MORFİN İÇERİĞİ İNDÜKLENMİŞ
HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.) BİTKİSİNDE GENOM DÜZEYİNDE TRANSKRİPTOM ANALİZİ
Tuğba GÜRKÖK Doktora Tezi Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman :Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ
İkinci danışman :Doç. Dr. Turgay ÜNVER
2013
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
DOKTORA TEZİ
MORFİN İÇERİĞİ İNDÜKLENMİŞ
HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.) BİTKİSİNDE GENOM DÜZEYİNDE TRANSKRİPTOM ANALİZİ
Tuğba GÜRKÖK
TOKAT 2013
TEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
i
ÖZET
Doktora Tezi
MORFİN İÇERİĞİ İNDÜKLENMİŞ HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.)BİTKİSİNDE GENOM DÜZEYİNDE TRANSKRİPTOM ANALİZİ
Tuğba GÜRKÖK Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman : Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ İkinci danışman : Doç. Dr. Turgay ÜNVER
Farmasötik özelliklere sahip morfin, kodein gibi benzilizokinolin alkaloitlerini (BIA) üretebilen haşhaş, (Papaver somniferum L.) ekonomik ve tıbbi öneme sahip bir bitkidir. Mikroarray analizleri, bir doku veya canlıdaki belirli bir zamanda dışarıdan gelen uyarılara karşı sentezlenen mRNA’ların tümünü oluşturan transkriptomun belirlenmesine olanak sağlayan bir teknolojidir. Bu tez çalışmasında, haşhaş bitkisi Ofis 95’e fungal bir elisitör olan metil jasmonat (MeJa) uygulanması yapılarak 0, 3, 6 ve 12. saatlerde bitkilerin kapsül, yaprak, gövde ve kökleri hasat edilmiştir. Kontrol ve MeJa uygulaması yapılmış bitkilerin kapsül dokusundan morfin, kodein, tebain, noskapin, laudanozin ve papaverin alkaloitlerinin miktarları analiz edilmiştir. Metabolit profillerinde tebain dışındaki tüm alkaloitler 0. saatte en yüksek seviyesine ulaşmıştır. Morfin ve noskapin miktarlarının tüm zaman dilimlerinde diğer alkaloitlere göre daha yüksek olduğu belirlenirken eser miktarda papaverine rastlanmıştır. Transkriotomik seviyede değişiklikleri belirlemek amacıyla ise Papaver somniferum bitkisine ait 23 902 transkripte karşılık gen 95 608 prob kullanılarak kontrol, 0, 3 ve 12. saatlere ait 12K mikroarray analizleri yapılmıştır. Mikroarray analizleri sonucuna göre oluşturulan 6 farklı zaman diliminde, 12–0 saatleri arasında ifadesi değişen transkript sayısı en fazla iken 0. saat–kontrol arasında en az olarak belirlenmiştir. Kontroller kendi aralarında karşılaştırıldığında 14 transkriptin ortak olduğu ve tümünün ifade seviyesinin düştüğü gözlenmiştir. Gen ontoloji analizleri sonucunda; uyarılara cevap, stres cevabı, iyon bağlayıcı, oksidoredüktaz ve transferaz aktiviteleri ile ilişkili transkriptlerin daha fazla sayıda olduğu belirlenmiştir. BIA biyosentez yolunda; NCS, CNMT, SalR, OMT, COR,
CAS, CheSyn, StySyn enzimlerine ait transkriptlerde ifade değişimleri belirlenmiştir.
2013, 340 sayfa
Anahtar Kelimeler: Benzilizokinolin alkaloit biyosentezi, Haşhaş, Mikroarray,
ii
ABSTRACT
Ph.D. Thesis
GENOME WIDE TRANSCRIPTOME ANALYSIS IN MORPHINE CONTENT INDUCED OPIUM POPPY (Papaver somniferum L.)
Tuğba GÜRKÖK Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Deparment of Biology
Supervisor : Assoc. Prof. Dr. İskender PARMAKSIZ Co-supervisor : Assoc. Prof. Dr. Turgay ÜNVER
Opium poppy (Papaver somniferum L.) is a medically and economically important plant since it produces BIA alkaloids. Microarray analysis is a technology that allows the detection of the whole mRNA sytnhesized after external stimuli in a given tissue or organism and in a given time. In this study, Ofis 95 variety is treated with fungal elicitor methyl jasmonate (MeJa) and capsule, leaf, stem and roots were harvested after 0, 3, 6 and 12 hours from treated and control plants. The amounts of morphine, codeine, thebaine, noscapine, laudanosine and papaverine alkaloids in capsule of control and treated plants were analyzed. In metabolite profiles, all the alkaloids except thebaine reached highest levels in 0. hour. While the morphine and noscapine levels were more abundant in all time points, papaverin was rarely found. To compare large-scale mRNA expression patterns in opium poppy, spesific 95 608 probes corresponding to 23 902 transcripts were designed and 2K microarray analysis performed for 0, 3 and 12. hours. According to six different time periods that were obtained as a result of microarray, the number of altered transcripts was the most between 12–0 hours while the least was between 0 hour-control. Controls shared 14 common negatively regulated transcripts. As a result of gene ontology analysis, it was detected that response to stimulus and stress, ion-binding, oxidoreductase and transferase related transcripts were most abundant. In BIA biosynthesis pathway, the altered transcripts corresponding to NCS,
CNMT, SalR, OMT, COR, CAS, CheSyn, StySyn enzymes were significant according to
microarray data.
2013, 340 pages
Keywords: Benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis, Opium poppy, Microarray,
iii
ÖNSÖZ
Çalışmalarımda beni değerli bilimsel katkılarıyla yönlendiren ve destekleyen, çalışmaktan gurur duyduğum danışman hocam Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ’a ve ikinci danışman hocam Doç. Dr. Turgay ÜNVER’e, tez izleme komitesinde bulunan ve kıymetli fikirleri ile yönlendiren Prof. Dr Lokman ÖZTÜRK ve Prof. Dr. Serkan URANBEY’e, çalışmalarım süresince bilgisini ve desteğini esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Mine TÜRKTAŞ’a, tohumların temininde yardımcı olan Prof. Dr. Neşet ARSLAN ve TMO’ya, manevi desteklerinden dolayı Doç. Dr. Bilge Hilal ÇADIRCI, Doç. Dr. İbrahim TÜRKEKUL ve Yrd. Doç. Dr. Sezer OKAY’a, bitkilerin yetiştirilmesinde büyük yardımı olan Filiz KARADAĞ, Mehmet Kürşat GÜZEL ve Nurbanu ELMACI’ya, laboratuar çalışmalarımda her zaman yanımda olan Ünver Lab ekibi Esma ÖZHÜNER, Behçet İNAL, Mortaza HAJYZADEH, Yağız ALAGÖZ ve Yusuf PEKMEZCİ’ye, zor zamanlarımda yanımda olan Gülşen BOZTEPE, İsmail BENLİ, Mesut KOYUNCU ve Elif KAYMAK’a, Amasya Macit Zeren Fen Lisesi ailesine ve son olarak desteklerini benden hiç esirgemeyen aileme çok teşekkür ederim.
Bu tez çalışması 2012/47 proje numarasıyla Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Kalkınma Bakanlığı DPT2010K120720 kodlu desteği ile TUBITAK 109-o-661 nolu ve 111-o-036 nolu proje desteklerinden yararlanılmıştır.
