Benzilizokinolin (BIA) Alkaloitlerinin Biyosentez

BIA yapısal olarak çok farklı çeşitler içermektedir ancak biyosentez yolağında oksidoredüktaz, transferaz ve liyazlar olmak üzere sınırlı sayıda enzim ailesi yer almaktadır (Şekil 2.13). Bir veya iki tane 1-benzilizokinolin birimi içeren C-C veya C- O eşleşim reaksiyonları diğer alkaloit alt gruplarının öz iskelet yapısını oluşturmaktadır. Çeşitli BIA yapısal iskeletleri işlevsel olarak farklılaşmalar geçirmektedir. Örneğin aromatik halka hidroksilasyonu veya üçüncül ya da dördüncül amin yapısını oluşturan N-metilasyonu farklı grupların oluşumuna yol açabilir. Hidroksil gruplarının varlığı veya eklenmesi O-metilasyon, O-asetilasyon ve metilendioksi köprü oluşumu ilerleyen reaksiyonların gerçekleşmesine olanak sağlar (Hagel ve Facchini,2013). Yine (S)- retikülin molekülündeki 3’-hidroksil grubu protoberberin N7-C8 köprüsünün oluşumu İçin kritik bir role sahiptir (Winkler ve ark., 2008).

25

Şekil 2.13. Haşhaş’da papaverin, sanguinarin, noskapin ve morfin oluşumunu gösteren önemli benzilizokinolin yolları (Dang ve ark., 2012’den değiştirilerek alınmıştır) . cDNA’ları izole edilmiş olan enzimler kırmızı renkte, biyokimyasal olarak karakterize edilmiş olanlar mavi renkte belirtilmiştir. Kutucuklarda bileşikler renklere gore altgruplara ayrılmıştır. Mavi, basit benzilizokinolinler; pembe, protoberberinler; kırmızı, protopinler; turuncu, benzofenantridinler; mor, fitalideizokinolinler; yeşil, protomorfinler; kahverengi, morfinler. Enzim tipleri renkli dairelerle gösterilmiştir. Buna göre: sarı, O- metiltransferaz; yeşil, N-metiltransferaz; kırmızı, P450 monooksigenaz; turuncu, FAD-bağlı oksidoredüktaz; açık mavi, NADPH-bağımlı redüktaz; koyu mavi, 2OG/Fe2+-bağımlı dioksijenaz; gri, asetil-CoA-bağımlı asetiltransferaz; beyaz, patogenezle ilişkili PR10 proteinini göstermektedir.

Biyosentez yolu temel olarak tirozin amino asidinin, hem dopamin hem de 4- hidroksifenilasetaldehit molekülüne tirozindekarboksilaz (TYDC) enzimi ile dekarboksilasyon, orto-hidroksilasyon ve deaminasyon basamakları ile başlar (Şekil 2.14) (Facchini, 2007). TYDC, L-tirozinin tiramine ve L-3,4-dihidroksifenilalaninin dopamine dönüşümünü katalizler. BIA üreten bitkilerde tiramin 4-

26

hidroksifenilasetaldehite dönüşebilir (Rueffer ve Zenk, 1987). TYDC büyük bir gen ailesine sahiptir; yaklaşık 15 üyesi de haşhaşta bulunmaktadır (Facchini ve De Luca,1994). Dihidroksifenilalanin ve tirozini kendilerine karşılık gelen aminlere dönüştüren TYDC enzimi saflaştırılmış ve cDNA’sı klonlanmıştır (Facchini ve De Luca, 1994, Facchini ve ark.,2000). Ayrıca Park ve ark., (1999) tydc7 enzimini klonlamışlardır. Bu enzimin haşhaşta tydc2-benzeri alt aileye ait olduğunu, nükleotit ve amino asit seviyesinde %96 oranında benzerlik gösterdiğini belirlemişlerdir. Bunun yanı sıra tydc7’nin promoter analizlerinde 5’ ucundan -393 ve – 287 arasındaki 155 nükleotidlik bölgenin promoter aktivitesi için gerekli olduğu da bulunmuştur.

