TOKSİKOLOJİK ANALİZDE KULLANILAN YÖNTEMLER

Yöntemlerin seçilmesinde maliyet, iş yoğunluğu ve verilerin ne amaçla kullanılacağı gibi etkenler rol oynar. Tarama amacıyla immunolojik yöntemler uygulanırken, doğrulama testi olarak kromatografik yöntemler yeğlenir. İmmunolojik yöntemler, yüksek duyarlık, hız ve seçicilik özelliklerini taşırken; spesifiklik özelliği taşımaz, hatalı pozitif ve negatif oranı yüksektir. Bu nedenle birçok ülkede; özellikle belirlenen kalabalık risk gruplarında tarama testi amacıyla kullanılır.

10 _{Söylemezoğlu T: Madde Bağımlılığı Belirlenmesinde Toksikolojik Analizler, 7.5.2008 tarihli Komisyon}

1.8.1.1. Spektrofotometrik Yöntemler

Analizi yapılacak olan her maddenin kendine özel belirgin bir dalga boyunda ışığı absorsiyonu yapması gerekir. Diğer bir seçenek ise belirlenecek maddenin; bir reaktifle reaksiyona girerek kendine özel belirgin bir dalga boyunda ışığı absorsiyonu yapacak renkli bir bileşik (kromofor) vermesi gerekir. Bağımlılık yapan maddelerden pek azı bu özelliği taşıdığından, biyolojik materyalden analizde UV-VİS yöntemleri çok az uygulama alanı bulmaktadır.

1.8.1.2. İmmunoassay Yöntemleri

Bu kavram, kullanılan belirleme sisteminden bağımsız olarak tüm antijen/antikor reaksiyonu içeren analiz sistemlerini kapsar. Basit immunoassay sistemleri; kannabinoidler, kokain ve metabolitleri gibi maddenin kendisi ve metabolitlerini belirleyecek şekilde tasarlanmıştır. Madde grubu arama amacıyla düzenlenen analiz sistemlerinde ise yapısal olarak benzeyen tüm maddeler tek analiz prosedürü ile belirlenebilir. Bu tür analizlerle sadece kalitatif sonuçlar elde edilebilir, arama yöntemine bağlı olan uygun bir kalibrasyon standardı kullanılır. Örneğin benzodiazepinler, opiyatlar, barbitüratlar ve trisiklik antidepresanlar bu şekilde düzenlenmiş analizlerle belirlenirler.

RIA (radyoimmunoassay): İşaretleme radyoaktif madde kullanılarak yapılmakta, antijen

işaretlenmektedir. IRMA (immunradyometerassay): İşaretleme radyoaktif madde kullanılarak yapılmakta, antikor işaretlenmektedir. EIA (enzyme immunoassay): İşaretleme enzim ile yapılmakta ve enzim aktivitesi tayin edilerek ölçülmesi istenen maddenin miktarı belirlenmektedir.

FIA (fluoroimmunoassay): İşaretleme florofor bir madde ile yapılarak miktar tayini

spektroflorometre ile yapılmaktadır.

İmmunokemiluminesans: İşaretlenme kemiluminesans veren bir madde ile yapılmaktadır. EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique): İşaretleme enzim kullanılarak yapılır,

enzim aktivitesi antijen antikor reaksiyonu ile modüle olmaktadır. Tarama testleri için en fazla kullanılan yöntemler immunoassay teknikleridir. Radioimmunoassay (RIA-Coat-A-Count), enzimimmunoassay (EMITR_{, ELISA}R_{) lateks immünoassay (LI-Abuse screen, ONTRAK) ve}

fluoresan polarizasyon immunoassay (ADX, TDX) bu tekniklerden bazılarının ticari adlarıdır.

