Bitkiler çiçek açıp petallerini döktükten 2 gün sonra (post anthesis) MeJa uygulaması yapılarak morfin, kodein, tebain, laudanozin, noskapin ve papaverin miktarları HPLC-ToF MS ile ölçülmüştür. Alkaloitlerin alındığı doku, büyüme şartları ya da indükleyiciler alkaloit içeriğine etki etmektedir dolayısıyla ekspresyon çalışmalarında alkaloit içeriği önem taşımaktadır (Facchini, 2001; Ziegler ve ark., 2006). Metabolit profilindeki değişmeler 0USS, 3USS ve 12USS’de bulunmuş ve mikroarray analizleri bu saatler üzerinden yürütülmüştür.
JA ve metil esteri MeJA gen ekspresyonunu düzenlenmesinde ve bitki hücrelerinde sekonder metabolit biyosentezinin uyarılmasında rol oynadığıbilinen sinyal molekülleridir (Pauwels ve ark., 2008). MeJa Polygonum minus, (Su-Fang ve ark., 2013), Artemisia annua (Zare Mehrjerdı ve ark., 2013) gibi bitkilerde ve haşhaş bitkisinin hem fideleri hem de hücre kültürlerinde (Facchini ve ark.,1996a; Huang ve Kutchan, 2000; Zulak ve ark., 2009; Mishra ve ark.,2013) başarılı bir şekilde uygulanmış metabolom ve transkriptom profilleri çıkarılmıştır. Ancak MeJa uygulaması yapılmış haşhaş kapsülüne ait transkriptom profili bugüne kadar çıkarılmamıştır. Bu çalışmada 95 608 DNA probu kullanarak MeJa uygulaması sonucunda 0USS, 3USS ve 12USS’de hasat edilen haşhaş kapsülünde gen ifade değişimleri genom seviyesinde analiz edilmiştir.
Çalışma sonucuna göre stres cevabı ve uyarılara cevap ile ilişkili ifadesi değişen transkriptlerin sayısı yüksek çıkmıştır (Şekil 4. 28). Patojen stresi ile abiyotik stres arasında sıkı bir ilişki vardır. Patojen saldırılarıhem fiziksel stres hem de elisitör tarafından üretilen stresin bir birleşimidir dolayısıyla enfeksiyone sebep olabilecek bir patojen saldırısında, patojen tüm faktörler için bitki cevabını en aza indirmek isteyecektir (Farmer, 2000; Reymond,2001). Bundan dolayı yapılan çalışmada stres toleransı ile sıkı bir ilişkisi olan ABA (Park ve ark., 2008; Su-Fang ve ark., 2013) veya oksin (Navarro ve ark., 2006; Fu ve Wang, 2011) gibi hormonlara karşı bir cevap oluşturulmasının yanı sıra antioksidan aktivite, osmotik stres, besin stresi gibi yanıtlar da alınmıştır. Bununla birlikte antioksidan özellik gösteren manganez suproksit
106
seviyesi 0USS’de kontole göre artarken 12USS’de, 3USS’ye göre bakır çinko suproksit
dismutaz ve süperoksit radikallerinin uzaklaştırılması ile ilişkili transkriptlerinin ifade
seviyesi azalmıştır. Ayrıca katalaz, askorbat peroksidaz grubu ile ilgili transkriptlerinde ifade seviyelerinde değişme olmuştur. Bu sebeple MeJa uygulaması stres ile ilişkili yolakları başarılı bir şekilde uyarmıştır.
En fazla indüklenen alkaloitler morfin ve noskapin iken en az indüklenen alkaloit ise papaverindir. Kontrol gruplarındada en fazla bulunan alkaloit morfin ve noskapindir ancak papaverine rastlanmamıştır. Papaverin diğer morfinan alkaloitleri gibi latisferlerde bulunmasına karşın çoğu haşhaş çeşitinde az miktarda sentezlendiği bilinmektedir (Pathak ve ark., 2013). Shukla ve Singh (2001), haşhaş ile yaptıkları çalışmada, bitkinin farklı gelişim evrelerinde alkaloit miktarlarını ölçmüş ve bitkiler petallerini döktükten sonra kapsülde en fazla morfin ve noskpine rastlarken papaverin alkaloitinin bulunmadığını bildirmişlerdir. Kontrol grubunda belirlediğimiz alkaloit miktarları bu çalışma ile paralellik göstermektedir.
