garanhões.
Mesmo com a grande diferença do número de espermatozóides encontrados no oviduto das éguas inseminadas dentro do mesmo grupo, observa-se que as técnicas de inseminação na extremidade do corno uterino (GIB) e inseminação histeroscópica, sobre a junção útero-tubárica (GIC), apresentaram um transporte espermático mais eficiente no trato reprodutivo feminino, quando comparado com a inseminação convencional (GIA), utilizando uma baixa dose de sêmen congelado do garanhão A (20x106 espermatozóides móveis), pois em GIB (Tabela 12) foram encontrados espermatozóides no oviduto de 2 éguas (40%), em GIC (25%; Tabela 13) de uma égua e em GIA não foi encontrado espermatozóide nos ovidutos de nenhuma égua.
Através destes resultados, também observaou-se que o número de ovidutos em que foram encontrados espermatozóides das éguas de GID, as quais foram inseminadas com 500x106 espermatozóides móveis no corpo do útero, com sêmen congelado do garanhão A (Tabela 14) não foi maior do que o número de espermatozóides encontrados nos ovidutos das éguas de GIB (IAPC) e GIC (IAH), embora tenha sido utilizado um menor número de espermatozóides em GIB e GIC (4% da dose de sêmen utilizada em GID), mostrando que a inseminação na extremidade do corno uterino e a inseminação histeroscópica são técnicas eficientes e viabilizam a utilização de um baixo número de espermatozóides oriundos de sêmen congelado de garanhões.
Observou-se a presença de espermatozóides em 2 ovidutos de GID (50%; IACU; 500x106; Tabela 14) e não foi encontrado espermatozóide em nenhum oviduto de GIA (0%; IACU; 20x106), o que mostra que para utilização de um pequeno número de espermatozóides oriundos de sêmen congelado, a técnica de inseminação convencional não é eficiente.
Embora não tenha sido observado diferença estatística (tabela 15) entre os grupos GIA, GIB, GIC (sêmen congelado, garanhão A) na porcentagem de ovidutos em que foram encontrados espermatozóides, podemos observar uma diferença numérica, sendo encontrados espermatozóides em uma maior porcentagem de ovidutos em GIB (40%; IAPC) e GIC (25%; IAH) do que em GIA (0%; IACU) utilizando 20x106 espermatozóides móveis. A mesma diferença numérica foi observada com a média de espermatozóides encontrados por oviduto, considerando todos os ovidutos lavados, reforçando a hipótese de que a deposição de 20x106
de espermatozóides, oriundos de sêmen congelado, no corpo do útero, não é eficiente, pois um número insuficiente de espermatozóides atinge o oviduto.
Após as inseminações com sêmen fresco do garanhão B, foram encontrados espermatozóides no oviduto de 2 éguas inseminadas na extremidade do corno uterino (40%; GIIB; 20x106; Tabela 16) e de 2 éguas inseminadas por histeroscopia (50%; GIIC; 20x106; Tabela 17). Porém, quando as éguas foram inseminadas no corpo do útero (GIIA; 20x106) não foram encontrados espermatozóides nos ovidutos das éguas o que demonstra novamente que a inseminação artificial na extremidade do corno uterino e a inseminação histeroscópica são mais eficientes do que a inseminação artificial no corpo do útero, quando utiliza-se um baixo número de espermatozóides oriundos de sêmen fresco de garanhão, como observado na parte I deste experimento, onde foi utilizado uma baixa dose de sêmen congelado do garanhão A. Rigby et al. (2000) obtiveram resultado semelhante a este, onde observaram que a deposição do sêmen na extremidade do corno uterino, resultou em uma maior proporção de espermatozóides recuperados do oviduto, do que quando os espermatozóides foram depositados no corpo do útero.
Após a lavagem dos ovidutos das éguas do grupo GIIE, as quais foram inseminadas com 100x106 espermatozóides oriundos de sêmen fresco do garanhão B, através da inseminação intraperitoneal, não foi encontrado espermatozóide em nenhum oviduto, o que sugere que os espermatozóides não penetram no oviduto das éguas através da fímbria após a inseminação intraperitoneal.
O número de espermatozóides encontrados nos ovidutos e o número de ovidutos em que foram encontrados espermatozóides, após as inseminações com 500x106 no corpo do útero (GIID), comparados com os resultados de GIIA (IACU; 20x106), mostra que 20x106 espermatozóides (sêmen fresco; garanhão B) quando aplicados no corpo do útero, não foram suficientes para atingir o oviduto, reforçando a idéia de se faz necessário a utilização de outras técnicas como a IAPC ou IAH, para que um maior número de espermatozóides atinja o oviduto, quando utiliza-se um baixo número de espermatozóides. Este fato também foi observado na parte I deste experimento, quando foi utilizado sêmen congelado do garanhão A.
Observou-se que a porcentagem de ovidutos em que foram encontrados espermatozóides de GIIA (sêmen fresco; 20x106; IACU) foi significativamente igual a de GIIB (sêmen fresco; 20x106; IAPC), a despeito da diferença numérica. Porém, esta porcentagem foi significativamente inferior quando comparado com GIIC (sêmen fresco; 20x106; IAH) e GIID (sêmen fresco; 500x106; IACU), mostrando mais uma vez que é
necessário um maior número de espermatozóides para a realização de inseminação no corpo do útero. Entretando, a média de espermatozóides encontrados por oviduto de GIID (7750) foi significativamente maior do que os demais grupos.