İmmümoassay yöntemlerinin avantajı; fazla sayıda ve küçük miktarda numunenin analizinin, ön ayırma işlemi gerekmeksizin kısa sürede yapılabilmesidir. Ancak bu testler çok sayıda ilaçla, çapraz reaksiyona bağlı hatalı pozitif sonuçlar da vermektedir. Bu tür çapraz reaksiyonlar reaktif kitlerinin tanıtımında belirtilmekle birlikte, sürekli olarak hatalı pozitif reaksiyona neden olan yeni bir ilaç veya kimyasal bildirilmektedir. Bunun dışında bu testlerde tuz, sirke, hipoklorit, beyazlatıcılar, sabun ve deterjan bulaşığı da hatalı negatif reaksiyonlara neden olmaktadır. İmmunoassay yöntemlerinde; test sistemlerinin çoğu barbitüratların, benzodiazepinlerin ve trisiklik antidepresanların serum ve plazmada tayini amacıyla düzenlenmiştir. Diğer ilaçlar ve ilaç grupları idrarda belirlenmektedir. Çapraz reaksiyon veren maddeler ve kalibrasyonlar her ticari ürün için farklı olmaktadır. Sonuçlar sadece belirlenen maddenin kullanıldığını gösterir, maddenin düzeyi ile ilgili veriler ancak kantitatif olarak değerlendirilebilir.

1.8.1.3. Kromatografik Yöntemler

Biyolojik materyalden analiz yapıldığında, kromatografik yöntemler öncelikle ekstraksiyon işlemini gerektirir. Madde bağımlılığında kromatografik yöntemlerin seçilme önceliklerini şu şekilde sıralayabiliriz.

1. Gaz kromatografi- Kütle Spektroskopisi (GC/MS): Tüm analizler

2. Gaz kromatograf –azot detektörü (GC-NPD): Opiyatlar, kokain ve metabolitleri, amfetaminler

3. Sıvı kromatograf- diyot array detektör (HPLC-DAD): Opiyatlar, amfetaminler 4. Sıvı kromatograf- Elektrokimyasal detektör (HPLC-ECD): Opiyatlar

5. Enstrümental ince tabaka kromatografisi (dansitometre): Opiyatlar, kokain ve metabolitleri, THC karboksilik asit

İnce tabaka kromatografisi (TLC); tarama amacıyla kullanılan birçok programda uygulama alanı bulan en eski, basit, ucuz ve hızlı bir yöntemdir. Opiyat tarama amacıyla kullanıldığında her ml örnekte 0.5 mikrogram madde belirlenebilme limitidir. Teknik ekip 2 ay gibi kısa bir sürede eğitilebilir, ancak duyarlık ve seçicilik özellikleri düşüktür, sonuçların birçok çözücü sistemi ile desteklenmesi ve HPLC veya gaz likid kromatografisi (GLC) ile doğrulanması gerekmektedir. TLC genelde tarama testi olarak uygulanır, ekipmanın ve analiz maliyetinin ucuz, analizin hızlı oluşu, birçok ilaçla birlikte metabolitinin de saptanabilmesi avantajlı yönleri iken duyarlığın düşük oluşu nedeniyle doğrulayıcı test olarak kullanılmaz. GLC ve HPLC yöntemleri hem tarama amacıyla hem de immünoassay yöntemlerinden sonra doğrulayıcı test olarak uygulanabilir. HPLC ve GLC yüksek duyarlıktadır, doğrulama yanında düzey belirlenmesi amacıyla uygulanırlar. Doğrulayıcı test olarak kullanılması değişik kolon veya detektör sistemlerinin denenmesi veya türevleme yöntemlerinin uygulanması ile güvenilir sonuçların alınmasını sağlar. Özel detektör sistemleri seçiciliği ve duyarlığı artıracaktır. GC-MS ise doğrulayıcı yöntemler içinde en güvenilir ve duyarlı olanıdır, ekipmanın maliyeti GLC ve HPLC den fazla yüksek olmamasına karşın, sistemin yürütülmesi ve bakımı daha fazla harcama gerektirmekte, analiz yapacak elemanların da daha fazla bilgili ve deneyimli olmaları gerekmektedir. Günümüzde madde bağımlılığı analizleri yönünden en duyarlı ve geçerli yöntem GC/MS, doğru olarak kullanıldığında seçicilik ve spesifiklik yönünden geçerli sonuçlar vermektedir. Uygulanan birçok yöntemde duyarlığın artırılması amacıyla maddelerin türevlenmesi gerekmektedir, deuteryumla işaretlenmiş iç standartlar kullanıldığında düşük verimli ekstraksiyon yöntemleri kullanılsa bile doğru kantitatif sonuçlar alınmaktadır. Ayrıca geniş spektrum kütüphaneleri sayesinde standardı bulunmayan maddelerin tanımlanabilmesi de söz konusudur, ki bu durum başka bir kromatografik analiz için geçerli değildir. HPLC ile ise türevleme yapılmaksızın GC-MS sonuçlarının doğrulanması özellikle amfetaminler için uygulanır. Isıya dayanıksız olan ve yüksek polaritedeki maddelerin HPLC ile analizi mümkünken, GLC sinde belirlenebilmesi için türevleme işlemi gerekir. Teori ve uygulama yönünden GLC ve HPLC yöntemleri benzerlik taşımaktadır.

