3.MATERYAL METOD
3.1. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddelerin Hazırlanışı
3.1.1. Triasulfuron konsantrasyonlarının seçimi
Çalışmada uygulanacak Triasulfuron konsantrasyonlarının seçimi için ön çalışma yapılmıştır. Uygulanacak konsantrasyonlar MI inhibisyonu (MI)>%50 temeline dayanılarak seçilmiştir (Sivikova ve Dianovski, 2000). 48 saat muamelede % 50 inhibisyona neden olan konsantrasyon 100 µg/ml, % 61 inhibisyona neden olan konsantrasyon 200 µg/ml olarak tespit edilmiştir. % 50 inhibisyona neden olan 100 µg/ml’nin iki katı 200 µg/ml ve yarısı 50 µg/ml çalışmamızda uygulanacak olan diğer
konsantrasyonlar olarak seçilmiştir. Bundan başka, konsantrasyon artışına bağlı olarak anormallik oranını tespit etmek amacı ile uygulanacak olan yüksek konsantrasyonların alt katları olan 5 ve 10 µg/ml çalışmamızda uygulayacağımız düşük konsantrasyonlar olarak seçilmiştir.
Çözücü olarak kullanılan DMSO’in konsantrasyonu toksik olmayan miktarda, daha önce yapılan araştırmalara dayanarak seçilmiştir (Borroto vd 2001, Laffon vd 2001, Borroto vd 2002,). Kültür ortamındaki son konsantrasyonu %1’ i geçmemektedir.
3.1.2. Triasulfuron konsantrasyonları ve kimyasal yapısı
Bu tez çalışmasında; KA, KKD ve MN test yöntemleri ile insan periferik kan hücreleri üzerindeki genotoksisitesi araştırılan Triasulfuron’un, kullanılan konsantrasyonları (5, 10, 50, 100, 200 µg/ml) DMSO’te hazırlanmıştır. Çalışmamızda kullanılan Triasulfuron % 99 saflıktadır (CAS no: 82097-50-5 RIEDEL Kod:33383). Triasulfuron’un kimyasal yapısı aşağıda verilmiştir (PMRA, 1995).
İsim:Triasulfuron Kod No: CGA-131036
Kimyasal İsmi: 1-[ 2-(2-chloroethoxy)phenylsulphonyl]-3-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5- triazin-2-yl)urea
CAS No: 82097-50-5
Moleküler Formülü: C14H16ClN5O5S Molekül ağırlığı: 401.83
Fiziksel formu: Katı kristal Renk: Beyaz-gri
Triasulfuron’un moleküler yapısı
3.1.3. Eritici kontrol konsantrasyonu
Triasulfuron organik çözücülerde çözünen bir kimyasal formülasyona sahiptir. Organik çözücü olarak DMSO kullanılmıştır (Sigma CAS No: 67-68-5) Doku kültüründe DMSO’e bağlı anormallikleri, DMSO’te çözünmüş Triasulfuron’un neden olduğu anormalliklerden ayırmak amacı ile DMSO eritici kontrol olarak seçilmiştir. DMSO’in kültür ortamında fazla miktarda bulunması, bu kimyasala bağlı anormalliklere neden olacağından ortamdaki konsantrasyonu %1’i geçmemektedir (Laffon vd. 2001, Borroto vd. 2001, Borroto vd. 2002).
3.1.4. Pozitif kontrol konsantrasyonu
Laboratuar şartlarımızda periferik kan kültürü metodunun standartlar ölçüsünde uygulandığını göstermek amacı ile daha önceden pozitif etkisi kanıtlanmış, anormallik yapan, genotoksik bir madde kullanılmıştır. Bunun için KA, KKD ve MN testlerinde pozitif sonuçlar veren MMC seçilmiştir (Sigma CAS No:50-07-7). Kan kültürüne MMC muamelesi sonucu anormallik sayısının istatistiksel açıdan anlamlı olması yöntemin
doğru uygulandığını göstermektedir. Yapılan ön çalışmalar sonucunda; KA ve KKD test yöntemi için 0.1 µg/ml MMC, MN test yöntemi için 0.25 µg/ml MMC’nin aberasyonlara neden olduğu tespit edilmiş ve pozitif kontrol olarak bu konsantrasyonlar kullanılmıştır. MMC flakonları (2 mg) 5 ml’lik steril distile su ile sulandırılmıştır. Elde edilen ana stoktan 1 ml alınarak 80 ml’ye distile su ile tamamlanmıştır. Hazırlanan bu solüsyondan KA ve KKD test yönteminleri için kültür ortamındaki son konsantrasyonu 0.1 µg/ml olacak şekilde 0.1 ml, MN test yöntemi için ise son konsantrasyonu 0.25 µg/ml olacak şekilde 0.25 ml alınarak kültür ortamına ilave edilmiştir.
3.1.5. Sörensen Fosfat Tamponunda Giemsa boyasının hazırlanışı
Önce Sörensen fosfat A ve Sörensen fosfat B tampon çözeltileri ayrı ayrı hazırlanmıştır. %10’luk giemsa boyası; 10 ml Giemsa (Merck) boyası, 5’er ml fosfat A ve B tamponu, 80 ml distile su karıştırılarak hazırlanmıştır(pH 6.8). Boya süzülerek kullanılmıştır.
