BIA yolunda ifadesi değişen transkriptler

Benzilizokinolin alkaloit yolağında mikroarray sonuçlarına göre NCS, CNMT,

SalR, OMT, COR, CAS, CheSyn, StySyn genlerinde ifade değişimleri belirlenmiştir

(Şekil 4.26 ve 4.27). 0USS’de kontrole göre NCS ifade değişim katsayısı 1,8 kat artarken 3USS’de 0USS’ye göre 2,2 kat azalmıştır. Aynı şekilde SalR enzimini kodlayan genin ifade değişim katsayısı 0USS’de kontrole göre 2,4 kat artarken 3USS’de 0USS’ye göre 2,5 kat azalmış, 12USS’de ise 3USS’ye göre 1,6 kat artmıştır. Alkaloit oranları ile ilişkilendirecek olursak morfin miktarı 0USS’de 1,9; 3USS’de 1,1; 12USSte ise 1,67 olarak ölçülmüştür. 12USS’de NCS transkriptinin ifade seviyesi 0USS’de göre 1,9 kat azalma göstermiştir bu durumla uyumlu olarak 0USS’ye göre 12. saatte morfin, kodein, laudanozin ve papaverin miktarlarında da azalma belirlenmiştir. Transkript ifade oranı ile morfin oranları birbiri ile uyumluluk göstermektedir ve NCS ve SalR genlerinin transkriptleri patojen stresinde alkaloit miktarını belirleyici bir role sahip olarak görülmektedir. Apoplast 4% Hücre duvarı 4% Golgi _4% Membran proteini 4% Mitokondri 6% Vakuol 6% Sitoplazma 10% Çekirdek 11% Hücre zarı 12% Kloroplast 22% Diğer 17%

99

Şekil 4. 26. BIA yolunda belirlenen transkriptlerin ifade değişim oranları

Kapsüldeki noskapin alkaloitindeki artışta HPLC-ToF MS sonuçlarına göre anlamlı bulunmuştur ve incelendiğinde değişim oranının morfin ile benzer olduğu görülmektedir. MeJa uygulaması noskapin alkaloitinin de indüklenmesine sebep olmuştur. NCS enzimi her iki alkaloit için de ortaktır ancak SalR morfin yolağında bulunurken CAS, CheSyn, StySyn enzimleri noskapin yolağında yer almaktadır. Bu enzimlerin transkriptlerinin 12USS’de 3USS’ye göre ifade seviyesi azalmış olmasına rağmen noskapin miktarı artmış görünmektedir. Morfinin öncülü olan tebain alkaloiti morfin profili ile tezatlık göstermektedir. Morfin tebain yolağında yer alan COR geni mikroarray verilerinde 0USS’deki artışı anlamlı bulunmuştur. COR transkriptinin ifade seviyesi azalmasına rağmen tebain miktarı artmıştır. 3USS’de morfin miktarı azalmasına rağmen tebain miktarındaki artış devam etmiş 12. saatte morfin miktarı artarken tebain miktarı azalmıştır.

100

Şekil 4. 27. BIA biyosentez yolu KEGG haritası. İfade değişimi belirlenen transkriptler mavi ile işaretlenmiştir (KEGG harita no: 00950)

101

Kontrol, 0USS, 3USS ve 12USS uygulamalarını biyolojik işlev bakımından incelediğimizde tüm zaman dilimlerinde en fazla etkilenen işlevlerin biyotik ve abiyotik uyarılara cevap, metabolik işlev ve stres cevabı olduğu görülmüştür. Ancak transkript değişim oranlarına baktığımızda özellikle 0USS’ye göre 3USS’de ifadesi artmış ve 3USS’ye göre 12USS’de ifadesi azalmış olan transkriptlerin uyarılara cevap, stres cevabı, büyüme ve gelişme, hücresel organizasyon, taşıma, hormonal düzenleme, karbonhidrat ve yağ metabolizmasında olduğunu görmekteyiz.