Kapsül dokusunda morfin miktarında 0USS ve 12USS’de kontrole göre yaklaşık 2 katlık bir artış gözlenirken 3USS’de yaklaşık 1,3 katlık bir artış belirlenmiştir. Oysa ki kapsül dokusunda sadece yaralanma yapıldığında 5.saatte morfin miktarı kontrole göre azalmıştır (Mishra ve ark.,2013). Yaralanma ile birlikte MeJa uygulaması, miktarı ölçülen tüm alkaloitlerin oluşumunu indüklemiştir. Stres durumunda morfinin dimeri olan bismorfine dönüştürüldüğü Morimoto ve ark. (2001), tarafından belirlenmiştir. Bundan dolayı 3. saatte morfin miktarındaki azalış bu durumla ilişkilendirilebilir.Fungal elisitör ile indüklenmiş hücre kültürlerinde ise sanguinarin birikimi gözlenirken kontrol grubuda dahil olmak üzere hücre kültürlerinde morfin birikimine rastlanmamıştır (Zulak ve ark., 2007; Facchini ve Park, 2003). Bu durum hücre kültüründe alkaloitlerin bol olarak bulunduğu latisfer dokusunun yer almaması ile açıklanabilir.
Benzilizokinolin alkaloit sentezinde mikroarray sonuçlarına göre NCS, CNMT,
SalR, OMT, COR, CAS, CheSyn ve StySyn genlerinde ifade değişimleri belirlenmiştir.
Hücre doku kültürünün fungal elisitör ile indüklenmesi ise CYP80B1ve BBE gen ifadesi seviyelerini arttırdığı ancak COR gen ifadesi seviyesinin kararlı bir şekilde az seviyede sabit kaldığı bildirilmiştir (Alcantara ve ark., 2005).
107
NCS enzimi, BIA biyosentezinde ilk kararlı basamağı katalizlemektedir (Samanani ve Facchini, 2001). Elde edilen verilere göre NCS geninin transkript ifade seviyesi 0USS’de kontrole göre 1,82 katlık bir artış göstermiş, morfin miktarında da yaklaşık 2 katlık bir artış olmuştur. Bununla birlikte 3USS’de 0USS’ye göre ifade seviyesinde 2,17 katlık bir azalma görülürken morfin miktarı da yaklaşık olarak yarıya düşmüştür. Lee ve Facchini (2010) haşhaşta NCS geninin susturulmasının morfin, kodein, tebain, noskapin ve papaverin alkaloitlerinin seviyelerinde azalmaya sebep olduğunu ifade etmişlerdir. Çalışmamızda ise; SalR ve NCS genlerine ait transkriptler 0USS’de ifadesi en fazla artan transkriptlerden iken 3USS’de ifadesi en fazla azalan transkriptlerdendir. NCS ve SalR genlerinin ifade seviyelerindeki değişim morfin miktarı ile korelasyon göstermektedir ve her iki transkriptteki ifade değişimi qRT-PCR ile desteklenmiştir. Benzer şekilde SalR geninin ifade seviyesi de 0USS’de kontrole göre 2,39 katlık bir artış gösterirken 3USS’de 0USS’ye göre 2,47 katlık bir azalma göstermiştir. Bu durum her iki enziminde MeJa uygulaması sonucunda oluşan streste kapsül morfin miktarındaki değişimle ilişkili kilit enzimler olabileceğini düşündürmektedir.
NCS patojen stresinde görev alan PR10/Bet v1 allerjen protein ailesinin bir
üyesidir ve PR10/Bet v1 ile haşhaşta bulunan major lateks proteini ile homoloji gösterdiği bildirilmiştir (Osmark ve ark., 1998). Ancak major lateks protein ile ilişkili transkriptlerin ifade değişimleri NCS transkriptlerinin ifade seviyesi ile tezatlık göstermektedir. 0USS’de kontrole göre 1,80 katlık bir azalma gösterirken aynı transkriptin 3USS’de ki ifade seviyesi 2,57 artmış olarak belirlenmiştir.
