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4.3.5. Primer İmmün Yetmezlik Hastalarında Ki-Kare Test
Estas ferramentas utilizam a abordagem conhecida como desenvolvimento de novos fármacos baseado na estrutura química de fármacos já conhecidos (ligand-based drug Discovery) e possibilitam a triagem virtual de novos potenciais fármacos baseando-se na comparação das estruturas químicas dos compostos em estudo com estruturas químicas ou perfis gerados a partir da estrutura química de ligantes ativos testados in vivo ou in vitro, candidatos a novos fármacos e fármacos conhecidos (Koutsoukas, 2011).
55 Foram utilizadas as ferramentas ChemMapper e PASSonline que estão disponíveis em servidores web de acesso livre.
As estruturas dos compostos TTPCs estudados foram desenhadas utilizando o software ChemDraw (Cambridge software), convertidas para a representação tridimensional e salvas na extensão sdf que é um dos formatos de entrada das duas ferramentas utilizadas.
Os relatórios obtidos da análise de cada um dos TTPCs estudados, em cada ferramenta web, foram tratados utilizando planilhas do software MS Excel. Depois de tabeladas, as indicações de atividades biológicas obtidas através da ferramenta PASSonline foram classificadas de acordo com o número de triterpenos pentacíclicos potencialmente ativos. Foram eliminados indicações de atividade biológica, que apresentavam resultados inferiores a 0,5 da subtração da probabilidade de ser inativo da probabilidade de serem ativos (Pa-Pi<0,5). Os resultados foram apresentados de acordo com a série de TTPCs estudada e o número de compostos ativos.
A ferramenta PASSonline (http://www.pharmaexpert.ru/ PASSonline/predict.php) utiliza abordagem Quantitative structure-activity relationships (QSAR) baseada na decomposição das estruturas químicas em descritores 2D e/ou 3D, seguida da geração de modelos obtidos de ligantes bioativos (Malgorzata, 2013). Nesta ferramenta estão reunidas informações de mais de 3500 tipos de atividades biológicas potenciais, incluindo os efeitos farmacológicos, mecanismos de ação, efeitos tóxicos e adversos, interação com enzimas metabólicas e transportadores, ação toxicológica para alguns organismos, tais como protozoários, micro-organismos e organismos terrestres e aquáticos relacionados a impacto ambiental entre outras informações.
O PASSonline realiza a previsão de potenciais atividades biológicas para os compostos avaliados de acordo com a adequação aos modelos QSAR e similaridade com mais de 250.000 compostos ativos, incluindo fármacos, candidatos a fármacos, compostos em processo de registro e compostos tóxicos (Malgorzata, 2013). Os resultados são apresentados em termos de probabilidade da estrutura química ser ativa (Pa) ou da probabilidade da estrutura química ser inativa (Pi). O volume de resultados fornecido pela ferramenta é muito grande, e o relatório de resultados em geral é muito extenso, o que dificulta sua análise. A principal forma de análise é avaliar a ocorrência a situação em que Pa > Pi além do número de alvos indicados relacionados a um mesmo tipo de potencial farmacológico (Lagunin, 2011).
Os resultados de índice de similaridade obtidos com o auxílio da ferramenta ChemMapper, para os compostos TTPCs estudados também foram tabelados e tratados
56 utilizando planilhas do software MS Excel. As indicações de alvos biológicos foram classificadas de acordo com o número de TTPCs potencialmente ativos e a série destes triterpenos (friedelano ou lupano). A Ferramenta utiliza como parâmetro, na submissão da estrutura, o Similarity Threshold que determina o mínimo valor de índice de similaridade que deve ser apresentado como relevante para que apresente a indicação de um alvo biológico. O valor de Similarity Threshold utilizado foi 1.2 (escala de similaridade de 0 a 2) que representa o mínimo de 0,6 em uma escala de similaridade de 0 a 1 para apresentação dos resultados.
Foram utilizadas todas as bases de dados disponíveis Drugbank (4.645 compostos), pdb (7.072 compostos), ChemBL (339.624 compostos), BindingDB (364.221 compostos) e KEGG (5.928 compostos) que estão relacionadas a potenciais alvos, efeitos biológicos, potenciais agroquímicos e propriedades ADMET. Os melhores resultados de índice de similaridade, para cada alvo, foram reunidos e apresentados na forma de percentual de correlação utilizando o valor de similarity score fornecido no relatório e a escala de similaridade adotada pela própria ferramenta.