Dopamin, izokinolin kısmının öncülü iken tiraminin deaminasyonundan oluşan 4-hidroksifenilasetaldehit, benzil bileşeni olarak katılmaktadır. Monoterpenoit indol alkaloitleri (MIA) biyosentezinde olduğu gibi BIA biyosentezi de Pictet-Spengler (Luk ve ark.,2007) tip reaksiyondur ve sentez yolunun ilk kararlı adımı norkoklaurin sentaz (NCS) ile katalizlenir (Samanani ve Facchini, 2001). NCS, dopamin ve 4- hidroksifenilasetaldehiti birleştirerek C-C köprüsünün oluşumuyla (S)- norkoklaurini oluşturur dolayısıyla 1- benzilizokinolin ana yapısı da meydana gelmiş olur. (S)- norkoklaurin bitkilerde tüm BIA sentezi için merkezi öncül moleküldür (Stadler ve ark., 1987; Stadler ve ark., 1989). Bu enzim T. flavum’dan saflaştırılmış ( Samanani ve Facchini, 2001; Samanani ve Facchini, 2002) ve cDNA’ ları izole edilerek fonksiyonel olarak haşhaş (Liscombe ve ark., 2005) ve T. flavum’da (Samanani ve ark., 2004) tanımlanmıştır. NCS, patojen ilişkili protein (PR) 10 ve Bet v 1 allerjen protein aileleriyle akrabadır ancak BIA metabolizmasına has olup bilinen hiçbir enzimle homoloji göstermemektedir (Hagel ve Facchini,2013). Ayrıca haşhaştan alınan (PR)10 proteinlerinin homologları da katalitik olarak aktif değillerdir (Ziegler ve Facchini, 2008). Genellikle (PR)10 proteinleri bitkilerin mikroorganizma ve mantarlara karşı savunmasında yer alan proteinler olarak bilinmektedir (Chadha ve Das, 2006; Lee ve Facchini, 2010).

27

Şekil 2.14. BIA biyosentez yolu (Hagel ve Facchini, 2013’ten değiştirilerek alınmıştır.)(A) Haşhaşta temel alkaloit biyosentez yolları. (B) (S)-retikülinden berberin sentez yolu

(S)- Norkoklaurinin (S)-retikuline dönüşümü 6. pozisyondaki O-metilasyon, N- metilasyon, 3’-hidroksilasyon ve ikinci bir 4-O-metilasyonu içerir. Norkoklaurin 6-O metiltransferaz (6OMT) ve 3-hidroksi-N-metilkoklaurin 4-O-metiltransferaz (4-OMT) II. sınıf O-metiltransferazlardır ve sıkı bir bölge spesifik özellik göstermektedirler. Her

28

enzim için aynı kökenden gelen cDNA’lar haşhaş ve C. japonica’dan elde edilmiştir (Morishige ve ark.,2000; Ziegler ve ark., 2005). NCS enziminin yanı sıra sitokrom P450 (CYPs) gibi oksidoredüktaz enzimler de çeşitli BIA ana iskelet yapılarını oluşturmak için C-C veya C-O bağlarının oluşumunu katalizlemektedirler. Üç CYP ailesi BIA metabolizmasında anahtar oksidatif rol oynamaktadır (Hagel ve Facchini,2013). (S )-retikulin, çoğu BIA yapısal tiplerinin oluştuğu sentez yolunda, merkezi ara üründür. Sadece dimerik bisbenzilizokinolin alkaloitleri (S )-retikulin yoluyla üretilmezler. (S )-retikulinin ara ürün bileşiği olarak görev yapmadığı bir diğer biyosentez yolu ise papaverin biyosentezidir (Ziegler ve Facchini, 2008).

Laudanin yolu

(R, S) Retikulini, laudanine dönüştüren 7OMT enzimini kodlayan cDNA tanımlanmıştır (Ounaroon ve ark., 2003). 7OMT sınıf II tip bir protein ailesine ait olup metil vericisi olarak S-adenozil N-metiyonin (SAM) kullanır ve aktivite için metal iyonuna gereksinim duymaz. Kendilerine özgü substratlarına yüksek katalitik etkinlik gösterirken in vivo koşullarda hiçbir OMT enzimi diğer OMT enziminin substratını kabul etmez (Pienkny ve ark., 2009).

Papaverin yolu

Haşhaşta papaverin biyosentez yolağı halen netlik kazanmamıştır ancak çeşitli hipotezler mevcuttur. Papaverin sentezi için iki farklı yolak öne sürülmektedir. Birincisi (S)-norkoklaurinin 6OMT enzimi ile (S)-koklaurine dönüşümü ile başlamaktadır. (S)- norretikülinin N7OMT enzimi ile (S)-norlaudanine O-metilasyonu ve birkaç basamak ardından papaverin oluşumudur. Pienkny ve ark. (2009), norretikülin-7-O- metiltarnsferaz (N7OMT) adını verdikleri yeni bir O-metiltransferaz enzimi bulmuşlardır. Bu enzim sınıf II O-metiltransferaz protein ailesine aittir. Çalışma 6 adet