Tuğba GÜRKÖK Ekim 2013
iv İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET i ABSTRACT ii ÖNSÖZ iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ ix ÇİZEGELER DİZİNİ xii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3
2.1. Haşhaş (Papaver somniferum L.) Bitkisinin Genel Özellikleri 3 2.2. Bitkilerde Patojenlere karşı savunma sistemleri 4
2.2.1. Genel (Temel) Dirençlilik 5
2.2.2. Özel (Spesifik) Dirençlilik 6
2.2.3. Bitki Savunma Sisteminde Yer Alan Hormonlar 9
2.2.4. Streste Yer Alan Epigenetik Mekanizmalar 16
2.2.5. Streste Yer Alan Hücresel Yapılar 16
2.2.6. Protein Katlanması 18
2.2.7. Enerji Metabolizması 18
2.3. Sekonder Metabolitler 19
2.3.1. Alkaloitler 20
2.3.2. Benzilizokinolin (BIA) Alkaloitleri 23
2.3.3. Benzilizokinolin Alkaloitlerinin Biyosentezi 24
2.4. Haşhaşta alkaloitlerin taşınımı 36
2.5. Transkriptom ve analiz yöntemleri 40
2.5.1. EST Dizileme 41
2.5.2. SAGE 41
2.5.3. Mikroarray 41
2.5.4. RNA dizileme 42
2.6. Haşhaş bitkisi ile yapılmış genomik ve metabolomik çalışmalar 43 47
v
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi 47
3.2. Metil jasmonat uygulaması 48
3.3. Metabolit ekstraksiyonu ve ToF HPLC MS analizi 48
3.4. Total RNA izolasyonu ve değerlendirilmesi 49
3.4.1. RNA İzolasyon Protokolü 49
3.4.2. İzole Edilen RNA’ların Karakterizasyonu 50
3.5. Mikroarray uygulamaları 50 3.5.1. cDNA Sentezi 51 3.5.2. Örneklerin Etiketlenmesi 52 3.5.3. Hibridizasyon 53 3.5.4. Yıkama 54 3.5.5. Kurutma 54 3.5.6. Görüntüleme ve Analiz 54
3.6. Real Time (Eş zamanlı) qRT-PCR Uygulamaları 55
3.6.1. RNA Temizleme İşlemi 55
3.6.2. cDNA Sentezi 56
3.6.3. 18S rRNA normalizasyonu 56
4. BULGULAR 60
4.1. MeJa Uygulaması Sonucu Alkaloit Ölçüm ve Analizleri 60
4.2. RNA İzolasyonu, Miktar ve Kalite Tayini 61
4.3. Mikroarray Sonuçları 63
4.4. Real time (eş zamanlı) qRT-PCR 64
4.5.Mikroarray Sonuçlarına Göre Stres-Zaman Transkript Analiz İlişkilendirmeleri
68
4.5.1. İfadesi Değişen Transkriptlerin Oranı 68
4.5.2. MeJa Uygulaması ile İfadesi Değişen Transkriptlerin Karşılaştırılması 70
4.5.3.BIA Yolunda İfadesi Değişen Transkriptler 98
5. TARTIŞMA ve SONUÇ 105
KAYNAKLAR 114
EKLER 127
vi SİMGELER DİZİNİ Simge Açıklama °C Santigrat µg Mikrogram µl Mikrolitre µm Mikrometre µM Mikromolar Kısaltmalar Açıklamalar
18s rRNA 18s ribozomal ribonükleik asit
6OMT Norkoklaurin 6-O metiltransferaz
Avr Avirulans
bç Baz çifti
BIA Benzilizokinolin alkaloitleri
BM Birleşmiş Milletler
BR Brassinosteroidler
cDNA Komplementer Deoksiribonükleik asit
CNMT Koklaurin cis-N-metiltransferaz
COR Kodeinon redüktaz
DEPC Dietilpirokarbonat
dk Dakika
DNA Deoksiribonükleik asit
EDTA Etilen diamin tetra asetikasit
EST İfade edilmiş dizi etiketleri
g Gram
GO Gen ontolojisi
HPLC Yüksek performanslı sıvı kromotografisi
vii
HSP Isı şok protein
JA Jasmonik asit
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
MeJa Metil jasmonat
mg Miligram
MIA Monoterpenoit indol alkaloitleri
ml Mililitre
mM Milimolar
NCBI National Center for Biotechnology Information
NCS Norkoklaurin sentaz
ng Nanogram
PAMP Patojen ilişkili moleküler patern
PCA Ana parça analizi
PCR Polimeraz zincir reaksiyonu
PD Plazmodezma
pmol Pikomol
ppm Milyonda bir
PR Patojen ile bağlantılı- proteinler
PRR Patojen ilişkili reseptör
qRT-PCR Real Time (Eş zamanlı) PCR
RBP RNA bağlanma proteinleri
RNA Ribonükleik asit
RNAi RNA interferens
ROS Reaktif oksijen türleri
rpm Dakikadaki devir sayısı
RT Ters transkriptaz
SA Salisilik asit
SalR Salutaridin redüktaz
SAM S-adenozilmetiyonin
SAR sistemik kazanılmış direnç
sn Saniye
viii
ToF MS Uçuş zamanı kütle spektrofotometresi
TYDC Tirozindekarboksilaz
u birim
USS Uygulama sonrası zaman
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 2.1 Haşhaş bitkisinin genel görünümü 3
Şekil 2.2 Bitkilerde hastalıklara karşı direnç cevapları 5 Şekil 2.3 Bitkilerde savunma cevabını oluştutan sinyal iletim yolağı 7 Şekil 2.4 Sistemik olarak indüklenmiş immün cevabın gösterimi 8 Şekil 2.5 Bitki savunmasında yer alan bitkisel hormonlar 10 Şekil 2.6 Salisilik asit biyosentez yolu ve bitkideki rolü 11 Şekil 2.7 Bitki bağışıklığında oksinin diğer hormonlarla etkileşimi 13
Şekil 2.8 JA biyosentez yolu 14
Şekil 2.9 Plazmodezmanın uyarılmasını gösteren şema 17 Şekil 2.10 Patojenlere karşı karbonhidrat metabolizmasındaki değişim 19 Şekil 2.11 Çeşitli doğal ürünlerin biyosentez yolu ve etkileşimleri 20 Şekil 2.12 Bazı benzilizokinolin alkaloitlerinin kimyasal yapısı 24 Şekil 2.13 Haşhaş’da papaverin, sanguinarin, noskapin ve morfin
oluşumunu gösteren önemli benzilizokinolin yolları
25
Şekil 2.14 BIA biyosentez yolu 27
Şekil 2.15 Haşhaşta morfin biyosentez yolunu gösteren şema 34 Şekil 2.16 Haşhaşta alkaloit biyosentez yolunun çeşitli hücre tipleri ile
ilişkilendirilmesi
37
Şekil 2.17 Alkaloitlerin hücresel taşınımı 38
Şekil 2.18 Haşhaşta kalburlu boru ve latisiferlerde morfin biyosentez enzimlerinin lokalizasyonu
40
Şekil 3.1 P. sominiferum bitkilerinin sera görünümleri 47 Şekil 4.1 MeJa uygulanmış haşhaş bitkisinin kapsül dokusundaki alkoloit
ölçümleri
60 Şekil 4.2 Kapsül dokusu total RNAlarına ait %2’lik agaroz jel
görüntüsü.
61
Şekil 4.3 18S cDNA %1’lik agaroz jel görüntüsü 62
Şekil 4.4 Kontrol ve 0. saat arasındaki PCA Scatter Plot analizi 64 Şekil 4.5 qRT-PCR ve mikroaray sonuçlarının karşılaştırılması 67
x
Şekil 4.6 MeJa uygulamasından sonra zaman dilimlerine göre ifadesi değişen transkriptlerin sayısı
69
Şekil 4.7 Farklı zaman dilimlerinde artan ve azalan transkriptlerin birlikte ve ayrı ayrı Venn diyagramında gösterilmesi
69
Şekil 4.8 0USS’de kontrole göre biyolojik işlevde ifadesi değişen transkript sayısı
72
Şekil 4.9 0USS’de kontrol grubuna göre moleküler fonksiyonda ifadesi değişen transkript sayısı.
73
Şekil 4.10 0USS’de kontrol grubuna göre hücresel kısımda yer alan transkriptlerin oranı
74
Şekil 4.11 3USS’de kontrol grubuna göre biyolojik işlevde ifadesi değişen transkript sayısı
76
Şekil 4.12 3USS’de kontrol grubuna göre moleküler fonksiyonda ifadesi değişen transkript sayısı
78
Şekil 4.13 3USS’de kontrol grubuna göre hücresel kısımda yer alan transkriptlerin oranı
79
Şekil 4.14 12USS’de kontrol grubuna göre biyolojik işlevde ifadesi değişen transkript sayısı
81
Şekil 4.15 12USS’de kontrol grubuna göre moleküler fonksiyonda ifadesi değişen transkript sayısı
82
Şekil 4.16 12USS’de kontrol grubuna göre hücresel kısımda yer alan transkriptlerin oranı
83
Şekil 4.17 3USS’de 0USS’ye göre biyolojik işlevde ifadesi değişen transkript sayısı
85
Şekil 4.18 3USS’de 0USS’ye göre moleküler fonksiyonda ifadesi değişen transkript sayısı
87
Şekil 4.19 3USS’de 0USS’ye göre hücresel kısımda yer alan transkriptlerin oranı
88
Şekil 4.20 12USS’de 0USS’ye göre biyolojik işlevde ifadesi değişen transkript sayısı
90
Şekil 4.21 12USS’de 0USS’ye göre moleküler fonksiyonda ifadesi değişen transkript sayısı
xi
Şekil 4.22 12USS’de 0USS’ye göre hücresel kısımda yer alan transkriptlerin oranı
93
Şekil 4.23 12USS’de 3USS’ye göre biyolojik işlevde ifadesi değişen transkript sayısı
95
Şekil 4.24 12USS’de 0USS’ye göre moleküler fonksiyonda ifadesi değişen transkript sayısı
97
Şekil 4.25 12USS’de 3USS’ye göre hücresel kısımda yer alan transkriptlerin oranı
98
Şekil 4.26 BIA yolunda belirlenen transkriptlerin ifade değişim oranları 99
Şekil 4.27 BIA biyosentez yolu KEGG haritası 100
Şekil 4.28 Biyolojik işlevde 3 farklı zaman diliminde yer alan transkriptlerin karşılaştırılmalı gösterimi
101
Şekil 4.29 Moleküler fonksiyonda 3 farklı zaman diliminde yer alan transkriptlerin karşılaştırılmalı gösterimi
102
Şekil 4.30 Hücresel yapıda3 farklı zaman diliminde yer alan transkriptlerin karşılaştırılmalı gösterimi
xii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa
Çizelge 2.1. BIA metabolizmasındaki bazı enzimler 35
Çizelge 3.1. qRT-PCR primer dizileri 59
Çizelge 4.1. MeJa uygulanmış kapsül dokusundan izole edilen RNA' lara ait spektrofotometre değerleri
62 Çizelge 4.2. Kapsül cDNA spektrofotometre değerleri 63 Çizelge 4.3. qRT-PCR ve mikroarray sonuçlarının sayısal verileri (+): İfade
1
1. GİRİŞ
Haşhaş tohum ve yağından gıda olarak faydalanılmasının yanı sıra, çiçeklerinden ve kuru kapsüllerinden dolayısüs bitkisi olarakta değerlendirilmektedir. Aynı zamanda ürettiği sekonder metabolitlerden dolayıtıbbi amaçlı olarak da kullanılan çok yönlü bir bitkidir. Eski zamanlardan itibarentıbbi bir bitki olarak kullanılan haşhaş (
Papaver somniferum L.), narkotik analjezik morfin, öksürük kesici kodein,
antimikrobiyal sanguarin, kan damarlarını genişletici papaverin gibi farmasötik özelliklere sahip benzilizokinolin tipi alkaloitleri (BIA) içermektedir (Penix ve ark., 2010; Ünver ve ark., 2010).
Bitkiler yaşamları süresince biyotik ve abiyotik streslere maruz kalmaktadır bundan dolayı hayatta kalabilmek için çeşitli adaptasyonlar ve savunma sistemleri geliştirmişlerdir. Stres faktörlerine karşı, stres faktörünün çeşidine göre uygun savunma stratejileri bulunmaktadır. Bitkiler, herbivorlar veya patojenlere karşı savunmada rol oynayan toksik etki gösterebilen çok çeşitli doğal ürün veya sekonder metabolit üretebilirler (Schafer ve ark., 2009). Sekonder metabolitler, terpenler, fenolikler, azot veya kükürt içeren bileşikler olmak üzere 3 temel gruptan oluşurlar. Alkaloitler azot içeren ve amino asit türevli bileşikler olup (Van Etten ve ark., 2001), damarlı bitkilerin yaklaşık %20’sinde bulunmakta (Hegnauer ve ark., 1988) ve özellikle savunma amaçlı olarak üretilmektedirler (Mazid ve ark.,2011).