Şekil 4.28. Biyolojik işlevde 3 farklı zaman diliminde yer alan transkriptlerin karşılaştırılmalı gösterimi

Biyosentez, transkripsyon/translasyon ve oksidasyon/redüksiyon işevinde ise kontrolden 0USS’den 12USS’ye doğru azalma görülmektedir. Enerji metabolizmasında ise belirgin bir değişiklik belirlenmemiştir. Bitkinin strese karşı hızlı cevap oluşturmasında biyosentez, metabolik işlev, transkripsiyon/translasyon ve oksidasyon/redüksiyon mekanizmaları öne çıkmaktadır. Daha önce de belirtildiği üzere

0 20 40 60 80 100 oksidasyon/redüksiyon Yağ metabolizması Enerji metabolizması Protein metabolizması Transkripsiyon/translasyon Biyosentez karbanhidrat metabolizması Hormonal düzenleme Taşıma Hücresel organizasyon Büyüme/Gelişme Stres cevabı Metabolik işlev Uyarılara cevap 3s-12s 0s-3s Kontrol-0s

102

biyosentez mekanizmasında özellikle hücresel aromatik bileşen (örneğin lignin) ve kükürtlü amino asit (sistein) biyosentezi öne çıkmaktadır. Hormonal düzenlemede jasmonik asit ve salisilik asit hormonlarının yanı sıra oksin ve absisik asit (ABA) hormonlarındaki değişim de göze çarpmaktadır. Yağ metabolizmasında doymamış yağ asitleri ve sfingoid biyosentezi ile ilişkili transkriptlerin ifade seviyelerinde de artış belirlenmiştir. Bu durumda hücresel işlev bakımından bitki 3USS’de en yüksek cevabı veriyor olarak görülmektedir.

Moleküler fonksiyonda tüm saat dilimlerinde iyon bağlayıcı, oksidoredüktaz ve transferaz aktivitelerinin diğerlerine nazaran daha fazla yer ladığı belirlenmiştir. İyon bağlayıcı, hidrolaz ve nükleozit bağlama aktiviteleri 3USS’de diğer zamanlara göre daha yüksektir. Bitkinin strese karşı oluşturduğu hızlı cevapta oksidoredüktaz, bağlama ve RNA bağlama aktiviteleri öne çıkmaktadır. Bağlayıcı aktivitesinde klorofil ve hem grubu bağlanması ile ilgili transkriptler öne çıkmaktadır.

Şekil 4.29. Moleküler fonksiyonda 3 farklı zaman diliminde yer alan transkriptlerin karşılaştırılmalı gösterimi

3USS’de nükleozit ve iyon bağlayıcı aktivitenin yanı sıra hidrolazların da önemli bir role sahip olduğu görülmektedir. Sadece transferaz grubunun etkisi

0 5 10 15 20 25 30 35 40 RNA bağlayıcı Nükleozit bağlayıcı Protein bağlayıcı Hidrolaz Bağlayıcı Taşıma aktivitesi Transferaz Oksidoredüktaz İyon bağlayıcı 3s-12s 0s-3s Kontrol-0s

103

12USS’ye kadar artmıştır. Transferaz aktivitesinde tüm zaman dilimlerinde sekonder metabolit üretimi ile ilişkili O-metil transferazlar geniş bir yer almaktadır.

Bitki için kloroplast organeli oldukça önemli olduğundan dolayı transkript miktarı da yüksek çıkmıştır. Bitkinin hızlı cevabında vezikül, hücre duvarı, plazmodezma ve vakuol organelleri ön plana çıkmaktadır. Bitkinin strese karşı etkili olduğu 3USS’de ise apoplast, mitokondri, vakuol, hücre zarı ve kloroplast ile ilişkili transkriptlerin sayısı fazladır. 12USS diliminde ise çekirdek ve sitoplazma ile ilişkili transkriptlerin seviyesinde artış gözlenmektedir.

Şekil 4.30. Hücresel yapıda 3 farklı zaman diliminde yer alan transkriptlerin karşılaştırılmalı gösterimi

Hücresel organizasyonda 0USS’de kontrol grubuna göre indüklenen transkript sayısı ile 3USS-12USS arasında indüklenen transkript sayısı yaklaşık olarak eşit olmasına rağmen 0-3saat aralığında en yüksek seviye de çıkmıştır. 0USS’de hücresel organizasyonla ilişkili transkriptlerin yaklaşık %74’ünün ifade seviyesi artmıştır. Bu transkriptlerin büyük bir kısmı golgi ve vakuol organizasyonu ve hücre duvarı ile ilişkilidir. 0-3 saat aralığında ise transkriptlerin yakalşık %56’sının ifade seviyesi artmıştır. Bu zaman diliminde golgi ve hücre duvarı ile ilişkili transkriptler ön plana

0 10 20 30 40 50 60 70 Kloroplast Hücre zarı Sitoplazma Mitokondri Vakuol Membran proteini Çekirdek Apoplast Golgi Plazmodezma Hücre duvarı Vezikül 3s-12s 0s-3s Kontrol-0s

104

çıkmaktadır. 3-12 saat zaman diliminde ise hücre iskeletine ait transkriptlerin tümünün ifade seviyesi düşmüştür.

105