Yöntemlerin seçilmesinde maliyet, iş yoğunluğu ve verilerin ne amaçla kullanılacağı gibi etkenler rol oynar. Tarama amacıyla immunolojik yöntemler uygulanırken, doğrulama testi olarak kromatografik yöntemler yeğlenir. İmmunolojik yöntemler, yüksek duyarlık, hız ve seçicilik özelliklerini taşırken spesifiklik özelliği taşımaz, bu nedenle hatalı pozitif ve negatif oranı yüksek olduğundan, birçok ülkede belirlenen kalabalık risk gruplarında tarama testi amacıyla kullanılır. Kromatografik analiz yöntemleri immunoassay yöntemlerine göre her zaman için daha fazla anlamlıdır, ancak immunoassay yöntemlerinin de hızlı sonuç alınması, geniş bir grupta tarama gerektiği zamanlarda avantajları bulunmaktadır, bazı durumlarda immunoassay yöntemlerinin

daha duyarlı olduğu bilinirken, hatalı pozitif sonuç olasılığı ise gözardı edilmemelidir. İmmunoassay yöntemlerinde genelde kantitatif sonuç olanağı yokken ek uygulamalarla düzeye ilişkin sonuçlar da elde edilebilir.

Biyolojik Materyalden Ayırma İşlemleri: Biyolojik materyal çok karmaşık yapılı ve aracak

maddeler de düşük düzeylerde olduğundan öncelikle ayırma ve yoğunlaşytırma işlemleri gerekmektedir. Bu nedenle toksikolojik analizlerde ilk aşama ayırma işlemidir. En fazla kullanılan yöntemler sıvı-sıvı ekstraksiyonu ve katı faz ekstraksiyonudur (SPE). Sıvı –sıvı ekstraksiyon toksikolojik analizlerde geleneksel yöntem olmakla birlikte madde ve metabolitlerinin sudaki çözünürlüğünden daha fazla çözünür olduğu bir organik çözücüyle ayrılması gerekmektedir. Çözünürlüğü artırmak amacıyla maddenin pKa değerine uygun olarak iyonize olmayacağı pH da ekstraksiyon işleminin yapılması gerekir. Sıvı–sıvı ekstraksiyon un en büyük avantajı, ekstraksiyon şeması doğru uygulandığı takdirde, seçiciliğidir. Bu şekilde asidik, nötral ve bazik maddeler kolaylıkla ayrılabilecektir.

SPE yöntemi ise uzun süredir bilinmekle birlikte toksikolojik analizlerde kullanımı son yıllarda daha fazla yaygınlaşmıştır. Bu yöntemde; uygun adsorban taşıyan kartuşlardan geçirilen biyolojik sıvıda bulunan toksik madde, adsorban tarafından tutulur, daha sonra uygun çözücü ile kartuştan elüe edilir. SPE yönteminin yeğlenmesi sulu fazla organik faz arasında emülsiyon oluşmaması, elde edilen son ürünün saflığı ve yüksek verimdir. Ancak yöntemin pahalı oluşu en büyük sakıncasıdır.

Biyotransformasyona uğrayarak atılan ilaçlar, idrarda büyük oranda konjugatları halinde bulunduklarından yüksek polarlıktadır ve çoğunlukla organik çözücülerle ekstrakte edilemezler, bu durumda asidik veya enzimatik hidroliz gereklidir. Örneğin eroin idrarla, 1/8 oranında morfin ve morfin glukuronidi olarak atılır.

1.8.2. Bağımlılık Yapan Maddelerin Farmakokinetikleri ve Belirlenebilirlik Özellikleri