Patojen stresi de bitkilerin maruz kaldığı biyotik streslerden birisi olmakla birlikte bitkilerin genomik seviyede nasıl etkilendiği halen araştırma konusudur. Moleküler biyoloji çalışmalarısonucunda savunma sistemleri indüklenen bitkilerde değişen transkript profillerinin belirlenmesi savunma ile ilgili pek çok yeni genin bulunmasına fırsat sağlamıştır.
Bitkilerde üretilen alkaloitler yüzyıllardır özellikle ilaç sanayinde değerlendirildiği için büyük önem taşımaktadır. Dolayısıyla sekonder metabolitlerin bu özellikleri oldukça fazla araştırılmasına rağmen halen bitkilerinhangi biyosentez mekanizmalarına sahip olduğu ve bitki üzerindeki etkileri uzun süredir aktif olarak çalışılmaktadır. Stres durumunda bitkiyi korumak için sentezlenen sekonder metabolitlerin biyosentez mekanizması ve regülasyonunu araştırmak için bitkiler farklı
2
stres koşullarında değerlendirilerek metabolomik, proteomik, transkriptomik ve genomik çalışmalar yapılmaktadır.
Daha önceki dönemlerde spesifik alkaloit miktarını arttırmaya yönelik üretim programları denenmiştir. Bu programlar yüksek miktarda alkaloit içeren haşhaşların üretilmesinde başarı sağlamış olmasına rağmen buna sebep olan moleküler mekanizmalar halen netlik kazanmamıştır. Papaver türleri çeşitli alkaloitler üretmektedir ancak bunların arasında morfin üreten sadece P. somniferum ve
P.setigerum türleridir(Garnock-Jones ve Scholes, 1990). Haşhaş bitkisini diğer Papavertürlerinden farklı kılan mekanizmalarınbelirlenmesinde genom düzeyindegen
ifadesi analizlerine imkan verenarray teknolojileri kullanılabilmektedir. Papaver türlerinde çoğu cDNA’nın ekspresyon profillerinin belirlenmesi ve bunların BIAprofilleri ile bağdaştırılması bu bitkinin kimyasal fenotiplerinden sorumlu cDNA’ların keşfine yol açmıştır (Zeiger ve ark., 2005). Diğer yandan mikroarray teknolojisi pek çok organizmada olduğu gibi bitkilerde de global gen ifadesianalizi için kullanılanbir platformdur. Bu teknoloji sayesinde çok sayıda genin mRNA profilleri doku seviyesinde ya da zamanla ilişkili olarak çıkarılabilmektedir.
Bu tez çalışmasının amacı, fungal bir elisitör olan metil jasmonat (MeJa) muamelesi ilebaşta morfin üretimi olmak üzereBIA’ları indüklenen haşhaş bitkisinin tüm genom düzeyinde gen ifadesianalizinin yapılmasıdır.
3
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Haşhaş (Papaver somniferum L.) Bitkisinin Genel Özellikleri
Papaveraceae familyasına ait türler genellikle Kuzey Yarımkürenin ılıman ve
subtropik bölgelerinde yayılış göstermektedir. Bu familyada 28 cins ve yaklaşık 250 tür vardır. Ülkemizde bu familyaya ait 5 cins bulunmaktadır (Seçmen ve ark., 1995; Parmaksız ve Özcan, 2011).
Ülkemizde geleneksel olarak tarımı yapılmakta olan Papaver somniferum L.,
Papaverales takımının Papaveraceae familyasının Papaver cinsi içinde yer almaktadır.
Orta Anadolu’da Hititler döneminden bu yana yetiştirilen haşhaş, ülkemizin en önemli endüstriyel ve tıbbi bitkilerinden bir tanesidir. Eski zamanlardan beri tıbbi bir bitki olarak kullanılan haşhaş (Papaver somniferum L.) narkotik analjezik morfin, öksürük kesici kodein, antimikrobiyal sanguarin, kan damarlarını genişletici papaverin gibi farmasötik özelliklere sahip benzilizokinolin alkaloitlerini (BIA) içermektedir (Desgagné-Penix ve ark., 2010; Ünver ve ark., 2010).
4
Dünyada, haşhaş ekimi Birleşmiş Milletler (BM) Teşkilatı denetiminde ana üretici olarak Türkiye, Hindistan, Avustralya, Fransa, İspanya, Macaristan‟da yasal olarak yapılmaktadır. Türkiye ve Hindistan BM Teşkilatınca geleneksel haşhaş üreticisi ülkeler olarak kabul edilmektedir. Son beş yıllık verilerin ortalamasına göre ülkemiz dünya yasal haşhaş ekim alanları içerisinde % 49’luk bir paya sahip bulunmaktadır. Haşhaş Türkiye’de fazla yağışlı Doğu Karadeniz ve fazla sıcak olan Güneydoğu Anadolu hariç hemen her bölgede yetiştirilebilmekle birlikte haşhaş ekimi izne bağlıdır (TMO Yıllık raporu, 2012).
2.2. Bitkilerde Patojenlere Karşı savunma Sistemleri
Bitkiler dış ortamdan gelen pek çok uyarıya maruz kalmaktadır. Çevreden gelen bu uyarılara verilen ani cevap genel olarak stres olarak adlandırılmaktadır. Stres direnç ve tolerans mekanizmalarını içeren geçici fizyolojik süreçtir (Arnholdt-Schmitt, 2004; Mittler, 2006; Boyko ve Kovalchuk, 2011). Dolayısıyla organizmalar hayatta kalabilmek için tolerans, direnç ve sakınma gibi mekanizmalar geliştirmişlerdir. Hareketli canlılara nazaran bitkiler daha farklımekanizmalara sahiptir. Akut stresle başa çıkabilmek için bitkiler biyotik strese karşı sistemik kazanılmış direnç veya ısı şok proteinlerinin aktivasyonu gibi cevaplar geliştirmişlerdir (Madlung ve Comai, 2004).
Bitkiler mantarlar, bakteriler ve virüsler gibi çeşitli patojenlerle sürekli etkileşim halindedirler. Patojenden korunmak için de patojen algılanmalı, hızlı ve aktif bir savunma mekanizması aktif hale gelmelidir. Patojenin algılanması başarılı bir savunma cevabının oluşmasında büyük öneme sahiptir. Bitkilerin patojeni algılamasında patojen ilişkili moleküler paternler (PAMP) görev yapmaktadır (Şekil 2.2). PAMP’lar ise patern tanıyan reseptörler (PRR) tarafından algılanması savunma cevabının oluşmasında çoklu sinyal iletim yolununun aktivasyonunu ve patojenin üremesini engelleyen spesifik genlerin transkripsyonunu sağlar (Ausubel, 2005; Jones ve Dangl, 2006; Boller ve Felix, 2009; De León ve Montesano, 2013).
5
Şekil 2.2. Bitkilerde hastalıklara karşı direnç cevapları Cevap patojenlerin PAMP ve effektörlerinin tanınması ile indüklenir bitki PRR proteinlerince algılanır.Bu tanıma bitkilerde hormonal düzenlemeyi ve bitki savunma genlerinin transkripsiyonunu sağlar. İndüklenebilir direnç cevapları gelişimle ilgili genlerin ifadesini negatif olarak düzenler. Pozitif etkileşimler oklarla, negatif etkileşimler kareler ile gösterilmiştir (Danance ve ark., 2013’ten düzenlenerek alınmıştır)
Sinyal iletim yollarının başlaması sinyalleşme ve savunmada yer alan özel metabolitlerin üretimine yol açmaktadır (Fedoroff, 2006; Boyko ve Kovalchuk, 2011). Bitkilerin strese karşı normal cevabı ortama alışma ve adaptasyon sürecidir (Hermans et al., 2006; Boyko ve Kovalchuk, 2011). Bunlar bitkinin o zaman dilimindeki çevre şartlarına metabolik işlevlerinin uyum yapmasını ayarlayan ani ve uzun dönem stratejilerini içerir (Baena-Gonza´ lez, 2010; Boyko ve Kovalchuk, 2011).
2.2.1. Genel (temel) dirençlilik
Genelde bir bitkide hastalık oluşturabilen bir etmen başka bir bitkide herhangi bir hastalık oluşturmayabilir. Bu durum genel dirençveya temel dirençolarak adlandırılmaktadır. Bu tip dirençuzun ömürlüdür. Genel dirençmekanizması birçok durumda bitkide patojen sporlarının gelişmesini, hücre ve dokuları enfekte etmesini
6
önleyici olmasından kaynaklanmaktadır. Bitkideki kütikula, hücre çeperinin yapısı, fenolik bileşiklere ya da hastalık etmeni tarafından uyarılabilecek bir savunma sistemine sahip olması, o bitkinin hastalığa karşı dirençli olmasını sağlamaktadır (Özcan ve ark, 2001; Koç ve Üstün, 2008).
2.2.2. Özel (spesifik) dirençlilik
Konukçu bitkiler hastalıkların oluşturacağı zararlara engel olmak için dirençlilik genlerini geliştirmişlerdir. Dirençlilik geninin ürünü olan proteinler hastalık etmeninin bitkiye girmesi sırasında salgıladığı sinyal moleküllerini tanıma yeteneğine sahiptirler. Bu tanıma işlemi bitkinin savunma sisteminin harekete geçirilmesi bakımından zorunludur. Sonuçta bitki savunma mekanizmasının uyarılması antimikrobiyal etkiye sahip birçok proteinin bitkide üretilmesine neden olmaktadır (Özcan ve ark, 2001; Koç ve Üstün, 2008). Genel dirençlilikile özel dirençlilik arasındaki en önemli fark, genel dirençliliğinözel dirençliliğeoranla çok daha uzun ömürlü olmasıdır.