BIA biyosentez yolunda COR enzimi morfin oluşumunu sağlayan enzimlerden birisi olup, substrat olarak morfinon ya da kodeinonu kullanmakta (Unterlinner ve ark., 1999) ve tebain alkaloitinin oluşumundan birkaç basamak sonra görev almaktadır (Şekil 2.8). Çalışmada COR transkriptinin ifade seviyesi ile tebain miktarı arasında 0USS’de kontrole göre ters ilişki bulunmuştur. Kontrole göre 0 USS’de, 3 USS’de ve 12 USS’de tebain miktarı anlamlı bir şekilde artış göstermiştir. 3 USS’de morfin miktarı 0USS’ye göre azalmasına rağmen tebain miktarındaki artış devam etmiş 12USS’de morfin miktarı artarken tebain miktarı 3USS’ye göre azalmıştır (Şekil 4.1). Kodein miktarında 0 USS’de ki artış beklenmedik bir durum gibi gözükse de tebainden morfin oluşumunda iki farklı yerde COR görev aldığı için reaksiyon yön değiştirmiş olabilir. Bu da
108
tebainden morfine giderken kontrol noktası olabileceğini ya da tebain birikimini düşündürmektedir. Gen ekspresyonu ve alkaloit içeriği arasında bir uyumluluk bulunmaktadır (Şekil 4.1 ve Şekil 4.26). Larkin ve ark. (2007), COR geninin aşırı ifade ettirildiği transgenik bitkilerde morfin, kodein ve tebain oranının gövde de arttığını bildirilmişlerdir. Morfin ve kodein miktarındaki artışın beklendik bir durum olduğunu ancak tebain miktarındaki artışın beklenmediğini bu durumunda ancak morfin ve tebaindeki artışın demetilasyon basamaklarında negatif geri besleme ile tebainin morfin ve kodeinin biriktirildiği veziküllere taşınması ile olabileceğini öne sürmüşlerdir. Bu tez kapsamında yapılan çalışmalarbu durumu ve negatif geri beslemeyi desteklemektedir.
SAM biyosentezinde yer alan enzimlerden metiyonin sentaz enzimine ait transkriptin ifade seviyesi kontrol grubuna göre 0USS’de azalmış ancak 0-3. saat diliminde anlamlı bir değişim gözlenmezken 12USS’de bu gene ait transkriptin ifade seviyesi artmıştır. Yine SAM molelekülünü metil vericisi olarak kullanan katekol O-
metil transferaz ve CNMT (Şekil 4.26) transkriptlerinin ifade değişimleride anlamlı
bulunmuştur. 0 USS’de katekol O-metil transferaz transkriptinin ifade seviyesi artarken 3USS’de hem katekol O-metil transferaz hem de CNMT transkriptlerinin ifade seviyeleri düşmüştür. 12USS’de bu transkriptlere ait herhangi bir değişim belirlenememiştir. Oysa Zulak ve ark (2007), elisitör ile muamele edilen haşhaş hücre kültürlerindenelde ettikleri cDNA kütüphanesinde bu enzimlere ait EST’leri oldukça fazla bulmuştur.
3USS’de 0USS’ye göre norcoclaurine 6-O-methyltransferase (6-OMT) genine ait saptanan transkriptin ifade seviyesi (1,82) olup, bu seviye alkaloit biyosentezi ile ilşkili transkriptler arasında en yüksek değerdir. Fungal elisitör ile indüklenmiş haşhaş hücre kültürlerinde de 6-OMT genine ait transkriptin indüklendiği ve enzim miktarındaki değişimle uyumluluk gösterdiği bildirilmiştir (Zulak ve ark., 2009).
Zulak ve ark., (2007), elisitör ile indüklenmiş haşhaş hücre kültürlerinde uygulamadan 1 saat sonra gen transkript sayılarında önemli bir artış belirlemişler ancak 0USS’de belirgin bir artışa rastlamamışlardır. Bizim çalışmamızda 0USS’de kontrole göre oldukça fazla transkriptte ifade değişimine rastlanmıştır (Şekil 4.4) . Bu durum hücre kültürlerinde doku farklılaşmasının olmaması ya da sistemik direncin gelişmemiş olmasından kaynaklanıyor olabilir. Hücre kültürlerinde patojene karşı verilen cevap
109
daha yavaş ve daha uzun sürmesine rağmen olgun bir bitkide patojene verilen cevap daha hızlıdır.
