Haşhaş bitkisindeki ilk fonksiyonel genomik çalışma Decker ve ark.(2000) tarafından yapılmıştır. Bu çalışmada 2D SDS-PAGE yapılarak latekste bulunan proteinler ve bunların peptid dizileri tanımlanmıştır. Daha sonra homoloji kullanılarak bu genler klonlanmış ve rekombinant proteinler elde edilmiştir.
P.somniferum’dan elde edilen BBE cDNA’sı, endüstriyel hat C048-6-14-64’e
antisens oriyentasyonla transforme edilmiş, bu bitkilerin transformasyonu PCR, Northern ve Southern hibridizasyon yöntemi ile değerlendirilmiştir. Transgenik bitkilerin, transgenin bir ek kopyasını taşıdığı belirtilmiştir. Lateks ve köklerdeki alkaloit içeriği HPLC ve LC-MS ile belirlenmiştir. Bütün biyosentez kollarında retikülin, laudanin, laudanozin, dehidroretikülin, salutaridin ve (S)-skolerin gibi çeşitli ara ürünlerin konsantrasyonunun arttığını gözlemlemişlerdir (Frick ve ark., 2004).
Millgate ve ark. (2004), morfin ve kodein öncülleri tebain ve oripavin biriktiren ancak morfin ve kodein biyosentezini tamamlamayan top1 olarak bilinen haşhaş mutantını tanımlamışlardır (Millgate ve ark., 2004). Yapılan çalışmada kültür haşhaşları bir mutajenle muamele edilmiş bitkilerin yavru döllerine bakılmıştır. Mutant bitkilerin tebain veya oripavin biriktirdiği ancak morfin veya kodein biriktirmediği bulunmuştur. 375 F2 bireyin açılımının sabit olduğu gözlenmiş dolayısıyla Mendel açılımına uygun ve tek genle ifade edildiği belirtilmiştir. Mutantta gözlenebilen tek fenotipik değişiklik, lateksin normal beyaz görüntüsünden daha koyu olması olduğu bildirilmiştir, yani pigmentasyon fazladır. Lateksteki renk değişiminin tebain fenotipik bir markör olduğunu belirtmişlerdir.
Zeiger ve ark. (2005) P.somniferum ve morfin yerine diğer benzilizokinolin alkaloitlerini üreten 8 Papaver türünün doku kültürlerinde türler arasındaki ifade farklarını bulmak için AFLP tekniği tekniğine dayanan makroarray çalışması yapmışlardır. BlastX analizleri sonucunda unigenlerin %50 si fonksiyonel olarak kategorilere ayrılamamıştır. Kategorilere ayrılanların ise %16’sı metabolizmadaki proteinleri kodlayan unigenler, %11,6’sı hücre büyümesi bölünmesi ve protein sentezinden sorumlu unigenler, %5,9’u hücresel iletim/sinyal iletimini kodlayan genler ve bunların yanı sıra stres cevabı ve redoks kontrolünden sorumlu genler olduğunu belirlemişlerdir. Total transkript incelendiğinde benzer bir dağılım olduğu tek belirgin
44
farklılığın fotosentezde görev alan proteinlerde görüldüğünü bildirmişler ve bunun sebebi olarak ta muhtemelen klorofil a/b bağlanma proteinlerini ve rubisko aktivazı kodlayan dizilerin yüksek olduğunu göstermişlerdir.
P. somniferum’da fungal elisitörle indüklenmiş haşhaş hücre kültüründe gen
transkriptleri ve metabılit profillerinin çıkarılması ile ilgili yapılan çalışmada cDNA kütüphanesinden izole edilen 10.224 tesadüfi klondan EST veri tabanı oluşturulmuş ve en fazla bulunan EST’lerin savunma cevabı proteinleri, BIA enzimleri ve S- adenozilmetiyonin bağlı metil transferazları ve fenilpropanoid biyosentezinde yer alan transkriptler olduğu bulunmuştur. En fazla artışın BIA enzimleri ve savunma proteinlerinin transkriptlerinde olduğu belirlenmiştir. Bilinen bütün sanguinarin biyosentetik gen transkriptlerine ek olarak primer metabolik enzimleri kodlayan genlerde de artış meydana gelmiştir. Elisitör ile muamele edilmiş haşhaş hücre kültürü veri tabanından rastgele 6.048 cDNA seçilerek mikroaray kurularak hücrelerin transkript profilleri belli zamanlara toplanmış ve kontrollerle karşılaştırılmıştır. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında elisitör eklendikten 1 saat sonraki hücre kültürlerinden elde edilen gen transkriptlerinde ciddi manada hızlı bir artış göstermiştir. Transkript birikimindeki değişimin miktarı ve büyüklüğü elisitör eklendikten 5 ila 30 saat sonra en yüksek seviyelere çıkmıştır. Elisitör muamelesinden 12 saat sonra çoğu transkriptin seviyeleri 0. saat transkript seviyeleri ile karşılaştırıldığında adım adım azalmasına rağmen artanların sayısı azalanların sayısından belirgin bir şekilde daha fazladır. Bu transkriptlerin yanı sıra şeker katabolizması, şikimat yolağı ve aromatik amino asit metabolizması gibi primer metabolizmada görevli mRNA’larında elisitör muamelesi sonucunda indüklendiğini bildirmişlerdir (Zulak ve ark., 2007).
