonlarda CBPI değerlerini, KKD testinde 24 saat muameleli grupta 5, 100, 200 µg/ml, 48 saat muameleli grupta 10, 50, 100 ve 200 µg/ml konsantrasyonlarda PI değerlerini anlamlı azaltarak sitotoksik etki göstermiştir. Guadano vd. (1998)’ne göre; MI ve PI