P. somniferum ve 15 farklı Papaver türünde gerçekleştirilmiştir. Papaver türleri

29

transkript profilleri çıkarılmıştır. Bu enzimin BIA biyosentezindeki O- metiltransferazlarla ilişkili olduğu ve 6-OMT enzimine amino asit dizisi bakımından %68 benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. İkinci yolak ise (S)-koklaurinden CNMT enzimi ile (S)-N-Metilkoklaurinin O-metilasyonlar ile laudanozine dönüşümü ile papaverin oluşumudur. Ancak bu yolla ilgili yapılan VIGS (Virus Induced Gene Silencing) çalışmaları birinci yolağı desteklemektedir (Penix ve Facchini, 2012).

Buna karşın Pathak ve ark. (2013), doğal papaverin mutantları ile yaptıkları transkriptom çalışmasında 6OMT, 4’OMTveN7OMT’nin fazla ifade olurken, 7OMT’nin ifadesinin azaldığını belirlemişlerdir. Buradan yola çıkarak papaverin biyosentezinin (S)-koklaurin üzerinden devam ettiği yani buyoldtaki ara ürünün (S)-koklaurin olduğunu gösteren sonuçlar elde etmişlerdir.

Noskapin yolu

Noskapin yoluberberin yoluile kısmen benzerlik göstermektedir. Yol (S)- kanadin molekülüne kadar ortak olmasına rağmen sanguinarin yolunda da görev alan tetrahidroprotoberberin cis-N-metiltransferaz(TNMT) enzimi (S)-kanadini metilleyerek (S)-N-metilkanadine dönüştürür. Bu yolda son ürün olarak noskapin oluşmaktadır. Ancak bu yolda ki biyosentez mekanizmasınetlik kazanmamıştır (Dang ve Facchini, 2012).

Benzofenanthridin ve protoberberin alkaloitlerinin biyosentez yolu

Papaveraceae, Fumariaceae, Berberidaceae familyalarının belli türlerinde

berberin, sanguinarin gibi sitotoksik benzofenanthridin alkaloitleri patojen ataklara karşı biriktirilir dolayısıyla fitoaleksinler gibi görev yaparlar. Benzofenanthridin alkaloitlerinin biyosentezindeki ilk basamak, (S )-retikülin molekülünün N-metil grubunun Berberin köprü enzimi (BBE) ile (S )-skoulerin molekülünün metilen köprü kısmına dönüşümüdür(Dittrich ve Kutchan, 1991). BBE enzimini kodlayan genler

30

California poppy (Dittrich ve Kutchan 1991) ve haşhaştan (Facchini ve ark. 1996b) izole edilmiştir.

Benzofenanthridin alkaloitlerinin biyosentezine önderlik eden veziküler bir bitki enzimi olan BBE (S )-retikülinin N-metil karbonundan (S)-skolerinin berberin köprü pozisyonundaki karbonun formasyonunu biyosentezyoluboyunca spesifik ve antiparalel reaksiyonlarla katalizler (Dittrich ve Kutchan, 1991). BBE, flavoprotein ailesinin bir üyesidir ve FAD’ın bağlanabilmesi için biri histidin diğeri ise sistein olmak üzere iki bölgeye sahiptir. BBE1’in 5’ bölgesinde -355 ile -200 arasında kalan 155 nükleotidlik bölgenin promoter aktivitesi için gerekli olduğu bulunmuştur (Winkler ve ark., 2008). RNA jel blot analizleri, kültüre alınmış haşhaş hücrelerinin yaralanması veya patojen elisitlerle muamelesinin TCYD7 ve BBE1 ekspresyonlarını indüklediğini göstermiştir (Park ve ark.,1999 ).

Sanguinarin yolu

Bu yol (S)-keliantifolin ve (S)-stilopin ile sonuçlanan iki metilendioksi köprüsünün oluşumu ile devam eder. Her iki reaksiyon da P450 bağlı monooksijenazlar tarafından katalizlenir. Stilopin sentaz enzimini kodlayan iki cDNA E. californica bitkisinden klonlanmış olup Cyp719A2 ve Cyp719A3 olarak sınıflandırılmıştır (Ikezawa ve ark.,2007). Rekombinant proteinler metilendioksi köprü oluşumunda benzer bölge spesifik özellik göstermektedir, ancak Cyp719A2, sadece (S)- keliantifolini (S)- stilopine dönüştürür. (S )-stilopin daha sonra TNMT enzimi ile N-metillenir (Liscombe ve Facchini 2007).