A ferramenta ChemMapper (http://lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/help.html) integra a comparação estrutural de compostos de interesse com compostos ativos, candidatos a fármacos e fármacos comerciais em uma das bases de dados disponíveis. Utiliza a estrutura bidimensional e tridimensional dos compostos de interesse em uma busca de similaridade que integra a avaliação da similaridade em relação à superposição com as estruturas disponíveis nas bases de dados e a disposição de um conjunto de farmacóforos potenciais. Esta ferramenta apresenta ótimo desempenho nos testes de validação em comparação com os programas mais utilizados para este tipo de estudo. Baseia-se na seleção de conjuntos de três farmacóforos potenciais de cada vez, seguido de uma superposição das estruturas e avaliação do conjunto dos farmacóforos dos compostos ativos e a que se deseja estudar. Após a avaliação de todos os conjuntos de três pontos comuns entre as estruturas químicas, somente a melhor superposição é retida. Para o ordenamento dos resultados é utilizada tanto a forma das estruturas químicas superpostas, quanto o número total de farmacóforos em comum. No início do teste, quando for possível, a ferramenta gera um número grande de possíveis tautômeros e protômeros, para aumentar a extensão da busca, com consequente melhora na precisão dos resultados finais. A ferramenta é fundamentada no programa SHAFTS publicado recentemente e que foi validado com o banco de dados DUD, que foi desenvolvido para validação de estudos de seleção virtual, contendo 40 alvos e conjuntos de moléculas ativas e decoys (compostos inativos de estrutura similares a dos compostos ativos) escolhidos como
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“iscas” de compostos falsos positivos para diminuir a chance de seleção destes compostos
pelo método estatístico(Gong, 2013).
4.3 – Estudo de ADMET
Neste estudo foram utilizadas ferramentas disponíveis em servidores web que realizam predição in silico de potenciais efeitos adversos, ecotoxicidade e parâmetros físico- químicos variados relacionados à solubilidade e disponibilidade dos compostos estudados em diferentes condições de pH.
Foram utilizadas as ferramentas PreADMET e GUSAR que realizam predições de efeitos adversos relacionados à ADME e toxicidade, utilizando modelos QSAR com base em dados de compostos ativos, carcinógenos químicos e tóxicos ao organismo humano e/ou a diversos outros organismos. Sua utilização pode possibilitar a identificação de compostos com problemas relacionados à ADMET e a redução do tempo e custos envolvidos nas etapas pré- clínicas, contribuindo inclusive para diminuir a quantidade de animais utilizados nesses testes.
A ferramenta GUSAR (http://www.pharmaexpert.ru/gusar/index.html) utiliza como metodologia a decomposição de estruturas químicas em descritores que são comparados com os descritores de compostos disponíveis em um banco de dados de compostos biologicamente ativos (Alexey, 2011). Foi desenvolvido em uma nova abordagem que utiliza modelos de QSAR para comparação quantitativa de grupos de descritores de átomos das estruturas químicas e posterior regressão auto consistente (Alexey, 2011). Através desta ferramenta foi realizado o estudo in silico para determinação da dose letal em 50% (LD50) em ratos de cada um dos derivados lupanos e friedelanos estudados nas formas de administração subcutânea, intravenosa, via-oral e intraperitoneal. Foi determinado o fator de bioacumulação, a concentração letal 50% (CL50) para as espécies Daphnia magna (Mini crustáceo), Pimefales promelas (peixe conhecido como Vairão) e concentração que compromete o crescimento em 50% (IGC50) do protozoário Tetraimena piriformis.
A ferramenta PreADMET (http://preadmet.bmdrc.org/index.php) é baseada em processos de comparação estrutural mistos e modelos QSAR utilizando bancos de dados de compostos submetidos a testes pré-clínicos in vitro e/ou in vivo relacionados à absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (Lee, 2003; 2004). A ferramenta integra mais de 1400 descritores moleculares 3D, previsão de potencial efeito tóxico, mutagênico, carcinogênico e possível ligação com proteínas plasmáticas (Lee, 2003; 2004). Também
58 utiliza as mesmas metodologias para avaliar a toxicidade em organismos específicos, com foco em efeito ecotoxicológico ou impacto ambiental.
PreADMET utiliza metodologias matemáticas específicas para também estimar algumas propriedades físico-químicas importantes para estudos pré-clínicos de viabilidade e otimização de compostos candidatos a futuros fármacos (Lee, 2003; 2004). Permite também prever a permeabilidade do composto em estudo na barreira hemato-encefálica, absorção intestinal humana (HIA) e possível ligação com proteínas plasmáticas. PreADMET foi utilizada na previsão de alguns parâmetros relacionados à toxicidade, absorção, distribuição, além do potencial carcinogênico dos derivados friedelanos e lupanos estudados. Foram avaliados a absorção no intestino humano (em %), a penetração na barreira hemato-encefálica in vitro, o potencial de induzir carcinogênese em rato, além do teste de Ames (Ames, 1979).
Todos os testes foram realizados com os derivados friedelanos e lupanos estudados e como padrão de referência foi utilizado morfina, que também apresenta 5 (cinco) anéis em sua estrutura química. Este composto foi escolhido por ainda não se dispor de um TTPC de uso comercial. A morfina (Figura 4.8) é um opiáceo isolado da Papaver somniferum (Papoula), de forte ação analgésica, que age sobre o sistema nervoso central (SNC) fazendo com que o cérebro funcione mais devagar. Apresenta baixa toxicidade por via oral e maior toxicidade quando administrada por via intravenosa (Loguinov, 2001). Não apresenta problemas relacionados a ecotoxicidade.
Figura 4.8 – Estrutura química da morfina, composto utilizado como referência nas avaliações in silico de ADMET.