Bitkilerpatojen enfeksiyonundan korunabilmek için, i)patojenin kendisini konukçu olarak tanımasına fırsat vermemelidir, ii)patojenin içeri sızmasını önleyici silahlara sahip olmalıdır, iii) içeriye girmeyi başarmış patojenlerin gelişmesini önleyebilecek mekanizmalara sahip olmalıdır. Bitki patojen tarafından etkilense bile patojenin daha fazla yayılarak zarar verme olasılığını en aza indirebilecek sistemlere sahip olmalıdır (Özcan ve ark, 2001; Koç ve Üstün, 2008).
Yaralanma, patojenik olmayan organizmaların yanısıra virulans ve virulans olmayan patojenlerle enfeksiyon sonrasında bitkilerde genel olarak bir savunma cevabı oluşmakta ve iki farklı sinyal yolu meydana gelmektedir (Şekil 2.3). Bunlardan biri çeşitli uyarılara karşı oluşan genel bir savunma cevabı ve diğeri avirulan patojenlere karşı oluşan hipersensitif cevap (HR) olarak adlandırılan patojeni enfeksiyon bölgesinde sınırlandırmak üzere oluşan bir çeşit tepkidir (Hammond-Kosack ve Jones, 1996; Özcan ve ark, 2001; Koç ve Üstün, 2008; Zurbriggen ve ark., 2010).
7
Şekil 2.3. Bitkilerde savunma cevabını oluştutan sinyal iletim yolağı (Mazid ve ark.,2011’den düzenlenerek alınmıştır)
Bitkiler ve patojenler arasındaki etkileşim ya başarılı bir şekilde enfeksiyon yada başarılı bir şekilde direnç meydana getirmektedir. Direnç sırasında virüs, bakteri veya funguslar ile enfeksiyon sonucunda enfekte olmuş hücrelerin etrafında bir dizi lokalize cevaplar meydana gelmektedir. Bu cevaplar, çekirdek ve organelleri patojen saldırısının oluştuğu bölgeye taşımak (Heath ve ark., 1997), reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek (Zurbriggen ve ark., 2010), hücre çeperini mekanik olarak güçlendirmek (lignin ve kalloz depozisyonları ile) ve antibiyotiklerin sentezi (fitoaleksinler) gibi reaksiyonları kapsamaktadır (Aktaş ve Güven, 2005).
Fitoaleksin, Patojenite ilgili proteinler (PR) gibi antimikrobiyal bileşiklerin de
novo sentezi ile de patojenlerin hücreleri enfekte etmesi sırasında patojene karşı bir
direnç oluşturulmaktadır. Enfeksiyon sonrasında oluşan sinyaller ile henüz enfekte olmamış bitki bölgelerinde gen ekspresyonu da uyarılarak lokal cevapların oluşması sağlanmaktadır. Sistemik direnç (saldırıya uğrayan bitkinin enfeksiyon bölgesinden uzak dokularda savunma kapasitesini artırması) sırasında fitoaleksin ve PR
8
proteinlerinin üretimi gerçekleşmektedir. Fitoaleksinler lokal cevapların başlıca antimikrobiyal bileşikleriyken PR proteinleri hem lokal hem de sistemik direnç sürecinde meydana gelmektedirler (Mansfield ve ark., 1999; Koç ve Üstün, 2008).
Bu lokal reaksiyonlar dışında, saldırıya uğrayan bitki, enfeksiyon bölgesinden uzak dokularda savunma kapasitesini artırmak üzere sistemik tepkiler de oluşturmaktadır. Enfeksiyon bölgesinde bitkinin savunma cevapları etkinleştirildiğinde enfeksiyon bölgesinden uzaktaki hasar almamış bitki dokularının patojen istilasından korunması için sistemik savunma cevabı uyarılmaktadır (Pieterse ve ark., 2009).Sistemik olarak uyarılmış bu tepki, bitkiyi ardışık patojen istilacılarına karşı birkaç haftadan birkaç aya kadar değişebilen bir süre için oldukça geniş ölçekteki pek çok patojene karşı koruyacak potansiyeldedir(Ryals ve ark., 1996). Biyolojik olarak, birkaç uyarılmış sistemik savunma sistemi detaylı olarak tanımlanmıştır. Bunlar, nekrotik patojenler tarafından tetiklenen sistemik kazanılmış direnç. (SAR) (Sticher ve ark., 1997), patojen olmayan rizobakter suşlarının köklerde kolonize olmasıyla aktive olanuyarılmış sistemik direnç (ISR) (Pieterse ve ark., 2002) ve böceklerin beslenmesine bağlı olarak ortaya çıkan doku hasarlarıyla uyarılan yara-uyarımlı savunma(Kessler ve Baldwin, 2002) sistemlerini kapsamaktadır (Aktaş ve Güven, 2005) (Şekil 2.4).
Şekil 2.4. Sistemik olarak indüklenmiş immün cevabın gösterimi. SAR lokal olarak enfekte edilmiş bitkinin sağlıklı dokularında aktifleşir. SA PR’leri kodlayan genlerin aktivasyonunda sinyal iletimi için gerekli moleküldür. İndüklenmiş sistemik direnç içinse JA ve ET hormonları gereklidir. (Pieterse ve ark., 2009’dan değiştirilerek alınmıştır)
9
Patojen, bitki tarafından hızla algılanmadığı sürece savunma sistemleri harekete geçemez. Bitkiler patojenden kaynaklanan bazı molekülleri (elisitörleri) algılayarak savunma tepkilerini başlatırlar. Bu tür biyotik uyarıcılar, glikoproteinlerin dahil olduğu proteinler, polienoik yağ asitleri, kitin ve β-1,3 glukanlardan türevlenen parçalar gibi patojenden kaynaklanan ve spesifik olmayan elisitörlerdir (Ryals ve ark., 1996; Shetty ve ark., 2009). Direnç mekanizması, ayrıca avirulan (avr) gen ürünleri bulunan patojenlerin, spesifik elisitörleri tarafından da uyarılır. Flor (1956) tarafından ileri sürülen gen-için-gen teorisine göre bitkiler direnç (R) geni taşırlar ve bu genin ürünü R proteinleri, patojenin avr geni ürününün spesifik olarak algılanmasını ve direnç oluşumunu uyarmak üzere görev yapar. Savunma tepkilerinin ilki ve en önemlisi, direnç genleri tarafından spesifik patojen hatlarınca kodlanan avirulan (Avr) proteinlerin algılanmasıdır (Ellis ve ark., 2002). R genleri ile oluşturulan savunma tepkisi (aynı zamanda gen-için-gen direnci), saldırı bölgesinde bulunan hücrelerde hızla nekrozların ortaya çıkmasına neden olur ve patojenin o bölgede etkin şekilde sınırlandırılması ile sonuçlanır (Aktaş ve Güven, 2005).
2.2.3. Bitki savunma sisteminde yer alan hormonlar
. Bitkilerde büyüme ve çevreden gelen uyarılara cevap büyük oranda fitohormonlarla sağlanmaktadır (Şekil 2.5). Salisilik asit (SA), jasmonik asit (JA), ve etilen gibi hormonlar bitki savunma cevabının düzenlenmesinde merkezi bir rol oynamakla birlikte oksinler, absisik asit (ABA), sitokininler, giberellinler ve brassinosteroidlerde bitki bağışıklık sisteminin düzenlenmesinde anahtar role sahiptirler (Denance ve ark. 2013).
10
Şekil 2.5. Bitki savunmasında yer alan bitkisel hormonlar (Pieterse ve ark., 2009’dan değiştirilerek alınmıştır)
Patojenle enfeksiyon sonucunda savunma mekanizmalarını harekete geçirecek olan sinyaller oluşmakta ve buna bağlı olarak da lokal ve sistemik antimikrobiyal savunma oluşmaktadır (Aktaş ve Güven, 2005). Yapılan çalışmalar elisitörlerin, reseptörlerin, iyon kanallarının, SA, JA ve MeJa’ya önderlik eden yolun dıştan gelen sinyallerin hücresel cevaba dönüştürülmesinde önemli role sahip olduğunu göstermiştir (Creelman ve Mullet, 1997).
Salisilik asit (SA)
Dışardan uygulanan SA’nın gen ekspresyonunu ve fitoaleksinler ile aralarında PR proteinlerinin de yer aldığı birçok proteinin sentezini uyardığı bildirilmiştir (Hammond-Kosack ve Jones, 1996). SA birikimi, bitki dokularında patojene karşı hem lokal savunma tepkilerinin oluşturulmasında, hem de SAR’ın oluşturulmasında gereklidir (Ryals ve ark., 1996). SA’ya bağlı bir direnç yolu olan SAR, üzerinde en fazla çalışılmış olan uyarılmış direnç tepkisidir (Şekil 2.6). Uzun mesafe taşınabilen (lipit türevli sinyaller) sinyallerin algılanması, enfekte olmamış dokularda SA birikimine neden olur; bunun sonucu olarak da aralarında PR genlerinin de yer aldığı savunma genleri setinin aktivasyonu gerçekleşir (Sticher ve ark., 1997; Aktaş ve Güven, 2005). Bununla birlikte SA’nınkatalaz ve askorbat peroksidaz aktivitesinde azalmaya sebep olduğu da bildirilmiştir (Sanchez-Casas ve Klessig, 1994).
11
Şekil 2.6. Salisilik asit biyosentez yolu ve bitkideki rolü (Borowiak ve ark., 2007’den düzenlenerek alınmıştır)
Etilen (ET)
Etilen, bitkilerde bazı stres tepkilerini ve gelişim aşamalarını kontrol eden bir hormondur. Savunma tepkileri açısından etilenin rolü az çalışılmış bir konu olup, bazı açılardan etilen üretiminin bitki direnci ile koordineli olduğu (Norman-Setterblad ve ark, 2000), diğer bir açıdan ise hastalık gelişimini uyardığı (Hoffman ve ark, 1999) bildirilmiştir Aktaş ve Güven, 2005). Etilenin patojen ve böcek saldırılarında savunma cevabının oluşmasında önemli bir düzenleyici olduğu bilinmektedir (Van Loon ve ark., 2006). Çoğu durumda JA ve ET sinyal iletimi sinerjittir (Pieterse ve ark., 2009).