TNMT enzimini kodlayan cDNA, koklaurin cis-N-metiltransferaz (CNMT) enziminin homolojisine dayanılarak haşhaştan izole edilip işlevselliği tanımlanmıştır. TNMT, bitki alkaloit metabolizmasında dördüncül amonyum bileşiklerinin oluşumunu katalizleyebilen nadir bitki enzimlerinden bir tanesidir. Adomet (S-adenozil-L- metiyonin) bağlı N-metiltransferaz olup protopin ve benzofenantridin alkaloit biyosentezine dair moleküler ve biyokimyasal seviyede tespit edilen ilk enzimdir. Filogenetik analizler, proteinin koklaurin-N-metiltransferaz, Arabidopsis thaliana’nın

31

S-adenozil-L-metiyonin bağımlı siklopropan yağ asiti sentetaz enzimlerini içeren tipik bir sınıf enzime ait olduğunu göstermektedir ve benzilizokinolin alkaloit biyosentezinde yer alan bilinen 2 N-metiltransferaz enziminin monofiletik olduğunu desteklemektedir.

TNMT enziminin metabolik yoldaki rolü, CNMT enziminin eski zamanda

duplikasyonundan oluştuğunu da desteklemektedir. Enzim Papaveraceae familyasının diğer üyelerinin hücre kültürlerinde belirlenmiş ancak, protopin ve benzofenanthridin alkaloitlerini biriktirmeyen diğer ilgili bitki familyalarının türlerinde belirlenmemiştir (Liscombe ve Facchini 2007).

Sitokrom p450 bağlı monooksijenaz (S)-cis-N-metilstilopin 14-hidroksilaz (MSH) enzimi hidroksilasyon ile protopin oluşur ve ardından protopin, protopin sitokrom p450 bağlı monooksijenaz 6-hidroksilaz (P6H) ile hidroksillenerek molekül içi düzenleme ile spontan olarak dihidroksisanguinarin oluşturulur (Facchini, 2007). Bu enzimler protopin alkaloit içeren hücre kültürlerinde belirlenmiş ve bunların tanımlanması sonucunda P450 monojenazlar olabileceklerini düşündürmüştür (Rueffer ve Zenk, 1987; Tanahashi ve Zenk 1990). Dihidrosanguinarini sanguinarine dönüştüren dihidrobenzofenantridin oksidaz (DBOX) enzimi, Sanguianaria canadensis bitkisinin hücre kültürlerinden saflaştırılmıştır (Arakawa ve ark., 1992). Elisitör ile muamele edilmiş bitkilerde DBOX enzimi patojenlere karşı kazanılmış direnç sağlamaya yönelik sinyal iletim yolağının mekanizması ile ilişkilidir. (Ignatov ve ark., 1996). DBOX enzimi haşhaş bitkisinde çeşitli protoberberinleri ve 1-benzilizokinolin tetrahidropapaverin molekülünü de substrat olarak kabul etmektedir (Hagel ve ark., 2012). Haşhaşta DBOX enziminin transkript seviyelerinin VIGS aracılı baskılanması köklerde sanguinarin, dihidroksisanguinarin ve papaverin miktarını azaltması bu enzimin farklı yolaklarda da işlevinin olduğunu desteklemektedir (Hagel ve Facchini, 2013).

Berberin yolu

Protoberberin yolunda, O-metilasyon, metilendioksi köprü oluşumu ve aromatizasyon basamkları bulunmaktadır (Hagel ve Facchini, 2013). BBE enzimi ile (S)-retikülinden oluşan (S)-skoulerin, 9-Ometiltransferaz (SOMT) enzimi ile (S)-

32

tetrahidrokolumbamin molekülüne dönüşür (Takeshita ve ark., 1995). C. japonica da tespit edilen SOMT enzimini kodlayan cDNA, ilk bildirilen klondur. BIA sentez yolundaki tüm O-metiltransferazlar büyük bir homoloji göstermektedir. Tetrahidrokolumbamin, (CoOMT) enzimi ile kolumbamine dönüştürülüp, en son palmatin oluşturulur (Morishige ve ark., 2002). Rekombinant CoOMT, sadece skoulerin veya tetrahidrokolumbamin gibi protoberberin alkaloit substratlarına karşı aktiftir ancak, diğer BIA türevlerine karşı aktif değildir. Metilendioksi köprüsünün bir sonraki oluşumu Cyp719A ailesinin bir üyesi olan bir P450 enzim kanadinsentaz (CAS), tarafından katalizlenir (Ikezawa ve ark., 2003). Cyp719A1 tetrahidrokolumbamine yüksek substrat özgüllüğü gösterir ve kolumbamini kabul etmez. (S)-kanadin, olarak da bilinen (S)-tetrahidroberberin, ya (S)-kanadin oksidaz ya da aynı reaksiyonu katalizleyen ancak farklı biyokimyasal özellikler gösteren (S)-tetrahidroberberin oksidaz (STOX) tarafından okside edilir. Sonuç olarak SOMT enzimi O-metilasyonu, CAS enzimi metilendioksi köprü oluşumunu ve STOX enzimi aromatizasyonu gerçekleştirir (Hagel ve Facchini, 2013).