Buffer A: 11.34 gr KH2PO4 + 250 ml su (pH 4.8)
Buffer B: 14.83 gr Na2HPO4.12H2O + 250 ml su (pH 9.3)
3.1.6. 5-Bromo-2- deoksiuridin (BrdUrd) hazırlanışı
KKD test yönteminde kullanılan BrdUrd’in (Sigma CAS No: 59-14-3) kültür ortamındaki konsantrasyonu 10 µg/ml’dir. Bunu hazırlamak için BrdUrd’den 0.0025 gr tartılmış 5 ml steril distile su ilave edilerek mikropor filtrasyon (por çapı 0,2 µm) ile steril edilmiştir. Solüsyon dondurularak saklanmıştır. Kullanılacağı zaman bu solüsyondan 0.1 ml alınarak 5 ml’lik kültür ortamına ilave edilmiştir.
3.1.7. 2 x Standart Saline Citrate (SSC) solüsyonunun hazırlanışı
17.532 gr NaCl ve 8.823 gr Sodyum sitrat alınmış, steril distile su ile 1 lt’ye tamamlanmıştır (pH 6.8).
3.1.8. Hoechst 33258 hazırlanışı
0.0012 gr Hoechst 33258 (Sigma CAS No: 23491-44-3) 12 ml distile su eklenerek hazırlanan stok solüsyon +4 C0’de karanlıkta saklanmıştır. KKD yönteminde kullanılan Hoechst solüsyonu hazırlanırken, 100 ml 2xSSC solüsyonuna stok Hoechst solüsyonundan 0.05 ml ilave edilmiştir.
3.1.9. Cytochalasin B (Cyt-B) hazırlanışı
Cyt-B (Sigma CAS No: 14930-96-2 ) stok solüsyonu 2 mg/ml olacak şekilde DMSO’te eritilerek hazırlanmıştır. Bunun için 10 mg Cyt-B 5 ml DMSO’te eritilmiş, elde edilen solüsyon 1’er ml olacak şekilde 5 tüpe bölünerek tüpler –70 C0’de saklanmıştır. MN test yönteminde kullanılacağı zaman 1’er ml’lik dondurulmuş stoklardan biri alınarak 20 ml’ye steril distile su ile tamamlanmıştır. Cyt-B’nin kültür ortamında son konsantrasyonu 6 µg/ml olacak şekilde seyreltilmiş solüsyondan 0.30 ml alınarak 5 ml’lik kültür ortamına ilave edilmiştir.
3.1.10. Antibiyotiklerin hazırlanışı
Kültür ortamında oluşacak kontaminasyonu önlemek amacı ile Streptomisin ve Penisilin antibiyotikleri kullanılmıştır. 1 gr’lık Streptomisin sulfat (İ.E. Ulagay) flakonuna 5 ml steril distile su ilave edilerek eritilmiş, 0.05 ml’si 100 ml’lik besiyerine eklenmiştir. 500 IU’lik penisilin (Bilim İlaç) flakonuna 5 ml steril distile su ilave edilerek eritilmiş, 0.1 ml’si 100 ml’lik besiyerine eklenmiştir.
3.1.11. Phytohaemagglutinin M (PHG) hazırlanışı
1.2 mg’lık PHG-M (Biochrom) 5 ml steril distile su ilave edilerek eritilmiştir. 5 ml’lik kültür ortamına eritilmiş PHG’ten 0.07 ml eklenerek hücre stimülasyonu sağlanmıştır.
3.1.12. Kolkisin hazırlanışı
0.002 gr kolkisin (Sigma) 100 ml distile suda eritilmiş mikropor filtrasyon ile steril edilerek saklanmıştır. Kültür süresi bitmeden 4 saat önce son konsantrasyonu 0,6 µg/ml olacak şekilde kültüre kolkisin ilave edilmiştir.
3.1.13. Fosfat tamponunda giemsa boyası hazırlanışı
0.34 gr K2PO4 distile suda eritilerek 100 ml’lik solüsyon hazırlanmıştır. pH 6.8 olana kadar %50 NaHO ile titre edilmiştir. %5’lik giemsa boyası 5 ml giemsa ve 95 ml fosfat tamponu karıştırılarak hazırlanmıştır.
3.1.14. Hipotonik solüsyon hazırlanışı
Hipotonik solüsyon taze olarak kullanıldığından preparasyon sırasında 0.279 gr KCl tartılarak 50 ml disitle suda eritilerek 0.075 M KCl hazırlanmıştır. Hazırlanan solüsyon 37 C0’lik etüvde bekletilmiştir.
3.1.15. Kültür ortamının hazırlanışı
79 ml Ham’s F-10
20 ml Fetal Calf Serum (FCS) 0.05 ml streptomisin sulfat 0.1 ml penisilin
1.4 ml PHG
Yukarda verilen maddeler steril şartlarda karıştırılarak, hazırlanan 100 ml’lik besiyeri 25 ml’lik steril şişelere 5’er ml olacak şekilde paylaştırılmıştır. Hazırlanan besiyeri 5 gün içersinde kullanılmıştır. 5 ml’lik kültür ortamına donordan 1/10 oranında heparinli enjektör ile alınan kandan 0.3 ml ilave edilmiştir.