Giberellik asit (GA)
Giberellik asit hormonu da SA, JA ve ET sinyal ağı ile ilişkilidir. Gibereellinlerin bitki büyümesini büyümeyi baskılayan DELLA proteinlerinin yıkımı ile düzenlediği bilinmektedir. DELLA proteinleri biyotrofik patojenlere karşı duyarlılığı
12
sağladığı ve nekropatik patojenlere karşı da SA ve JA sinyal yolu ile dirençliliği sağladığı bildirilmiştir (Navarro ve ark., 2008)
Absisik asit (ABA)
ABA hormonunun kuraklık, tuz ve soğuk stresi gibi çeşitli abiyotik stresler üzerinde etkisi olduğu bilinmektedir. Bunun yanı sıra Anderson ve ark. (2004),
Arabidopsis mutantları ile yaptıkları çalışma ile fungal savunmada ABA’nın JA/ET
bağımlı gen ekspresyonunu azalttığını bildirmişlerdir. Ayrıca JA biyosentezi üzerine etki etmesinden (Adie ve ark., 2007) dolayı SA, JA ve ET sinyal ağı ile ilişkilidir. Bununla birlikte SAR’ın aktifleşmesi ABA-ilişkili genlerin ifadesini baskıladığı bildirilmiştir (Pieterse ve ark., 2009).
Brassinosteroidler (BR)
BR’ler bitkinin büyümesinde gelişmesinde, biyotik ve abiyotik strese karşı cevap oluşturmasında görev alan steroid yapıda hormonlardır (Bajguz ve Tretyn, 2003). BR biyosentezi bitkinin her organında olabilmekte ancak diğer hormonların aksine uzun mesafelere taşınamamaktadır (Symons ve ark., 2004; Symons ve ark.,2007). Son dönemlerde biyotik ve abiyotik uyarılara karşı cevap oluşumunda yer aldığı ile ilgili pek çok çalışma yapılmıştır (Vriet ve ark., 2012). Biyotik streste BR’ler ABA, SA, JA ve ET hormonlarının sentezini uyarmaktadır (Bajguz ve Hayat, 2009). BR’ler çeşitli biyolojik işlevlerde ve stres cevaplarında diğer hormonlarla etkileşim halindedir (Gruszka, 2013).
Oksin
Oksinin bitki büyümesi ve gelişmesi üzerinde etkili olduğu bilinmekte idi ancak yapılançalışmalar oksinin bitki patojen etkileşimlerinde ve bitki savunmasında
13
doğrudan veya dolaylı bir role sahip olduğunu göstermiştir (Kazan ve Manners, 2009). Oksinin bitki-patojen etkileşimlerinde nasıl bir role sahip olduğu hakkında değişik görüşler mevcuttur(Navarro ve ark., 2006; Fu ve Wang, 2011). Oksin cevap yolu SA, JA, ET sinyal ağı ile farklı kısımlarda etkileşim göstermekedir (Şekil 2.7). Örneğin oksinin JA biyosentezi üzerinde ekisi olduğu Nagpal ve ark. (2005) tarafından, JA biyosentezinde yer alan genler üzerine etki ettiği Liu ve Wang (2006) tarafından gösterilmiştir. Ayrıca SA’nın oksin sinyali üzerinde antagonistik bir etkiye sahip olduğu belirtilmiştir (Pieterse ve ark., 2009).
Şekil 2.7. Bitki bağışıklığında oksinin diğer hormonlarla etkileşimi (Naseem ve Dandekar, 2012’den düzenlenerek alınmıştır)
Jasmonik asit (JA)
Doymamış yağ asitlerinin oksidasyon ürünleri oksilipinler olarak bilinmektedir (Şekil 2.4).Bitkilerde jasmonatlar oktadekanoid yolağı ile oksilipinlerden üretilirler (Wasternack ve Kombrink, 2010). Bitki oksilipinlerinin en çok çalışılan örnekleri arasında JA ve MeJa bulunmaktadır (Şekil 2.8). Uçucu bir fitohormon olan MeJa, JA
14
karboksil metil transferaz aktivitesi ile üretilir (Seo ve ark., 2001) ve JA eşleniği olduğu için biyolojik deneylerde yaygın olarak kullanılmaktadır (Pauwels ve ark., 2008). Lipit türevli bu hormonların rolleri patojen saldırıları, yaralanma gibi bitki biyotik ve abiyotik stres aracılı cevapların çalışılmasında yaygındır. Aynı zamanda gelişme üzerinde yaşlanma, sekonder metabolit üretimi ve üreme gibi işlevlerin incelenmesinde de kullanılmaktadır (Avanci ve ark., 2010; Noir ve ark., 2013).
JA sinyal iletim yolu, birkaç sinyal iletim yolunu içerir. İlk yaralanma veya stres uyaranı ile stres algılanır ve lokal ya da sistemik olarak sinyalin iletimi başlar. Bu sinyalin algılanması ile JA biyosentezi uyarılır. JA’in algılanması ve cevabın uyarılması sonucunda JA sinyal iletimi salisilik asit, etilen, ve diğer sinyal iletim yolları ile iletişim kurar (Turner ve ark., 2002). JA sinyal iletimi, ozmotik stres, yaralanma, kuraklık gibi abiyotik stresler ile kitin, oligosakkarit, oligogalaturonitler gibi elisitörlere maruz kalma ile de uyarılabilir (Doares ve ark., 1995; Keskin, 2012).
15
SA ile JA sinyal yolları arasında hem pozitif hem de negatif etkileşimler olduğuna dair kanıtlar bulunmaktadır. Bu iki sinyal yolu arasındaki karşılıklı antagonistik ilişkiler, mutasyon analizleriyle ortaya konmuştur (Aktaş ve Güven, 2005). JA ve SA yollarının birbirleri üzerindeki pozitif etkisine ilişkin sınırlı sayıda bilgi vardır. Arabidopsisthaliana'da yapılan mikroarray çalışmalarında, 50’den fazla savunma bağıntılı genin SA ve JA tarafından eş biçimde indüklendiği ve her iki sinyal yolunun bu genleri koordineli olarak düzenlediği ortaya konmuştur (Schenk ve ark., 2000). SA ve etilen sinyal yolları arasındaki pozitif ve negatif ilişkiler hakkındaki veriler oldukça sınırlı olmasına karşın, Arabidopsis'de yapılan çalışmalar, bu iki hormonal sinyalin birçok savunma bağıntılı genin koordineli olarak uyarılmasında birlikte hareket ettiklerini ortaya koymuştur (Schenk ve ark., 2000).
Mantar, bakteri, virüs ya da bazı kimyasallar gibi biyotik elisitörlerin bitkilerde kullanılması sadece savunma sistemini devreye sokmaz aynı zamanda bitkilerde fitoaleksinlerin birikimine de sebep olmaktadır (Kai ve ark., 2011).Fungal elisitör olarak bilinen MeJa P. somniferum (Holková ve ark., 2010; Huang ve Kutchan, 2000)
Catharanthus roseus (Ruı´z-May ve ark., 2009) bitkilerinde alkaloit birikimine yol
açmıştır. Jasmonatların bitkilerde gelişim sürecinde yaşlanmada ya da patojen enfeksiyonunda görev aldığı bilinmektedir. (Balbi ve Devoto, 2008;Kai ve ark., 2011). Jasmonatlara bağlı gelişen bitki savunmasında cevaplarından birisi de sekonder metabolit birikimidir. Jasmonatlar sekonder metabolitleri bir kısım biyosentez geninin ifadelerini değiştirerek gerçekleştirirler (Memelink ve ark.,2001; Zhang ve ark., 2011).
Dışardan MeJa uygulanması yapılarak JA sinyal iletim yolağının aktifleştirilmesinin bitki köklerinden flavanoid ve indol gibi sinyal bileşiklerinin salınımını arttırdığı bilinmektedir (Badri ve ark., 2008) ancak topraktaki mikroorganizma yoğunluğunu değiştirmezken rizosfer komunite kompozisyonu üzerinde değişikliğe sebep olmuştur. Bu da JA sinyal iletim yolağının topraktaki bitki-bakteri etkileşimleri üzerinde etkili olabileceğini göstermektedir (Carvalhais ve ark., 2013). Bununla birlikte tüm organların farklı JA sinyal iletim kaskatına sahip olduğu ve böylece indüklenen bölge hakkında bilgiye sahip olduğundan dolayı yaralanan bölgeye özgü cevap verdiği bildirilmiştir (Tytgat ve ark., 2013).
16
2.2.4. Bitkilerde stres cevabında yer alan epigenetik mekanizmalar
Bitkilerin biyotik ve abiyotik uyaranlara karşı adaptasyonunu sağlayan anahtar stratejilerden biriside gen ekspresyonunun düzenlenmesidir. Gen ekspresyonundaki değişmeler mRNA transkripsiyonu, işlenmesi, taşınması, translasyonu, depolanması ve yıkımı gibi moleküler mekanizmalar ile sağlanmaktadır. Biyotik ve abiyotik uyarılar genellikle aniden olur ve hücrenin hayatta kalmasını sağlamak için hızlı cevap oluşturmak büyük bir öneme sahiptir (Echevarría-Zomeño ve ark., 2013).
Bitkilerde hızlı uyum epigenetik olarak isimlendirilen tersinir DNA ve kromatin modifikasyonu yoluyla gen ifadesinin düzenlenmesini içerir. Epigenetik regülasyon, DNA dizisini değiştirmeden sitozin modifikasyonu veya histon metilasyonu, histon (de)asetilasyonu ile gen ifadesinin modifikasyonunu sağlar (Zilberman and Henikoff, 2005; Boyko ve Kovalchuk, 2011).