Morfin yolu

Retikülinden itibaren devam eden çoğu biyokimyasal reaksiyon, retikülin molekülünün (S) epimeri ile başlasa da morfinan alkaloit biyosentezi için (R) epimerinin oluşması, ilk kararlı basamaktır (Facchini, 2007). Retikülinin epimerizasyonu iki basamakta gerçekleşmektedir. Bunlar (S )-retikülinnin 1,2- dehidroretikülin sentaz tarafından oksidasyonu ve (R)-retiküline 1,2-dehidroretikulin ile redüksiyonudur. Retikülinin epimerizasyonundan sorumlu DRS (Hirata ve ark.,2004) ve DRR (De-Eknamkul ve Zenk, 1992) olmak üzere iki enzim bulunmaktadır. Bütün basamaklar biyokimyasal olarak tanımlanmış, enzimleri kısmen saflaştırılmıştır ancak bu enzimleri kodlayan genler henüz izole edilememiştir. Benzil C2 ve izokinolin C4a kısmı arasındaki molekül içi karbon-karbon eşleşmesi salutaridin oluşumuna önderlik etmektedir. Bu enzim P450 monooksijenaz ailesine aittir (Gerardy ve Zenk, 1993 (a)).

Salutaridin sentazı kodlayan gen, son dönemde yüksek morfin içeren haşhaş türlerinden

33

metilendioksi köprü oluşturan P450 bağlı enzimlerle yüksek homoloji göstermektedir ve Cyp919B1 olarak sınıflandırılmıştır.

Sentez yolundaki bir sonraki basamak salutaridin redüktaz (SalR) enzimi tarafından katalizlenir; aynı kökenli cDNA SalSyn için kullanılan benzer yöntemle elde edilmiştir (Ziegler ve ark., 2006).

Rekombinant enzimin fonksiyonel olarak tanımlanması keto grubun 7(S )- salutaridinole stereospesifik redüksiyonunu göstermiştir ve bu aynı zamanda haşhaştan saflaştırılan enzim için de bildirilmiştir (Gerardy ve Zenk, 1993 (b)). Bu enzim kısa zincirli dehidrogenaz/redüktaz (SDR) ailesine dâhildir ancak, bunlardan farklı olarak daha yüksek bir moleküler ağırlıkta olup, monomerik yapıya sahiptir. Salutaridinin stereospesifik redüksiyonu salutaridinol 7-O-asetiltransferaz (SalAT) tarafından katalizlenen bir sonraki basamak için gereklidir. Bu enzim, özellikle salutaridinolun 7 (S )-epimerini, salutaridinol-7-O-asetata asetiller ve bu asetil grubu sentez yolunun ilk pentasiklik alkaloiti olan tebaini oluşturmak için kendiliğinden yok edilir (Lenz ve Zenk, 1995 (a)). SalAT enziminin moleküler tanımlaması haşhaşın hücre süspansiyon kültürlerinden saflaştırılan doğal enzimin ara amino asit dizilerine karşılık gelen cDNA klonundan yapılmıştır. Rekombinant enzim, salutaridinol molekülününün 7-hidroksil kısmını asetil-CoA varlığında asetillemiştir. Ayrıca gen transkriptleri Papaver orientale ve Papaver bracteatum türlerinin ekstraktlarında da belirlenmiştir. Genomik DNA jel blot analizleri bu genin P. somniferum genomunda tek kopyasının olduğunu göstermiştir (Grothe ve ark., 2001).

Salutaridinol 7-O-asetat tebain sentaz (THS) enzimi ile tebaine dönüştürülür. Tebainden morfin biyosentezi iki yoldan ilerler. Birinci yol neopinon üzerinden spontan olarak kodeinon ve ardından kodeinon redüktaz (COR) enzimi ile kodein oluşumu ve son olarak kodeinin, kodein demetilaz (CODM) enzimi ile metillenerek morfine dönüşümüdür. İkinci yol ise tebainden COMD ile oripavin, oripavinin tebain 6-O- demetilaz (T6ODM) enzimi ile morfinon ve ardından COR enzimi ile morfin oluşumudur.