Facchini (2008), endoplazmik retikulum organelinin alkaloit oluşumu için tercih edilen bölge olmasına rağmen biyosentez enzimleri kloroplast tilakoid membranlarında, mitokondrilerde, vakuollerde ve sitozolde bulunduğunu bildirmiştir. Bizim çalışmamızda hücresel kısımla ilgili transkriptlerin büyük çoğunluğu kloroplast, mitokondri ve vakuolde çıkmış olduğu için bu durum desteklenmektedir. Ancak golgi ile ilşkili transkriptlerin sayısı ve ifade değişimleri taşınım veya modifikasyonda bu organelinde görev alabileceğini düşündürmektedir (Şekil 4.30) çünkü 0USS- kontrol zaman diliminde hücresel organizasyonda çıkan transkriptlerin %26’sı golgi organeli ile ilişkilidir ve transkriptlerin %83’ünün ifade seviyesi artmıştır ( Şekil 4.8).
Sanguinarin biyosentezi ve taşınımının elisitör ile indüklenmiş hücre kültürlerinde endoplazmik retikulum (ER) ile ilişkili vakuoller aracılığıyla olduğu ve sinyal peptitinden yoksun, çözünebilir bir protein olan COR enziminin lokalizasyonun sitozol daha önceki çalışmalar ile belirlenmiştir. Ancak bu çalışmada benzilizokinolin alkaloitlerinin sitotoksisitelerinden dolayı bunun beklenmeyen bir durum olduğu da belirtilmiştir (Alcantara ve ark., 2005). Hücre kültürlerine nazaran bitkide doku farklılaşması olduğu için alkaloitlerin birikimi, sentezi veya taşınması farklı hücre gruplarınca gerçekleştirilmektedir dolayısıyla hücre dışına sekresyon söz konusudur bu durumda her ne kadar doku kültürlerinde golgi aracılı taşınım görülmese de bitki de golgi organelinin görev almayacağı anlamına gelmeyebilir. Hücre doku kültürlerinde ER ilişkili biyosentez belirlenmesine rağmen mikroarray sonuçlarında ER ile ilgili transkriptler çok az sayıda çıkmıştır.
Patojen stresinde JA, SA, etilen hormonlarının cevap oluşturduğu bilinmektedir. (Schenk ve ark., 2000; Turner ve ark., 2002; Gazzarrini ve McCourt, 2003; Rojo ve Solanao, 2003). Mikroarray sonuçlarına göre hormonal düzenleme ile ilgili transkriptlerin sayısı en fazla 3USS’de daha sonra 0USS’de ve en az 12USS’de belirlenmiştir (Şekil 4.28). Bu sonuçlar doğrultusunda bitki hormonal olarak en fazla tepkiyi 3USS’de vermektedir.
Bu çalışmada, JA, SA ve etilen hormonları 0USS ve 3USS’de korelasyon göstermesine karşın 3USS’ye göre 12USS’de JA ile ilşkili transkriptin ifade seviyesi azalırken SA ile ilşkili transkriptin ifade seviyesi artmış, etilen ile ilşkili anlamlı bir
110
veriye rastlanamamıştır. Bu durumda üç hormonunda belli bir zaman dilimine kadar uyumlu çalıştıkkları ancak daha sonra farklı ifade gösterdikleri düşünülebilir. 12USS kontrol arasında ise JA ve SA ile ilşkili transkriptlerin tümünün ifade seviyesi artmıştır. Bu çalışmada aynı zamanda oksin ve ABA ile ilşkili transkriptlere de rastlanmıştır. Özellikle 3USS’de en fazla transkript oksin hormonuna aittir. Yukarıda da belirtildiği üzere bitki patojen stresine maruz kalsa dahi kendini koruma altına almak için tüm uyarılara karşı cevap oluşturacaktır. Brassinosteroit hormon cevabı ise yine en fazla 3 USS’de belirlenmiştir. Belirlenen 5 transkriptten %80’inin ifade seviyesi düşmüştür. BR’de patojenle indüklenmde görev alan bir hormon olarak bilinmektedir (Bajguz ve Tretyn, 2003). Tüm hormonlara ait transkript sayısı en fazla 3USS’de belirlenmiştir. Hormonlar hücre zarı yoluyla sinyal iletim mekanizmalarını başlatmaktadırlar. Bizim çalışmamızda yine hücre zarı ile ilşkili transkript sayısının 3USS’de en fazla olduğu görülmektedir. Buna göre hücre zarının 3USS’de aktif olma sebeplerinden biriside hormonal sinyal iletimi olabilir.