RNA bağlanma proteinleri (RBP), RNA molekülünün transkripsiyonundan yıkımına kadar yaşam döngüsünün tüm basamaklarında yer alırlar. Ayrıca hücrelerin yaşamlarını sürdürme ve gelişmelerinde merkezi önemleri olduğu gibi (Fedorof, 2002) post-transkripsiyonel gen regülasyonunda önemli bir role sahiptir. Gelişim sürecinin yanı sıra çeşitli çevresel şartlara uyum sağlamada da görevlidir. Pre-mRNA işlenmesi, poliadenilasyon, RNA kararlılığı ve RNA’nın taşınması aynı zamanda kromatin modifikasyonunuda gerçekleştirmektedir (Lorkovic, 2009).
2.2.5. Bitkilerde stres cevabında yer alan hücresel yapılar
Bitkiler, patojenlere karşı bariyer oluşturan, kütikula ya da hücre duvarı modifikasyonları gibi çeşitli yapısal savunma sistemleri de geliştirmişlerdir. Hücre duvarının güçlendirilmesi fenolik bileşiklerin birikimi, ROS ve kalloz depozisyonu ile sağlanabilmektedir (Van Kan, 2006). Kalloz, genellikle papilla adı verilen hücre duvarı apozisyonlarında fenolik bileşikler, polisakkaritler ve antimikrobiyal proteinler ile birlikte bulunan, yüksek molekül ağırlıklı β-(1,3)-glukan polimeridir. Kalloz depozisyonları patojen saldırılarının erken evrelerinde patojenin nüfuz etmesini
17
engellemek amacıyla oluşturulur (Ton ve ark., 2004) ve antimikrobiyal sekonder metabolitlerin biriktirildiği yerlerdir (Luna e ark., 2011; De León ve Montesano, 2013). Plazmodezmalar (PD), bitkilerde simplastik iletişimi sağlamada görevli hücrelerarası kanallardır. Daha önceleri bitki hücre duvarlarında küçük moleküllerin difüzyonuna izin veren basit delikler olarak düşünülmüştür ancak (Maule, 2008) yapılan son çalışmalar bu yapıların daha iyi anlaşılmasına imkan sağlamıştır. Artık PD hücreler arasında proteinler, RNA’lar ya da ribonükleoproteinler gibi makromoleküllerin taşınmasını kolaylaştıran daha kompleks yapılar olarak bilinmektedir. Bununla birlikte bitkinin ihtiyaçlarına göre modifiye olabilen fonksiyonel olarak dinamik kanallardır (Ehlers ve Kollmann,2001; Lee ve Lu, 2011).
PD ile sağlanan doğrudan simplastik bağlantılar bitkilerin fizyolojik ve gelişimsel süreçlerini düzenlemede büyük avantaj sağlamasına rağmen bazı biyotrofik mikrobiyal patojenlerde bu kanalları enfeksiyon için giriş yolu olarak görmektedir
(Heinlein ve Epel, 2004).
Şekil 2.9. Plazmodezmanın uyarılmasını gösteren şema (Lee ve Lu, 2011’den düzenlenerek alınmıştır)
SA birikiminin baskılandığı mutantlarda kalloz seviyesinin azaldığı belirlenmiştir (DebRoy ve ark., 2004). Wang ve ark. (2013) patojen saldırısı altında olan Arabidopsis thaliana bitkisi ile yaptıkları çalışmada SA iletim yolağının PD’nin kapanmasını düzenlediğini ve bunun doğal bağışıklık olduğunu göstermişlerdir.
18
2.2.6. Protein katlanması
HSP90 (Heat Shock Protein 90), ökaryotik hücrelerde protein kinazlar, hormon reseptörleri ve transkripsiyon faktörleri gibi anahtar sinyal moleküllerinin aktivasyonunu, kararlılığını olgunlaşmasını ve toplanmasını sağlayan oldukça korunmuş proteinlerdir (Pearl ve Prodromou, 2006) ve bitkilerde immün sensörler HSP90 proteinlerinin substratları olarak bilinmektedir (Kadota ve Shirasu, 2012).
HSP70 ısı şok proteinleri protein katlanması ve organel taşınımında görev alan şaperonların büyük bir sınıfıdır ve biyotik ve abiyotik stres cevabında önemli bir role sahiptirler. Stres durumunda çekirdek ve çekirdekçikte lokalize olan proteinlerdir ve pre-ribozom toplanmasında yer alırlar (Boston ve ark., 1996; Zulak ve ark., 2009).
2.2.7. Enerji metabolizması
Bitkilerde patojen stresi sekonder metabolizma üzerinde etkili olduğu kadar primer metabolizma üzerinde de etkilidir. Virüs gibi patojenler, büyümek ve üremek için canlı dokuya ihtiyaç duyarlarken bakteri, mantar gibi patojenlerde dokuyu öldürerek ölü doku üzerinden ya da canlı doku üzerinden beslenebilirler. Patojenler besin ihtiyaçlarını karşılamak için konakçı bitkinin karbohidrat metabolizmasından faydalanmaya çalışacaklardır. Dolayısıyla bitkinin özümleme ürünlerinin patojen tarafından alınması bitkide özümleme ürünü gereksinimini arttıracaktır. Ayrıca patojen enfeksiyonu klorotik ve nekrotik bölgelerin oluşmasına ve fotosentez özümlemesinde de azalmaya sebep olmaktadır. Patojen saldırısı önce fotosentezin hızlı bir şekilde düşüşüne ve fotorespirasyonun artmasına yol açar (Şekil 2.10). Patojen enfeksiyonunun karbohidrat metabolizması üzerindeki etkilerini bildiren çeşitli çalışmalar yapılmış olmasına rağmen halen bitki patojen etkileşiminde nasıl bir role sahip olduğu netlik kazanmamıştır (Berger ve ark., 2007).
19
Şekil 2.10. Patojenlere karşı karbonhidrat metabolizmasındaki değişim (Berger ve ark., 2007’den değiştirilerek alınmıştır)
2.3. Sekonder Metabolitler
Bitkiler kendilerini patojenlerden ve herbivorlardan korumak amacıyla çeşitli savunma mekanizmalarına sahiptirler. Bu mekanizmalardan birisi de sekonder metabolit üretmektir. Doğal ürünler olarak isimlendirilen bitki sekonder metabolitleri genellikle düşük moleküler ağırlığa sahip, belli bir taksada yer alan, temel büyüme ve gelişme için gerekli olmayıp biyotik ve abiyotik streslere karşı çevresel adaptasyonu sağlayan moleküllerdir. Sekonder metabolitler aynı zamanda tozlaşma ve tohum dağılımında önemli rollere sahip olmasının yanı sıra bitkilerin, bakteri ve mantarların mutualist türleri ile etkileşimini de sağlamaktadır. Ayrıca diğer bitkiler ile etkileşimini (allelopati gibi), herbivorlara karşı savunma sisteminde de yer almaktadır (Hartmann, 2007; Nascimento; Fett-Neto, 2010). Bitkilerin fotosentez, solunum, karbohidrat, yağ ve azot metabolizması gibi primer metabolizmasında birkaç yüz tane metabolit bulunurken sekonder metabolizmasında terpenler, fenolikler, glikozitler ve alkaloitler gibi yaklaşık 200 000 sekonder metabolit yer almaktadır (Wu ve Chappell, 2008).
20
Şekil 2.11. Çeşitli doğal ürünlerin biyosentez yolu ve etkileşimleri (Wu ve Chappell, 2008’den değiştirilmiştir)
Çoğu bitkide sekonder metabolitlerin sentezi ve birikimi belli bir zaman sürecinde düzenlenmektedir (Şekil 2.11). Kural olarak savunmasız dokular yaşlı veya yaşlanmakta olan dokulara nazaran daha fazla savunulmaktadır. Örneğin, tohumlarda, fidelerde, tomurcuklarda ve bitkinin genç dokularında ya büyük miktarda bileşik ayrılmakta ya da aktif olarak sentezlenmektedir ki buna da optimal savunma teorisi denmektedir. Çiçek, meyve ve tohum gibi hayatta kalmak ve çoğalmak için önemli olan organlar savunma kimyasalları tarafından zengindir (Wink, 2010).
2.3.1. Alkaloitler
Bitkilerden elde edilen, genellikle kuvvetli fizyolojik ve farmakodinamik aktivite gösteren, halka içinde bir veya birden fazla azot taşıyan, bazik karakterli maddelerdir. Diğer sekonder metabolitler gibi alkaloitler de bitkilerde herbivorlar ve patojenlere karşı savunmada görev alan bileşiklerdir. Potansiyel biyolojik aktivitelerine
21
bağlı olarak bilinen yaklaşık 12.000 alkaloit, farmasötik, uyarıcı, narkotik ve zehir olarak kullanılmaktadır. Morfin, Friedrich Sertürner (1806) tarafından ilk izole edilen alkaloittir. Friedrich Sertürner’in yöntemi kullanılarak sonraki yıllarda pek çok alkaloit izole edilmiştir. Morfin eski adıyla “morphium” adını Yunan tanrısı uyku ve rüyaya sebep olan Morpheus'tan alır (Wink,1998; Zulak ve ark., 2006). Alkaloit terimi ilk defa 1819 yılında Meißner tarafından alkaliye benzedikleri için kullanılmıştır (Aniszewski, 2007). Bitki alkaloit biyokimyasının çalışma sahası 1806 yılında morfinin izolasyonu ile başlamıştır. Molekülün stereo-kimyasal karmaşıklığına bağlı olarak 1952 yılına kadar yapısı açıklanamamıştır. Yarım yüzyılı aşkındır bitkilerdeki alkaloit biyosentezi kimyasal, biyokimyasal ve moleküler araştırmalarla anlaşılmaya çalışılmaktadır (Facchini, 2001).