COR enzimi haşhaştan saflaştırılmış ve klonlanmıştır (Lenz ve Zenk, 1995 (b); Unterlinner ve ark., 1999). Huang ve Kuthan (2000), COR transkriptlerinin kodein veya morfin bulundurmayan türlerde dâhil olmak üzere bütün Papaver türlerinde bulunduğunu belirtmişlerdir. Bununla birlikte COR çoklu gen ailesi tarafından

34

kodlanmakta ve hem enzimler hem de transkriptleri dokularda ve gelişim süreci boyunca bulunmaktadır (Unterlinner ve ark., 1999; Huang ve Kuthan, 2000; Facchini ve Park, 2003). Morfin biyosentezinin son basamağı iki demetilasyon ve bir redüksiyon içerir (Şekil 2.15). Hagel ve Facchini (2010), fonksiyonel genomik kullanarak tebain T6OMD ve COMD enzimlerini izole etmişlerdir. Yapılan çalışmada yüksek tebain ve oripavin içeren ancak morfin ve kodein içermeyen Top1 (thebaine oripavine poppy 1) mutantları ile morfin biriktiren 3 farklı varyetenin gövde transkriptomları karşılaştırılmıştır. T6OMD ve COMD enzimleri metabolik işlevleri VIGS ile belirlenmiştir (Kato ve ark., 2007). BIA biyosentez yolunda yer alan bazı enzimler ile bilgi Tablo 2.1’de verilmiştir.

Şekil 2.15. Haşhaşta morfin biyosentez yolunu gösteren şema (Onoyovwe ve ark., 2013’ten değiştirilerek alınmıştır)

35

Çizelge 2.1. BIA metabolizmasındaki bazı enzimler (Hagel ve Facchini, 2013’ten değiştirilerek alınmıştır).

Enzim adı Enzim

kodu Substrat Ürün Referans

Norkoklaurin sentaz (NCS) 4.2.1.78 Dopamin4- hidroksifenilasetaldehit (S)-Norkoklaurin veya (S)- Norlaudanozolin Samanani ve ark. (2004) 3’-hidroksi-N- metilkoklaurin 4’-O-metiltransferaz (4’OMT) 2.1.1.116 (S)-3’-Hidroksi-N- metilkoklaurin (S)-Retikülin Morishige ve ark. (2000) Norkoklaurin 6-O- metiltransferaz (6OMT)

2.1.1.128 (S)-Norkoklaurin (S)-Koklaurin Morishige ve ark. (2000) Koklaurin N- metiltransferaz (CNMT) 2.1.1.140 (S)-Koklaurin (S)-N- Metilkoklaurin Choi ve ark. (2002) Keliantifolin sentaz (CheSyn) (CPY719)

1.14.21.2 (S)-Skolerin (S)-Keliantifolin Diaz Chavez ve ark. (2011)

Stilopin sentaz (StySyn) (CYP719A2)

1.14.21.1 (S)-Keliantifolin (S)-Stilopin Ikezawa ve ark. (2007) Kanadin sentaz (CanSyn) (CYP719A1) 1.14.21.5 (S)-Tetrahidro kolumbamin (S)-Kanadin Ikezawa ve ark. (2003) Salutaridin sentaz (SalSyn) (CYP719B1)

1.14.21.4 (R)-Retikülin Salutaridin Gesell ve ark. (2009)

Salutaridin redüktaz

(SalR) 1.1.1.248 Salutaridin Salutaridinol

Ziegler ve ark. (2006)

Salutaridin 7-O

asetiltransferaz (SalAT) 2.3.1.150 Salutaridinol

Salutaridinol 7- O-asetat Grothe ve ark.. (2001) Kodeinon redüktaz (COR) 1.1.1.247 Kodeinon veya morfinon Kodein veya morfin Unterlinner ve ark. (1999) Tebain 6 O-demetilaz

(T6ODM ) 1.14.11.31 Tebain ya da Oripavin

Kodeinon ya da Morfinon Hagel ve Facchini (2010) Kodein O- demetilaz(CODM) 1.14.11.32 Kodeine ya da Tebain ya da (S)- Skoulerin Morfine ya da Oripavin ya da (S)-3-O- Demetilskoulerin Hagel and Facchini (2010)

36

2.4. Haşhaşta Alkalotlerin Taşınımı

Alkaloitler genellikle sitotoksisitelerine ve bitki savunmasındaki muhtemel rollerine göre belli hücre tiplerinde biriktirilir. Örneğin alkaloitler C. roseus’da idioblast hücrelerinden ve latisiferlerden T. flavum’ da kök endodermisinden ve gövde korteksinden, haşhaşta da latisiferlerden izole edilmiştir (St-Pierre ve ark., 1999; Bird ve ark., 2003; Samanani ve ark., 2005; Zeiger ve Facchini, 2008).

