Mikroarray Uygulamaları

Mikroarray çalışmalarda NimbleGen Gene Expression Arrays Version 6.0 cihazında, 12x135K array kullanılmıştır. DNA probları Roche firmasına sentezlettirilerek 12 X 95 608 adet prob, aray üzerine yerleştirilmiştir. Analizlerde problar 60 mer oligo- nükleotittir ve 4 tekrarlı olup 23 902 transkripte karşılık gelmektedir. Oligonükleotit dizaynında NCBI veri tabanından alınan 20 987 haşhaş EST’lerinin yanı sıra SRX012997 aksesyonundan ise 100 000 EST kullanılarak 95 608 prob dizayn edilmiştir. 39 392 adet kontrol probu kullanılmıştır.

Nimblegen array teknolojisinde maskesiz array sentezleyicisi (MAS) sistemi kullanılmaktadır. Bu yöntemde ışık yönlendirmeli sentez kimyası kullanılmıştır.

51

3.5.1.cDNA sentezi

Super Script II Double Stranded cDNA Synthesis Kit (Life Technologies) protokolüne göre yapılmıştır.

Birinci iplik cDNA sentezi

0,2 ml’lik steril tüpe (1X için):10 µgRNA, 1µl (100 pmol/ µl)Oligo dT Primer, toplam hacim 11 µl olacak şekilde üzerine DEPC su eklenmiştir. PCR cihazında 70°C’de 10 dakika örnekler ısıtılılarak örnekler hemen buza alınmıştır. Tüpler 10–20 saniye spin yapılarak 5 dakika buzda bekletilmiştir.

11 µl reaksiyon hacminin üzerine 4 µl5X First strand buffer, 2 µl0,1 M DTT, 1 µl10 mM dNTP mix eklenerek toplamda 18 µl olacak şekilde Master mix hazırlanmıştır. 42°C’de 2 dakika PCR cihazında bekletilerek üzerine 2µl Super script II RT eklenip karıştırılmıştır. Örnekler 42°C’de 60 dakika PCR cihazında inkübe edilmiştir. PCR cihazından alınan tüpler kısa spin edilmiş, ikinci iplik sentezine kadar buzda bekletilmiştir.

İkinci iplik cDNA sentezi

20 µl reaksiyon hacmi üzerine 91 µlDEPC su, 30 µl5X second strand buffer, 3 µl10 mM dNTP mix, 1 µl10 u/ µl DNA ligaz, 4 µl10 u/ µl DNA polimeraz, 1 µl2 u/ µl RNase H eklenerek toplamda 150 µl olacak şekilde mix hazırlanmıştır. Hazırlanan mix kısa süre spin edilerek 16°C’de 2 saat inkübe edilmiştir. Örneklerin üzerine 2 µl 5 u/µl T4 DNA polimeraz eklenmiştir. Örnekler tekrar 16°C’de 5 dakika inkübe edilmiştir. 5. Hemen buza alınan örneklerin üzerine 0,5 M EDTA’dan 10 µl eklenmiştir. Bu aşamadan sonra örnekler -20°C’de bekletilebilir.

52

RNase A temizlenmesi

İkinci iplik sentezi yapılmış olan örneklerin üzerine 4 mg/ml RNase A solüsyonundan 1 µl eklenmiştir. Pipetleme yapılarak tüpler karıştırılmıştır.37°C’ de 10 dakika inkübe edilmiştir. Her örnek için 2 set 1,5 ml’lik santrifüj tüpü hazırlanmıştır. Birinci set santrifüj tüpüne fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) karışımından 163 µl eklenimiştir. Alkol karışımı içeren tüplere örnekler transfer edilerek iyice vortekslenmiştir. Örnekler 5 dakika 10000xg’de santrifüj edildikten sonra üst sıvı faz ikinci set 1,5 ml’lik santrifüj tüplerine alınmıştır.

cDNA çöktürmesi

RNase A temizlenmesinden alınan örneklerin son hacminin %10’u kadar 7,5M amonyum asetat eklenerektüpler ters yüz edilip karıştırılmıştır. Üzerine 5mg/ml glikojenden 7 µl eklenerektüpler tekrar ters yüz edilerek karıştırılmıştır.Buzda bekletilen %100'lük etanolden örneklerin son hacminin 2 katı olacak şekilde eklenmiş ve tüpler ters yüz edilerek karıştırılmıştır.Ardından örnekler 12000xg’de 20 dakika santrifüj edilmiştir.Pellete dokunmamaya dikkat edilerek süpernatant alınmıştır.Pelletlerin üzerine buzda bekletilen %80’lik etanolden 500 µl eklenmiş vetüpler ters yüz edilerek karıştırılmıştır.Örnekler 12000g’de 5 dakika santrifüj edilmiştir. Pellete dokunmamaya dikkat edilerek süpernatant alınmış ve ardından vakumlu konsantratörde pelletler kurutulmuştur. Kurutulan örnekler 20 µl suda çözülmüştür. Nanodrop cihazında cDNA ölçümleri yapılmıştır.

3.5.2. Örneklerin etiketlenmesi

Örneklerin etiketlenmesinde Nimblegen One-Color DNA Labeling Kit (Kat NO:06370411001) kullanılmıştır. Kullanılan kimyasallar, ışığa hassas oldukları için, işlemlerin hepsi karanlıkta gerçekleştirilmiştir.