Alkaloitler yüksek bitkilerde bol miktarda bulunur. Yüksek bitkilerin en az % 25’i bu molekülleri içerir. Genellikle % 0.01 den daha fazla alkaloit içeren bitkiler, alkaloit içeren bitkiler olarak tanımlanırlar (Hegnauer,1963). Genel olarak bitkilerin belli bir organında (kök, kabuk, yaprak, meyve, tohum gibi) bulunurlar. Alkaloit taşıyan bir bitkinin her organında alkaloit bulunmayabilir. Bitkilerde nadiren tek çeşit alkaloit bulunur. Genellikle çok küçük farklılıklarla aynı yapıya sahip bir grup alkaloit birlikte bulunmaktadır. Bunlardan biri diğerlerinden daha fazla veya daha aktiftir. Alkaloitlerin çoğu, bir türe veya yakın türlere özeldir, bir kısmı ise bir familyaya özgüdür. Suda az, organik çözücülerde daha fazla çözünürler (Aniszewski, 2007; Gürkök ve ark., 2010).
Alkaloitler, i) biyolojik ve ekolojik aktivitelerine, ii)kimyasal yapılarına ve iii)biyosentez yolaklarına göre sınıflandırılabilirler. Biyolojik aktivitelerine göre ise i)doğal veya zayıf bazik moleküller, ii)hayvan kökenli alkaloitler, iii)deniz alkaloitleri, iv) yosun alkaloitleri, v)fungal ya da bakteriyel alkaloitler ve vi)doğal olmayan alkaloitler olarak ayrılabilirler (Pelletier, 1983).
Yapılarından yola çıkarak alkaloitler şekil ve orijinlerine göre 3 ana gruba ayrılmaktadırlar, i)gerçek alkaloitler, ii) protoalkaloitler ve iii) yalancı alkaloitler.
22
Gerçek alkaloitler
Gerçek alkaloitler, amino asitten türevlenirler ve heterosiklik halkalarını bir azotla ortaklaşa kullanırlar. Düşük dozlarda bile biyolojik aktiviteleriyle oldukça yüksek reaktif moleküllerdir. Bütün gerçek alkaloitler acı bir tada sahiptir ve kahverengi bir sıvı olan nikotin dışında hepsi beyaz ve katıdırlar. Suda çözünebilir tuzları oluşturan alkaloitlerin pek çoğu bu tuzları oluşturabilmek için asitlerle birleşen kristal maddelerdir. Bitkilerde i) serbest durumda, ii) tuz olarak ve iii) N-oksitler olarak bulunurlar. Bu alkaloitler sınırlı sayıda tür ve familyada bulunmaktadır. Gerçek alkaloitlerin primer öncülleri L-Ornitin, L-Lizin, L-Fenilalanin/L-Tirozin, L-Triptofan ve L-Histidin amino asitleridir (Pelletier, 1983). Kokain, kinin, morfin ve dopamin gerçek alkaloitler içinde yer almaktadır (Aniszewski, 2007; Gürkök ve ark., 2010).
Protoalkaloitler
Protoalkaloitlerin N atomları bir amino asitten türevlenirler ancak, heterosiklik halkanın parçası değildirler. Bu tip alkaloitler L-Tirozin ve L-Triptofan’dan türevlenen bileşikleri içerirler. Halkasal yapıya sahiptirler ancak yapısal olarak basittirler. Bütün alkaloitlerin az bir kısmını oluştururlar. Bu alkaloitler pyrroline çekirdeğe sahiptirler ve
Boscia cinsi için temel alkaloitlerdendir. Hordenin, meskalin ve yohimbin bu çeşit
alkaloitlere iyi örneklerdir (Aniszewski, 2007; Gürkök ve ark., 2010).
Yalancı alkaloitler
Temel karbon iskeletleri amino asitlerden türevlenmeyen bileşiklerdir. Bunlar amino asitlerin öncül (prekürsör) veya postkürsörlerinden oluşmaktadırlar. Kapseisin, efedrin, kafein, teobromin bu gruba örnek olarak verilebilir (Aniszewski, 2007).
Monoterpenoid indol alkaloitleri, tropan alkaloitleri ve nikotin, pürin alkaloitleri, pirolizidin alkaloitleri, quinolizidin alkaloitleri ve benzilizokinolin alkaloitleri (BIA)
23
bitkilerde bilinen bazı alkaloit çeşitlerine örnek verilebilir. Haşhaş bitkisinde benzilizokinolin grubu alkaloitler bulunmaktadır.
2.3.2. Benzilizokinolin (BIA) alkaloitleri
BIA’nın bilinen yaklaşık 2.500 üyesi bulunmaktadır ve potansiyel farmakolojik özelliklere sahiptirler. Diğer sekonder veya özelleşmiş metabolitler gibi bitkide normal büyüme ve gelişme için değil, herbivor ve patojenlere karşı savunma görevi için üretilmektedirler.
BIA’ların insanlarda ve hayvanlardaki tıbbi uygulamaları ve farmasötik etkileri, onları üreten bitkilerdeki görevlerinden daha iyi anlaşılmış olma tezatlığıyla önümüzde durmaktadır. Morfin ve kodein güçlü analjezikler olup binlerce yıldır bilinmekte ve üretilmektedir. Farmasötik olarak kullanılan diğer BIA’lar antimikrobiyal ajanlar olan sanguinarin ve berberin, öksürük kesici ve güçlü antineoplastik (antikanserojen) noskapin, damar genişletici papaverin, kas gevşetici (+)-tubokurarindir (Şekil 2.12). Tebain, morfin ve kodein için öncül molekül olup oksikodon, naltrekson ve buprenorfin gibi analjeziklerin sentezi için kullanılmaktadır ancak, bu bileşiklerin çoğu uygulanabilir değildir. Bu alkaloitler çoğunlukla Papaveraceae, Ranunculaceae,
Berberidaceae, Menispermaceae familyalarında bulunurken; en çok araştırılan türler Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Thalictrum flavum, Coptis japonica
24
Noskapin Sanguinarin Papaverin
Tebain Morfin Kodein
Şekil 2.12. Bazı benzilizokinolin alkaloitlerinin kimyasal yapısı
2.3.3. Benzilizokinolin (BIA) Alkaloitlerinin Biyosentezi
BIA yapısal olarak çok farklı çeşitler içermektedir ancak biyosentez yolağında oksidoredüktaz, transferaz ve liyazlar olmak üzere sınırlı sayıda enzim ailesi yer almaktadır (Şekil 2.13). Bir veya iki tane 1-benzilizokinolin birimi içeren C veya C-O eşleşim reaksiyonları diğer alkaloit alt gruplarının öz iskelet yapısını oluşturmaktadır. Çeşitli BIA yapısal iskeletleri işlevsel olarak farklılaşmalar geçirmektedir. Örneğin aromatik halka hidroksilasyonu veya üçüncül ya da dördüncül amin yapısını oluşturan N-metilasyonu farklı grupların oluşumuna yol açabilir. Hidroksil gruplarının varlığı veya eklenmesi O-metilasyon, O-asetilasyon ve metilendioksi köprü oluşumu ilerleyen reaksiyonların gerçekleşmesine olanak sağlar (Hagel ve Facchini,2013). Yine (S)-retikülin molekülündeki 3’-hidroksil grubu protoberberin N7-C8 köprüsünün oluşumu İçin kritik bir role sahiptir (Winkler ve ark., 2008).
25
Şekil 2.13. Haşhaş’da papaverin, sanguinarin, noskapin ve morfin oluşumunu gösteren önemli benzilizokinolin yolları (Dang ve ark., 2012’den değiştirilerek alınmıştır) . cDNA’ları izole edilmiş olan enzimler kırmızı renkte, biyokimyasal olarak karakterize edilmiş olanlar mavi renkte belirtilmiştir. Kutucuklarda bileşikler renklere gore altgruplara ayrılmıştır. Mavi, basit benzilizokinolinler; pembe, protoberberinler; kırmızı, protopinler; turuncu, benzofenantridinler; mor, fitalideizokinolinler; yeşil, protomorfinler; kahverengi, morfinler. Enzim tipleri renkli dairelerle gösterilmiştir. Buna göre: sarı, O-metiltransferaz; yeşil, N-O-metiltransferaz; kırmızı, P450 monooksigenaz; turuncu, FAD-bağlı oksidoredüktaz; açık mavi, NADPH-bağımlı redüktaz; koyu mavi, 2OG/Fe2+-bağımlı dioksijenaz; gri, asetil-CoA-bağımlı asetiltransferaz; beyaz, patogenezle ilişkili PR10 proteinini göstermektedir.
Biyosentez yolu temel olarak tirozin amino asidinin, hem dopamin hem de 4-hidroksifenilasetaldehit molekülüne tirozindekarboksilaz (TYDC) enzimi ile dekarboksilasyon, orto-hidroksilasyon ve deaminasyon basamakları ile başlar (Şekil 2.14) (Facchini, 2007). TYDC, L-tirozinin tiramine ve L-3,4-dihidroksifenilalaninin dopamine dönüşümünü katalizler. BIA üreten bitkilerde tiramin
4-26
hidroksifenilasetaldehite dönüşebilir (Rueffer ve Zenk, 1987). TYDC büyük bir gen ailesine sahiptir; yaklaşık 15 üyesi de haşhaşta bulunmaktadır (Facchini ve De Luca,1994). Dihidroksifenilalanin ve tirozini kendilerine karşılık gelen aminlere dönüştüren TYDC enzimi saflaştırılmış ve cDNA’sı klonlanmıştır (Facchini ve De Luca, 1994, Facchini ve ark.,2000). Ayrıca Park ve ark., (1999) tydc7 enzimini klonlamışlardır. Bu enzimin haşhaşta tydc2-benzeri alt aileye ait olduğunu, nükleotit ve amino asit seviyesinde %96 oranında benzerlik gösterdiğini belirlemişlerdir. Bunun yanı sıra tydc7’nin promoter analizlerinde 5’ ucundan -393 ve – 287 arasındaki 155 nükleotidlik bölgenin promoter aktivitesi için gerekli olduğu da bulunmuştur.