Haşhaşta alkaloitler latisifer adı verilen özelleşmiş hücrelerde depo edilirler. Bitkide latisiferler bir ağ oluşturacak biçimde birleşmişlerdir. Latisiferler bitkinin bütün bölümlerinde iletim demetleriyle birleşmiş biçimde bulunur (Şekil 2.16).

BIA birikimi floemin kalburlu boru hücrelerine bitişik veya yakın latisiferlerde meydana gelir (Facchini ve Bird 1998; Ziegler ve Facchini, 2008). Latisiferlerin veya lateksin sitoplazması tüm hücresel organelleri ve alkaloitlerin çoğu ayrıştırılarak depolanmış geniş vezikülleri içerir. Bu alkaloitler tohum çimlenmesinin hemen ardından gelişmekte olan fidelerde de bulunmaktadır. Morfin, kodein ve tebain hem kökte hem de bitkinin toprak üstü kısımlarında bulunur, özellikle de latisiferlerdeki veziküllerde biriktirilir, sanguinarin ise kök dokusunda biriktirilmtktedir (Weid, 2004). Uzun zamandan beri latisiferlerin BIA biyosentezi ve birikim bölgesi olduğu düşünülmesine rağmen BIA biyosentez enzimleri ve gen transkriptlerinin hücresel lokalizasyonu alkaloit sentezinin farklı hücre tiplerinde de meydana geldiğini göstermektedir. BIA metabolizma bileşenlerinin, latisiferlerden uzak floem hücrelerindeki lokalizasyonu alkaloit biyosentez enzimlerinin ve biyosentez yolu ara ürünlerinin hücreler arası taşındığını göstermektedir. Son zamanlarda kalburlu boru elemanlarının fizyolojik rolleri RNA (Jorgensen ve ark., 1998) gibi bilgi taşıyan makromoleküllerin taşınmasını ve jasmonik asit (Hause ve ark., 2003), askorbik asit (Hancock ve ark., 2003) ve savunmayla ilgili bileşiklerin (Walz ve ark., 2004) biyosentezini de içerdiğini açıklamaktadır (Facchini, 2007).

37

Şekil 2.16. Haşhaşta alkaloit biyosentez yolunun çeşitli hücre tipleri ile ilişkilendirilmesi (a) Latisfer (sarı), kalburlu borular ve arkadaş hücreleri (kırmızı) (Liscombe and Facchini 2008).(b) transkriptlerin bulunduğu kalburlu borular ve arkadaş hücreleri (kırmızı) (Liscombe ve Facchini, 2008; Zeiger ve Facchini, 2008)

Alkaloit biyosentezi ve birikimi; epidermis, endodermis, perisikl, floem, parankima, kalburlu boru ve arkadaş hücreleri, özelleşmiş mezofil ve latisiferleri içeren farklı bitkilerde çeşitli hücre tipleriyle ilgilidir. Alkaloit biyosentez enzimlerinin subseluler kompertmantalizasyonu, gen transkriptlerinin, enzimlerin ve metabolitlerinin hücre tipi özellikli lokalizasyonu kadar karmaşıktır. Endoplazmik retikulum alkaloit oluşumu için tercih edilen bölge olmasına rağmen biyosentez enzimleri kloroplast tilakoid membranlarında, mitokondrilerde, vakuollerde ve sitozolde bulunmaktadır. Yolak enzimleri arkadaş hücrelerinde toplanır, ardından alkaloit biyosentezine katılmak için kalburlu boru elemanlarına taşınır (Şekil 2.17). Ayrıca en sonunda alkaloitler her zaman kalburlu boru elemanları/arkadaş hücresi çiftlerine yakın veya uzak olan latisiferlerde birikir (Facchini, 2008).