53

1100 µlRandom Primer Buffer ve 2 µlΒ-Merkaptoetanol ile Random Primer Buffer hazırlanmıştır. Liyofilize haldeki Cy3 Random Nonamerler kısa bir süre spin edilerek ve üzerine Random Primer Buffer çözeltisinden 1050 µl eklendi. 0,2 ml’lik PCR tüplerine Cy3 Random Nonamerler 40 µl olacak şekilde stok yapıldı.

1 µlcDNA, 40 µlCy3 Random Nonamer üzerine toplam hacim 80 µl olacak şekilde ddH2O eklenerek Reaksiyon mix hazırlanmış (1X için) ve hafifçe

vortekslenmiştir. Örnekler 98°C’de 10 dakika PCR cihazında inkübe edilmiş ardındanhızlı bir şekilde buza alınarak 2 dakika buzda bekletilmiştir.

1X dNTP/Klenow karışımı hazırlamak için 10 µl10 mM dNTP mix, 2 µlKlenow Fragment (3’->5’exo)50U/ µl üzerine toplamda 20 µl olacak şekilde PCR suyu eklenmiştir. 80 µl olan örneklerin üzerine 20 µl dNTP/Klenow karışımı eklenmiş ve sadece 10 kez pipetaj yapılmıştır. Örnekler 37°C’de 2 saat PCR cihazında inkübe edildikten sonra üzerlerine 21,5 µl Stop solüsyonu eklenerek reaksiyon durdurulmuş ve 10–15 saniye çöktürülmüştür. İçerisinde 110 µl izopropanol olan 1,5 ml’lik tüplere 121,5 µl hacmindeki örnekler aktarılarak vorteks yapılmıştır.Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildikten sonra 12000 x g, 10 dakika santrifüj edilmiştir.Süpernatant atılarak altta pembe renkli pelletin kalması sağlanmıştır.Pelletin üzerine 500 µl %80 soğuk etanol eklenerek pipetajla pellet yerinden oynatıldıktan sonra örnekler 12000 x g, 2 dakika santrifüj edilereksüpernatant atılmıştır.Örneklerin yaklaşık 5 dakika vakumlu konsantratörde kurutulmasının ardından üzerlerine 25 µl ddH2O eklenerek örnekler

çözülmüştür.Nanodrop cihazında cDNA ölçümleri yapılarak örnekler 4 µg olacak şekilde ayarlanmıştır.

3.5.3. Hibridizasyon

Hibridizasyon işlemi için Roche Nimblegen hibridizasyon kiti (kat no: 05583683001) ve Roche Nimblegen örnek izleme kontrol kiti (kat no: 05223512001)kullanılmıştır.

Öncelikle hibridizasyon sistemi +42°C’ye ayarlanmıştır.Cy3 ile etiketlenmiş olan 4 μgörneklerin üzerine 3,3 µl örnek izleme kontrol kiti (STCs) eklenerek iyice vortekslenmiştir. İçinde 88,5 μl 2X Hybridization Buffer, 35,4 μl Hybridization

54

Component A, 3,6 μl Alignment Oligo olan toplamda 127,5 μl Hybridization Solution Master Mix hazırlanmıştır.8,7 μl Hybridization solution üzerine 3,3 μl örnek eklenerek toplamda 12 μl çözelti hazırlanarak iyice vorteks yapılmıştır. Işıktan koruyacak şekilde +95°C’de 5 dakika inkübe edildikten sonra yüklemeye hazır hale gelen örnekler array sistemine yüklenerek hibridizasyon cihazında +42°C’de 20 saat hibridizasyona bırakılmıştır.

3.5.4. Yıkama

Yıkama işlemi Roche NimbleGen Washing Kit Protokolüne göre yapılmıştır. Yıkama çözeltileri 243 mlddH2O, 27 ml10X Wash Buffer I, II, III, 27 μl1M DTT

toplamda 270 ml olacak şekilde hazırlanmıştır. Sırasıyla Wash Buffer I,II ve III çözeltilerinde 15’er saniye slayt yıkanmıştır.

3.5.5. Kurutma

Yıkanan slaytlar Roche Nimblegen kurutma cihazında 5 dakika süreyle kurutulmuştur.

3.5.6. Görüntüleme ve analiz

0, 3 ve 12. saatleri MeJa uygulaması ve kontrole ait kapsül RNA örnekleri 95 608 DNA probu içeren slaytlar Hibridizasyon sonrası görüntüleme Roche NimbleGen Mikroarray cihazında yapılmıştır. Elde edilen görüntü DEVA programı ile dijital ortama aktarılmış ve normalize edilmiştir. DEVA programı ile RMA (Robust Multi Array) analizleri yapılmış ve Pair dosyaları oluşturulmuştur. Pair dosyaları DNAstar Arraystar (DNAStar, Madison, WI, USA) programına yüklenerek tespit edilen sinyaller (logaritmik olarak) birbirine orantılanmış, student’s t-test istatistik programı ile p değeri ve ekspresyon değerleri hesaplanmıştır. P değeri ≤ 0,05 altında olan ve logaritmik ifade

55

değişimi +1,5 katın üzerinde ve -1,5 katın altında olanlar değerlendirmeye alınmıştır. DNAstar Arraystar programı kullanılarak scatter plot analizleri ve küme analizi yapılmıştır. Sinyal alınan cDNA’lara karşılık gelen genlerin annotasyonları Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) algoritması ve BLAST to Gene Ontology (Blast2GO) (http://www.blast2go.com) programı kullanılarak NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

veri tabanından yapılmıştır. Gen ontolojilerini belirlemek için Gramene

(www.gramene.org) sitesi kullanılmıştır. Genler The Kyoto Encyclopedia of Genes and

Genomes (KEGG) kullanılarak varsa yol analizleri belirlenmiştir.