Dopamin, izokinolin kısmının öncülü iken tiraminin deaminasyonundan oluşan 4-hidroksifenilasetaldehit, benzil bileşeni olarak katılmaktadır. Monoterpenoit indol alkaloitleri (MIA) biyosentezinde olduğu gibi BIA biyosentezi de Pictet-Spengler (Luk ve ark.,2007) tip reaksiyondur ve sentez yolunun ilk kararlı adımı norkoklaurin sentaz (NCS) ile katalizlenir (Samanani ve Facchini, 2001). NCS, dopamin ve 4-hidroksifenilasetaldehiti birleştirerek C-C köprüsünün oluşumuyla (S)- norkoklaurini oluşturur dolayısıyla 1- benzilizokinolin ana yapısı da meydana gelmiş olur. (S)- norkoklaurin bitkilerde tüm BIA sentezi için merkezi öncül moleküldür (Stadler ve ark., 1987; Stadler ve ark., 1989). Bu enzim T. flavum’dan saflaştırılmış ( Samanani ve Facchini, 2001; Samanani ve Facchini, 2002) ve cDNA’ ları izole edilerek fonksiyonel olarak haşhaş (Liscombe ve ark., 2005) ve T. flavum’da (Samanani ve ark., 2004) tanımlanmıştır. NCS, patojen ilişkili protein (PR) 10 ve Bet v 1 allerjen protein aileleriyle akrabadır ancak BIA metabolizmasına has olup bilinen hiçbir enzimle homoloji göstermemektedir (Hagel ve Facchini,2013). Ayrıca haşhaştan alınan (PR)10 proteinlerinin homologları da katalitik olarak aktif değillerdir (Ziegler ve Facchini, 2008). Genellikle (PR)10 proteinleri bitkilerin mikroorganizma ve mantarlara karşı savunmasında yer alan proteinler olarak bilinmektedir (Chadha ve Das, 2006; Lee ve Facchini, 2010).
27
Şekil 2.14. BIA biyosentez yolu (Hagel ve Facchini, 2013’ten değiştirilerek alınmıştır.)(A) Haşhaşta temel alkaloit biyosentez yolları. (B) (S)-retikülinden berberin sentez yolu
(S)- Norkoklaurinin (S)-retikuline dönüşümü 6. pozisyondaki O-metilasyon, N-metilasyon, 3’-hidroksilasyon ve ikinci bir 4-O-metilasyonu içerir. Norkoklaurin 6-O metiltransferaz (6OMT) ve 3-hidroksi-N-metilkoklaurin 4-O-metiltransferaz (4-OMT) II. sınıf O-metiltransferazlardır ve sıkı bir bölge spesifik özellik göstermektedirler. Her
28
enzim için aynı kökenden gelen cDNA’lar haşhaş ve C. japonica’dan elde edilmiştir (Morishige ve ark.,2000; Ziegler ve ark., 2005). NCS enziminin yanı sıra sitokrom P450 (CYPs) gibi oksidoredüktaz enzimler de çeşitli BIA ana iskelet yapılarını oluşturmak için C-C veya C-O bağlarının oluşumunu katalizlemektedirler. Üç CYP ailesi BIA metabolizmasında anahtar oksidatif rol oynamaktadır (Hagel ve Facchini,2013). (S )-retikulin, çoğu BIA yapısal tiplerinin oluştuğu sentez yolunda, merkezi ara üründür. Sadece dimerik bisbenzilizokinolin alkaloitleri (S )-retikulin yoluyla üretilmezler. (S )-retikulinin ara ürün bileşiği olarak görev yapmadığı bir diğer biyosentez yolu ise papaverin biyosentezidir (Ziegler ve Facchini, 2008).
Laudanin yolu
(R, S) Retikulini, laudanine dönüştüren 7OMT enzimini kodlayan cDNA tanımlanmıştır (Ounaroon ve ark., 2003). 7OMT sınıf II tip bir protein ailesine ait olup metil vericisi olarak S-adenozil N-metiyonin (SAM) kullanır ve aktivite için metal iyonuna gereksinim duymaz. Kendilerine özgü substratlarına yüksek katalitik etkinlik gösterirken in vivo koşullarda hiçbir OMT enzimi diğer OMT enziminin substratını kabul etmez (Pienkny ve ark., 2009).
Papaverin yolu
Haşhaşta papaverin biyosentez yolağı halen netlik kazanmamıştır ancak çeşitli hipotezler mevcuttur. Papaverin sentezi için iki farklı yolak öne sürülmektedir. Birincisi norkoklaurinin 6OMT enzimi ile koklaurine dönüşümü ile başlamaktadır. (S)-norretikülinin N7OMT enzimi ile (S)-norlaudanine O-metilasyonu ve birkaç basamak ardından papaverin oluşumudur. Pienkny ve ark. (2009), norretikülin-7-O-metiltarnsferaz (N7OMT) adını verdikleri yeni bir O-metiltransferaz enzimi bulmuşlardır. Bu enzim sınıf II O-metiltransferaz protein ailesine aittir. Çalışma 6 adet
P. somniferum ve 15 farklı Papaver türünde gerçekleştirilmiştir. Papaver türleri
29
transkript profilleri çıkarılmıştır. Bu enzimin BIA biyosentezindeki O-metiltransferazlarla ilişkili olduğu ve 6-OMT enzimine amino asit dizisi bakımından %68 benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. İkinci yolak ise (S)-koklaurinden CNMT enzimi ile (S)-N-Metilkoklaurinin O-metilasyonlar ile laudanozine dönüşümü ile papaverin oluşumudur. Ancak bu yolla ilgili yapılan VIGS (Virus Induced Gene Silencing) çalışmaları birinci yolağı desteklemektedir (Penix ve Facchini, 2012).
Buna karşın Pathak ve ark. (2013), doğal papaverin mutantları ile yaptıkları transkriptom çalışmasında 6OMT, 4’OMTveN7OMT’nin fazla ifade olurken, 7OMT’nin ifadesinin azaldığını belirlemişlerdir. Buradan yola çıkarak papaverin biyosentezinin (S)-koklaurin üzerinden devam ettiği yani buyoldtaki ara ürünün (S)-koklaurin olduğunu gösteren sonuçlar elde etmişlerdir.
Noskapin yolu
Noskapin yoluberberin yoluile kısmen benzerlik göstermektedir. Yol (S)-kanadin molekülüne kadar ortak olmasına rağmen sanguinarin yolunda da görev alan tetrahidroprotoberberin cis-N-metiltransferaz(TNMT) enzimi (S)-kanadini metilleyerek (S)-N-metilkanadine dönüştürür. Bu yolda son ürün olarak noskapin oluşmaktadır. Ancak bu yolda ki biyosentez mekanizmasınetlik kazanmamıştır (Dang ve Facchini, 2012).
Benzofenanthridin ve protoberberin alkaloitlerinin biyosentez yolu
Papaveraceae, Fumariaceae, Berberidaceae familyalarının belli türlerinde
berberin, sanguinarin gibi sitotoksik benzofenanthridin alkaloitleri patojen ataklara karşı biriktirilir dolayısıyla fitoaleksinler gibi görev yaparlar. Benzofenanthridin alkaloitlerinin biyosentezindeki ilk basamak, (S )-retikülin molekülünün N-metil grubunun Berberin köprü enzimi (BBE) ile (S )-skoulerin molekülünün metilen köprü kısmına dönüşümüdür(Dittrich ve Kutchan, 1991). BBE enzimini kodlayan genler
30
California poppy (Dittrich ve Kutchan 1991) ve haşhaştan (Facchini ve ark. 1996b) izole edilmiştir.
Benzofenanthridin alkaloitlerinin biyosentezine önderlik eden veziküler bir bitki enzimi olan BBE (S )-retikülinin N-metil karbonundan (S)-skolerinin berberin köprü pozisyonundaki karbonun formasyonunu biyosentezyoluboyunca spesifik ve antiparalel reaksiyonlarla katalizler (Dittrich ve Kutchan, 1991). BBE, flavoprotein ailesinin bir üyesidir ve FAD’ın bağlanabilmesi için biri histidin diğeri ise sistein olmak üzere iki bölgeye sahiptir. BBE1’in 5’ bölgesinde -355 ile -200 arasında kalan 155 nükleotidlik bölgenin promoter aktivitesi için gerekli olduğu bulunmuştur (Winkler ve ark., 2008). RNA jel blot analizleri, kültüre alınmış haşhaş hücrelerinin yaralanması veya patojen elisitlerle muamelesinin TCYD7 ve BBE1 ekspresyonlarını indüklediğini göstermiştir (Park ve ark.,1999 ).
Sanguinarin yolu
Bu yol (S)-keliantifolin ve (S)-stilopin ile sonuçlanan iki metilendioksi köprüsünün oluşumu ile devam eder. Her iki reaksiyon da P450 bağlı monooksijenazlar tarafından katalizlenir. Stilopin sentaz enzimini kodlayan iki cDNA E. californica bitkisinden klonlanmış olup Cyp719A2 ve Cyp719A3 olarak sınıflandırılmıştır (Ikezawa ve ark.,2007). Rekombinant proteinler metilendioksi köprü oluşumunda benzer bölge spesifik özellik göstermektedir, ancak Cyp719A2, sadece keliantifolini (S)-stilopine dönüştürür. (S )-stilopin daha sonra TNMT enzimi ile N-metillenir (Liscombe ve Facchini 2007).
TNMT enzimini kodlayan cDNA, koklaurin cis-N-metiltransferaz (CNMT) enziminin homolojisine dayanılarak haşhaştan izole edilip işlevselliği tanımlanmıştır. TNMT, bitki alkaloit metabolizmasında dördüncül amonyum bileşiklerinin oluşumunu katalizleyebilen nadir bitki enzimlerinden bir tanesidir. Adomet (S-adenozil-L-metiyonin) bağlı N-metiltransferaz olup protopin ve benzofenantridin alkaloit biyosentezine dair moleküler ve biyokimyasal seviyede tespit edilen ilk enzimdir. Filogenetik analizler, proteinin koklaurin-N-metiltransferaz, Arabidopsis thaliana’nın