P.somniferum bitkisinde RNAi kullanılarak COR enziminin fazla ifadesi (over-
ekspresyonu) ile morfinan alkaloitlerinin arttırılması hedeflenmiştir. Hem serada hem de tarlada yetiştirilen transgenik hatların kapsüllerindeki alkaloit miktarlarında 4 yıl sonra belirgin bir artış gözlenmiştir. Kuru ağırlık bazında değerlendirilen alkaloit içerikleri, yüksek verimli genotipleri ve transgenik olmayan kontrol gruplarından %15 ile %30 arasında daha yüksek bulunmuştur. Toplam alkaloit miktarındaki artış, morfin, kodein ve tebain miktarındaki artışa bağlanabilir. COR enziminin miktarının artmasıyla birlikte morfin ve kodeinde artış beklenebilir ancak tebaindeki artış tahmin edilmeyen bir durumdur. Çünkü tebain oluşumu COR enziminin aktivite göstermesinden önce
45
gerçekleşmektedir. Tebain miktarındaki artışın sebebi morfin ve kodein miktarının artması sonucunda demetilasyon basamaklarının feedback inhibisyonu ile sonuçlanması ya da tebainin morfin ve kodein biriktiren veziküllere geçişinin engellenmesi olabileceğini belirtmişlerdir (Larkin ve ark., 2007).
SalAT gen ekspresyonunun düzenlenmeside haşhaşın alkaloit içeriğinde
değişikliklere sebep olmuştur. SalAT transgeninin aşırı ifadesi tüm alkaloit içeriğini yaklaşık %40 oranında arttırmıştır. Diğer taraftan SalAT transkriptlerinin normal seviyenin yaklaşık onda biri kadar RNAi ile susturulması salutaridin molekülünün beklenmeyen birikimiyle sonuçlanmıştır. Bu olay SalAT’ın substratı olan salutaridinolün, tekrar geri dönüşümlü çalışan SalIR enzimi ile salutaridine dönüşümü olarak açıklanabileceğini belirtmişlerdir (Allen ve ark., 2007).
Desgagné-Penix ve ark. (2010) fungal elisitör ile muamele edilmiş haşhaş hücre kültürlerinden farklı zamanda alınan örnekler ile cDNA kütüphanesi oluşturarak 454 GS-FLX Titanyum pirosekanslama ile transkriptom profilini belirlemişlerdir. Örneklerde retikülin, protopin ve sanguinarin içerikleri belirlenmiştir. retikülin tüm zaman dilimlerinde az seviyede belirlenmiş ancak bu ortak ara ürünün seviyesi elisitör uygulamasından 50 saat sonra azalmıştır. Uygulamanın başlangıç zamanlarında protopin ve sanguinarin belirlenememiştir ancak sonraki zaman dilimlerinde her iki alkaloit miktarında da artma olmuştur. Sanguinarin birikimi 10 ve 50 saat sonra gerçekleşmiştir. 100. saatte sanguinarin seviyesi retikülin veya protopin seviyesinden 40 kat daha fazla bulunmuştur. Pirosekanslama ile oluşturulan transkript veri tabanında ise ortalama 462 bç uzunluğunda 427,369 yüksek kaliteli EST elde edilmiştir. 93,723 unigenden 37,329 (%39,8) tanesi 2 veya daha fazla kontig içerirken 56,934 tanesi tek unigen dizisine sahiptir. BLASTX analizleri sonucunda 73,496 tanesi bilinen genlerle benzerlik gösterirken 20,227 tanesi bilinen hiçbir genle benzerlik göstermemediği belirtilmiştir. Savunmada yer alan kitinaz, β-laktamaz, polifenol oksidaz, ksiloglukonaz inhibitörü, peroksidaz ve PR proteinlerini kodlayan transkriptlerinde bol bulunduğu bildirilmiştir.
WRKY genleri sadece bitkilerde bulunan bir transkripsyon faktörü ailesini kodlamakta olup hem abiyotik hem de biyotik stresler sırasında aktif hale gelerek stres genlerinin ekspresyonunu düzenlemektedirler. Çeşitli biyosentetik genlerin regülasyonunda yer alan C. japonica bitkisinden izole edilmiş WRKY proteinini
46
(CjWRKY1) kodlayan cDNA’nın tanımlanması BIA metabolizmasında ilk keşfedilen transkripsiyonal regülatördür (Larkin ve ark., 2007). Mishra ve ark. (2013), haşhaş bitkisinde yaralanma ile indüklenen PsWRKY olarak isimlendirdikleri EST belirlemişlerdir.
Ünver ve ark. (2010), EST veri tabanında bulunan 16 miRNA ailesine ait 20 tane korunmuş miRNA’yı haşhaş bitkisinde tanımlamışlardır. Haşhaşta yer alan ve alkaloit sentez yolağı ile ilişkili miRNA’ların saptanması amacıyla bitkinin çeşitli dokularına ait küçük RNA kütüphaneleri yüksek işlem hacimli Illumina Solexa teknolojisi ile dizilenerek farklı doku örneklerinden izole edilen RNA’lar ile miRNA mikroarrayi uygulaması yapılmıştır. Haşhaş bitkisinde, alkaloit sentez mekanizmasının regülasyonunu sağlayan 23 adet miRNA bu çalışma kapsamında tespit edilmiştir. Bu miRNA’lardan pso-miR13 ve pso-miR408’ in doğrudan alkaloit sentezinde yer alan genleri hedeflediği belirlenmiştir (Böke, 2013).
47