Não foi encontrado espermatozóide nos ovidutos das éguas em nenhum dos grupos GIIIA (20x106; IACU), GIIIB (20x106; IAPC), GIIIC (20x106; IAH) e GIIID (500x106; IACU), em que utilizou-se sêmen congelado do garanhão B, embora o sêmen apresentasse boa qualidade após a descongelação, mostrando que a diferença no transporte espermático não ocorre somente entre sêmen fresco e congelado, mas também entre sêmen congelado de diferentes garanhões, fato este que pode ser concluído quando compara-se os resultados obtidos com o uso do sêmen congelado do garanhão A com o garanhão B (tabela 22). Estes resultados podem explicar os baixos índices de fertilidade obtidos com a aplicação do sêmen congelado de alguns garanhões, mesmo quando os mesmos apresentam boa qualidade de sêmen depois de descongelado.
Baseados nos resultados deste trabalho, pode-se afirmar que no caso específico do garanhão B, o fator motilidade não foi determinante para a obtenção de uma reduzida população espermática no oviduto, bem como, o sítio de deposição do sêmen no momento da inseminação, pois não foi encontrado espematozóide nos ovidutos, em nenhuma das técnicas utilizadas, indicando que outros fatores devem estar envolvidos neste processo.
Alguns autores citam que a motilidade do sêmen pode não ser tão importante para o transporte espermático pelo útero, pois devido a um aumento nas contrações uterinas após a inseminação, o sêmen se espalha rapidamente pelo útero (Hunter, 1999). Entretanto, Parker et al. (1975) demonstraram que a motilidade é importante para o transporte dos espermatozóides na junção útero-tubárica e nos ovidutos.
A comparação dos resultados obtidos nos grupos em que foi utilizado sêmen fresco do garanhão B, com os resultados dos grupos em que utilizou-se sêmen congelado do mesmo garanhão, indica que a migração espermática possa ser diferente entre o sêmen fresco e o congelado, concordando com os resultados de Scott et al. (1995), que também afirmam que a migração dos espermatozóides no trato reprodutivo feminino é melhor quando se utiliza sêmen fresco, bem como, também foi observado por Bader (1982), o qual observou que a habilidade dos espermatozóides provenientes de sêmen congelado de atingirem a região da ampola é menor do que a do sêmen fresco. Acredita-se que a diferença na capacidade de migrar até o oviduto, entre sêmen fresco e congelado ocorra em conseqüência de alterações
bioquímicas na membrana plasmática dos espermatozóides ou devido à retirada do plasma seminal antes do processo de criopreservação (Clavert et al., 1985).
Além do transporte espermático do sêmen congelado de garanhões ser deficiente em relação ao sêmen fresco, como observado neste trabalho, também já foi demonstrado que espermatozóides oriundos de sêmen congelado, não tem a mesma capacidade de interação com as células epiteliais do oviduto como os espermatozóides oriundos de sêmen fresco (Dobrinski et al., 1995).
A média de espermatozóides encontrados no oviduto das éguas, 12 horas após a inseminação convencional com 500x106 espermatozóides móveis, oriundos do sêmen fresco do garanhão B (7750), foi semelhante ao número de espermatozóides encontrado por Parker et al. (1975) que encontraram 6000 espermatozóides por oviduto, 12 horas após a inseminação. Entretanto, quando foi utilizado 500x106 espermatozóides oriundos de sêmen congelado, tanto do garanhão A quanto do garanhão B, em inseminações com dose convencional, realizadas no corpo do útero, foi encontrado um menor número de espermatozóides nos ovidutos das éguas. Reforçando a idéia de que o sêmen congelado apresenta uma deficiência na capacidade de migração no trato reprodutivo da fêmea.
Já foi demonstrado em humanos e eqüinos que o líquido folicular exerce uma atração quimiotática dos espermatozóides ao corno ipsilateral ao ovário que ocorreu ou vai ocorrer a ovulação (Villanueva et al., 1990; Navarro et al., 1998). Entretanto, não foi observado diferença na migração dos espermatozóides entre os cornos uterinos após as inseminações realizadas no corpo do útero (GID – 500x106 espermatozóides, sêmen congelado; GIID – 500x106 espermatozóides, sêmen fresco), provavelmente pelo fato de ter sido utilizado apenas éguas em anestro para a realização de todas as inseminações deste experimento.
Embora saibamos que a migração e interação dos espermatozóides no trato reprodutivo feminino, ocorra em conseqüência de variações endocrinológicas das fêmeas e que o transporte espermático é mais eficiente quando as fêmeas se encontram no estro, como já foi demonstrado em ratas por Orihuela et al. (1999) e que a interação dos espermatozóides com as células do oviduto também é mais eficiente sob condições hormonais semelhantes às condições do período do estro em eqüinos (Thomas et al., 1994a). Portanto, no experimento 2 foram utilizadas éguas em anestro para a realização de todas as inseminações, com objetivo de melhor padronizar a fase do ciclo para todos as animais, evitando assim diferenças entre os grupos, decorrentes da fase do ciclo.
Através dos resultados obtidos observa-se que a interação sêmen-útero é diferente quando se utiliza diferentes técnicas de inseminações, diferentes doses inseminantes, bem
como, quando se utiliza sêmen fresco e congelado de garanhões, concordando com as observações de Katila (2001)
5.3. Teste de fertilidade entre diferentes técnicas de inseminação atificial utilizando um