38

Şekil2.17. Alkaloitlerin hücresel taşınımı (Zeiger ve Facchini, 2008’den değiştirilerek alınmıştır)

In situ hibridizasyon deneyleri TYDC gen transkriptlerinin latisiferlerde değil

floemde lokalize olduğunu göstermiştir (Facchini ve De Luca, 1995). Ayrıca morfin yolağı enzimleri salutaridin sentaz (Cyp719B1) ve salutaridin NADPH 7- oksidoredüktaz (SalR) latekste belirlenmemiştir (Gerardy ve Zenk, 1993). Diğer yedi tane biyosentez enzimi 6-OMT, CNMT, (S)-N-metilcoclaurine 3 - hidroksilaz (Cyp80B1), 4-OMT, BBE, SalAT, and COR haşhaşın kalburlu boru hücrelerinde lokalize olmuştur ve bu enzimlere karşılık gelen gen transkriptleri de arkadaş hücrelerinde belirlenmiştir (Bird ve ark., 2003; Samanani ve ark., 2006; Facchini, 2008).

Samanani ve Facchini (2001), haşhaş bitkisinde NCS enziminin izolasyonu ve kısmi karakterizasyonunu yaptıkları çalışmada enzimin aktivitesinin çimlenmekte olan tohumlarda, genç fidelerde ve olgun bitkinin özellikle gövde ve köklerde olmak üzere tüm organlarında belirlemişlerdir. Ancak fungal elisitör ile muamele edilmiş hücre süspansiyon kültürlerinde enzim aktivitesinin daha fazla olduğunu gözlemlemişlerdir. TNMT enzim aktivitesi gövde ve yaprak dokularında ölçülürken kök ve çiçek tomurcuklarında daha az enzim aktivitesi belirlenmiştir. Tohum imbibisyonundan 1 gün sonra haşhaş fidelerinde TNMT transkriptleri ya da enzim aktivitesi belirlenmemiştir. Buna rağmen hem TNMT transkript seviyesi hem de enzim aktivitesi tohum imbibisyonundan 4 gün sonra belirlenmiş ki bu da çimlenmeden yaklaşık 5 gün sonra

39

sanguinarin birikimi ile ilişkilidir ve fidelerin büyümesi süresince oransal olarak sabit kalmıştır. Kontrol grubu haşhaş hücre kültüründe TNMT transkriptleri belirlenmemiştir ancak elisitör muamelesinden 2 saat sonra hızlı bir şekilde indüklenmiştir. 10–100 saatleri arasında ise kademeli bir şekilde azalmıştır. Diğer yandan elisitör uygulamasında 50 saat sonra TNMT enzim aktivitesi bazal seviyeden maksimuma ulaşmış ve bunu 50–100 saat arasında kademeli bir azalma izlemiştir. Haşhaşın organlarındaki gen transkriptlerinin bolluğu ve enzim aktivitesi arasındaki uyumsuzluk alkaloit metabolizmasının bu basamağında translasyonel ve/veya post translasyonel düzenlenmenin olduğu belirtilmiştir. Köklerde gen transkriptlerinin ve enzim aktivitesinin bulunması protopin ve benzofenantridin alkaloitlerinin biyosentezinin burada olduğunu desteklemektedir ki hali hazırda bu alkaloitler önce köklerde biriktirilmektedir. Ancak TNMT transkriptlerinin ve enzim aktivitesinin bitkinin diğer organlarında oransal olarak daha fazla olması ek bir alkaloit biyosentez yolunun olabileceğini desteklemektedir (Liscombe ve Facchini 2007).

Haşhaşta morfin biyosentezinin hücre tipine özgü lokalizasyonunu belirlemek için yapılan çalışmada tüm gövde ve latekste immunofloresans etiketleme ve shutgun proteomik yöntemleri kullanılarak gövde de toplam 2031 ve latekste 830 farklı protein ailesi belirlenmiştir. Morfin biyosentez enzimlerinden 9 tanesi gövde de belirlenirken morfin yolundaki son 5 enzimden 4 tanesi latekste belirlenmiştir. Morfin biyosentezinde görevli SalSyn gövde proteomunda bulunurken latekste bulunmamıştır. Çalışma sonucuna göre (S)-norkoklaurinden (S)-retiküline dönüşümün kalburlu boru elemanlarında, salutaridinden mebaine dönüşümün öncelikli olarak kalburlu borularda olduğunu ancak aynı zamanda latisiferlerde de olabileceğini ve tebainden morfine dönüşümünde yoğun olarak latisiferlerde ama kalburlu borularda da olabileceğini belirtmişlerdir (Onoyovwe ve ark., 2013) (Şekil 2.18).

40

Şekil 2.18. Haşhaşta kalburlu boru ve latisiferlerde morfin biyosentez enzimlerinin lokalizasyonu