Olgun bitki hücreleri için yanıt, fizyolojik ve biyokimyasal olurken, büyüyen hücreler için ise morfolojik ve gelişimsel olabilir. Sinyal iletim bilgisinin değişik yapıların farklı şekillerde bir araya gelmesi ve bu bilgilerin sentez edilip son yanıtın belirlenmesinde büyük önem taşımaktadır (Keskin, 2012). Yapılan çalışmada büyüme ve gelişme ile ilişkili ifadesi değişen transkript sayısının fazlalığı göze çarpmaktadır. Özellikle en fazla transkript diğer zaman dilimlerine göre 3USS’de belirlenmiştir (Şekil 4.28). JA hormonunun da bitkilerde büyüme ve mitoz bölünme üzerinde negatif yönde etki ettiği bilinmektedir (Noir ve ark., 2013).
SA iletim yolağının doğal bağışıklık olarak patojen saldırısında PD’nin kapanmasını düzenlenlediği Arabidopsis thaliana bitkisinde belirlenmiştir (Lee ve Lu, 2011; Wang ve ark., 2013). 0USS’de SA aracılı sinyal iletim yolağı ile ilşkili transkriptin ifadesi 1,68 oranında artmış hücresel yapıda bulunan PD ile ilşkili transkriptlerde ise 8 tanesinin ifadesi azalırken sadece 3 transkriptin ifade seviyesi artmıştır. İfade seviyesi artan ranskriptler metakaspaz tip II, hipersensitif-indüklenen
cevap proteini 2 ve adomet dekarboksilazdır. Kallozun sentezinden ve birikiminden
sorumlu kalloz sentaz (1,80) ve kalsineurin b-benzeri protein 1 (1,68) transkriptlerinin de ifade seviyesi artmıştır. 0 USS’ye göre 3USS’de ise sadece kalsineurin b- benzeri
111
3USS’de PD ile ilşkili transkriptlerden 2 tanesi azalırken 8 tanesi artmıştır. SA aracılı sinyal iletim yolağı ile ilşkili transkriptlerin ifade seviyeleri de azalmıştır. Bu durumda SA sinyal iletim yolağı ile plazmodezma aktivitesi arasında ters bir ilişki olduğu bizim çalışmamızla da desteklenmiştir. Ayrıca 60S ribozomal protein ailesine ait transkriptlerin oranında da 0USS’de azalma belirlenmiştir. 12USS’de bu transkriptlerin ifade değişimleri gözlenmemiştir. MeJa ile indüklenen bitkide kalloz oluşumu ile ilgili transkriptlerde hızlı bir şekilde indüklenmiş ve 3. saat sonunda bitki cevabını sonlandırmıştır. Bu durum bitkinin, 3. saat sonunda stres cevabını hücre duvarı bazında büyük oranda tamamladığını gösteriyor olabilir. Şekil 4.30’da görüldüğü gibi hücre duvarı ile ilişkili transkriptlerin sayısı 3USS’de 0 USS’ye göre azalmıştır.
HSP90 ve HSP70 proteinlerinin stres cevabının oluşmasında rol aldığı bilinmektedir (Boston ve ark., 1996;Kadota ve Shirasu, 2012). Stresle indüklenme sonucunda katlanmamış proteinlere karşı cevap oluşturan HSP70 proteinleri elisitör ile muamele edilmiş haşhaş hücre kültürlerinde belirlenmemiş (Zulak ve ark., 2009) ve hücre kültürlerinde protein katlanmamasına karşın cevap oluşmadığı ya da HSP70 proteinlerinin aktive olmamış olabileceği düşünülmesine rağmen kapsül dokusunda
HSP70 kda proteinine ait transkriptin ifade seviyesi 3USS’de 2,08 kat artarken, 12
USS’de aynı transkriptin ifade seviyesi 1,87 düşmüştür. HSP70 transkriptleri gibi
HSP90 proteinine karşılık gelen transkriptin ifade seviyesi de 3USS’de 0USS’ye göre
1,66 artış gösterirken 12USS’de 1,81 kat azalma göstermiştir. Bu iki proteinin ifade seviyelerinin fungal elisitör ile muamele edilen limon pamukçuklarında değişmediği ancak biberde değiştiği belirlenmiştir (Garavaglia ve ark., 2009), aynı şekilde domates bitkisinde sıcaklık stresinde her ikisinin de ifadesinin değiştiği bildirilmiştir (Hahn ve ark., 2011). Haşhaş bitkisinde de patojen stresinde bu iki proteine ait transkript seviyelerinin 3USS ve 12 USS’de ki ifade değişimleri birlikte çalıştığını düşündürmektedir. Daha önce de belirtildiği üzere çoğu biyolojik işlevde 3USS’de ki indüklenen transkript sayısının fazla olduğu belirlenmiştir.
Giorno ve ark., (2013), patojenle enfekte ettikleri elma kültürlerinde şeker metabolizması ve ısı şok proteini 70 ile ilşkili biyokimyasal ve transkripsiyonel değişimlerin olduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışmada karbohidrat metabolizması ile ilşkil transkript sayısı en fazla 3USS’de belirlenmiştir. 0USS’de ifade seviyesi en fazla artan transkriptlerden birisi de sitrat sentaz (2,19) ve vakuolar invertaz (2,09) enzimlerine
112
aittir. Patojen saldırısı ile fotosentez ile ilşkili transkript seviyelerinin azalmasına karşın karbonhidrat metabolizmasına ait solunum reaksiyonlarının arttığı belirlenmiştir.
Solunum sonucu açığa çıkan heksozlar bitkide sinyal iletimine yol açmaktadır (Berger ve ark., 2007). 3USS’de ve 12USS’de bu proteine ait farklı bir ifade değişimi gözlenmemiştir. Fungal elisitörler ile indüklenmiş haşhaş hücre kültürlerinde yapılan proteomik çalışmada da belirlenen proteinlerin büyük kısmının glikoliz ve TCA siklusunda görev alan enzimlere ait olduğu belirlenmiştir (Zulak ve ark., 2009).
Bu çalışmada, 0USS’de kontrole göre ifadesi en fazla değişen transkriptlerin
klorofil a b-bağlanma apoprotein cp26 öncülü (-2.41) ve kloroplast klorofilışık-toplama a b-bağlanma proteini (-2,29), ışık-toplama kompleks II protein lhcb1 (-1,81)
transkriptleri olduğu belirlenmiştir. Biyotik streste bitkide kloroplast ışık-toplama a/b bağlanma proteinlerinin çok çeşitlilik göstermesine rağmen fotosentez ile ilişkili transkriptlerin neredeyse tümünün ifadesi azaldığı dolayısıylabu cevabın pigment sentezi ve elektron taşınımım ile ilgili genlerin etkilendiğinin göstergesi olduğu bildirilmiştir (Bilgin ve ark., 2010). Ayrıca Fotosistem I (PSI), Fotosistem II (PSII) reaksiyon merkezleri ve PSII ile ilşkili anten kompleksine ait genlerin ifadesinin pek çok bitkide azaldığı belirtilmiştir (Berger ve ark., 2007; Bilgin ve ark., 2010).
3USS’de ise en fazla artış kloroplast klorofil a b-bağlanma proteini proteinine ait transkriptin seviyesinde belirlenmiştir. 12USS’de 3USS’ye göre kloroplast klorofil a
b-bağlanma ve klorofil a b bağlanma proteinlerine ait transkriptlerin ifade seviyerinde
artma devam etmiştir. Bu durumda bitki patojen ile indüklendiğinde en fazla tepki gösteren sistemlerden bir tanesi de fotosentez mekanizmasıdır. Hücresel yapılar incelendiğinde de en fazla transkript kloroplast (şekil 4.30) organelinde çıkmıştır ancak zaman dilimlerine baktığımızda en az transkript 0USS’de en fazla transkriptte 3USS’de bulunmaktadır. Bununla birlikte fotosentezin azalmasına rağmen fotorespirasyon ile ilşkili transkriptlerin ifade seviyesi 0USS’de artmış, 3USS’de azalmış 12USS’de yeniden azalmıştır. Bu durum patojen saldırısın bitkiyi fotosentez reaksiyonlarından fotorespirasyona kaydırdığını dolayısıyla patojen stresinde ürün kaybının sebeplerinden birisinin de fotosentez yerine fotorespirasyon yapılmasından kaynaklanabileceğini göstermektedir.
113
Gen regülasyonu ökaryotik canlılarda histon modifikasyonları ile sağlanabilmektedir. Bitkilerde de abiyotik (Sridha ve Wu, 2006; Ding ve ark., 2009) ve patojen (Kim ve ark., 2008; Wu ve ark., 2008) stresi koşulları altında histon modifikasyonu olduğu ile ilgili çalışmalar yapılmıştır (Luo ve ark., 2012). Mikroarray verilerine göre histon H3, H3K9 metilasyonu, histon deasetilasyonu/asetilasyonu gibi modifikasyonlar ile ilşkili transkriptlerin ifade seviyelerinde değişmeler görülmüştür. Jaskiewicz ve ark. (2011) yaptıkları çalışmada patojen enfeksiyonunun savunma proteinlerini kodlayan genlerin promotörlerini etkilediğini belirtmiştir. Elde ettiğimiz veriler histon metilasyonunun stres uygulamasından hemen sonra gerçekleştiğini göstermektedir.
Histon deasetilaz genlerinin ekspresyonu stres cevapları arasında yer almaktadır ve SA, JA veya ABA gibi stresle ilişkili hormonlar tarafından düzenlenmesini sağlanmaktadır. Yapılan çalışmalar histondeasetilazların hormon sinyal iletim yolağında görevli olabileceğini göstermektedir (Fu ve ark., 2007; Hu vet ark., 2009).Bu durumda 3 USS’ye kadar histon metilasyonu ve deasetilasyonunun görülmesi, 12USS’de ise histon metilasyonunun azalması ve asetilasyonunun artması haşhaşta da histon modifikasyonlarının patojen stresinde oluşturulan cevapta yer aldığını göstermektedir.
Yapılan qRT-PCR çalışmasının sonuçları verilerimizin büyük bir kısmını desteklemektedir. Bazı zaman dilimlerinde tezatlıklar ortaya çıkmıştır ancak qRT-PCR sonuçları genellikle gen spesifik olduğu için doğrudur fakat mikroaray hibridizasyona dayalı olduğu için ya da farklı gen aileleri bulunabileceğinden dolayı her zaman sonuçlar uyumluluk göstermemektedir (Koia ve ark., 2012).
Bu çalışma ile haşhaş bitkisinin kapsülünde patojen stresine karşı oluşturulan tepki transkriptomik seviyede belirlenmiştir. Bundan sonraki çalışmalarda ifade değişimleri anlamlı ancak annotasyonları yapılmamış olan transkriptlerin fonksiyonel genomik çalışmalarla bulunmasına olanak sağlayacaktır.
114
KAYNAKLAR
Adams, M.D., Kelley, J.M., Gocayne, J.D., Dubnick, M., Polymeropoulos, M.H., ve ark., 1991. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science, 252, 1651–1656.
Adie, B. A.T., Pe´rez-Pe´rez,J., Pe´rez-Pe´rez,M.M., Godoy,M., Sa´nchez-Serrano,J., Schmelz,E.A., and Solanoa, R., 2007. ABA is an essential signal for plant resistance to pathogensaffecting JA biosynthesis and the activation of defenses in Arabidopsis. Plant Cell, 19, 1665–1681.
Aharoni A., Vorst O., 2001. DNA microarrays for functional plant genomics. Plant