Pilot Ölçekli Biyoreaktör Deneyi

İkinci olarak gerçekleştirilen istatistiksel deneysel tasarım deneyinin merkez noktası olan 25 mL oksijen ve 130 g/L glikoz derişiminde biyoreaktör deneyi gerçekleştirilmiştir. Deneysel çalışma şekil 4.14’teki deney düzeneğinde, şekil 4.15’te görülen 5 L’lik çelik biyoreaktörde gerçekleştirilmiştir. 1500 mL çalışma hacminde çalışılmıştır. Biyoreaktörün 3500 mL’ lik boşluk hacmindeki havadaki oksijen miktarı teorik olarak hesaplandığında, deneysel tasarım sonuçlarına göre orta nokta olarak belirlenen oksijen hacmini içerdiği belirlenmiştir. Böylece çelik biyoreaktöre maya çoğaltılması boyunca hava ya da oksijen beslemeden küçük ölçekteki deneysel çalışma koşulları bire bir olarak büyük ölçekte gerçekleştirilmiştir. Ayrıca deneysel çalışma gerçekleştirilirken steril koşullarda taze besi ortamı ve mikroorganizma aktarımından sonra biyoreaktör giriş ve çıkışları tamamen kapatılmış olup, içeri olası bir hava girişi engellenmiştir. Deney başında ve sonunda mikroorganizma derişimleri analizlenmiş olup, aynı şekilde 12 saatlik çoğaltma işlemi sonunda da mikroorganizma derişimi analizi, beta glukan analizi ve DNS yöntemi ile glikoz analizleri gerçekleştirilmiştir.

49

Şekil 4.14 Deney düzeneği

50

Şekil 4.15 5 L’lik çelik biyoreaktör sistemi

51 5. ARAŞTIRMA BULGULARI

5.1 Canlı Mikroorganizma Sayımı

Canlı mikroorganizma sayımının yapılışı Bölüm 4.3’te detaylı olarak anlatılmıştır.

Deneyler 2 tekrarlı olup, mikroorganizma sayıları Çizelge 5.1’de verilmiştir.

Çizelge 5.1 Çeşitli seyreltme oranları için mikroorganizma ekiminden 24 st sonraki koloni sayıları

Yukarıdaki tabloda mikroorganizma sayımının rahatça yapılabilmesi için gerekli olan seyreltme oranının 10⁵ olduğu görülmüştür. Kaynak olan 20 mL’lik ortamda bulunan canlı mikroorganizma sayısı (CFU) eşitlik 4.1’ten aşağıdaki şekilde hesaplanmıştır.

Örnek hesaplama; içinde görülmektedir. Aynı şekilde şekil 5.2, 5.3, 5.4 ve 5.5’te ise sırasıyla 10⁴, 10⁵, 10⁶ ve 10⁷ oranlarında seyreltmeler yapılan petri kapları görülmektedir. 10⁵ seyreltme

52

oranının 8 saatlik çoğalma boyunca canlı mikroorganizma sayımı için en uygun seyreltme oranı olduğu gözlenmiş ve tüm deneylerde canlı mikroorganizma sayımına 10⁵ seyreltme oranı ile devam edilmiştir.

Şekil 5.1 Ekim yapıldıktan 24 st sonra petri kapları

Şekil 5.2 10⁴ seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü

53

Şekil 5.3 10⁵ seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü

Şekil 5.4 10⁶ seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü

54

Şekil 5.5 10⁷ seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü

5.2 Kalibrasyon Çalışmaları

5.2.1 Mikroorganizma derişimi kalibrasyonu

Kalibrasyon çalışmasının yöntemi Bölüm 4.4’te anlatılmıştır. Mikroorganizma içeren örneklerin absorbanslarına karşılık gelen kuru mikroorganizma derişimleri grafiğe geçirilmiştir. Kuru mikroorganizma derişimi-absorbans kalibrasyon grafiği şekil 5.6’da, verilmiştir. Absorbans değerlerine karşı kuru hücre derişiminin verildiği grafikte doğru denklemi y=1.304x ve belirtme katsayısı R²=0.983 olarak bulunmuştur. Bu yüksek lisans tez çalışması boyunca yapılan tüm deneylerde mikroorganizma derişimin belirlenmesi amacıyla hazırlanan bu kalibrasyon doğrusu kullanılmıştır.

55

Şekil 5.6 Kuru mikroorganizma derişimi kalibrasyon grafiği

5.2.2 Glikoz derişimi kalibrasyonu

Mikroorganizma çoğalma ortamındaki glikoz derişiminin belirlenmesi amacıyla kullanılan glikoz kalibrasyonu için farklı glikoz derişimlerinde çözeltiler hazırlanıp, Bölüm 4.6’da açıklandığı şekilde analizleri yapılmıştır. Numunelerin tek tek absorbans değerleri okunmuş ve oluşturulan kalibrasyon grafiği şekil 5.7’de verilmiştir.

y = 1,304x R² = 0,9832

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Absorbans , nm

Kuru Mikroorganizma Derişimi, g kmo/L

56

Şekil 5.7 DNS yöntemi ile glikoz analizi kalibrasyon grafiği

5.2.3 Oksijen derişimi kalibrasyonu

Gaz kromatografi cihazında yapılan analizlerde, gaz tight enjektörle saf O₂ kaynağından farklı hacimlerde (farklı mol sayılarında) O₂ çekilip, gaz kromatografi cihazına enjekte edilmiştir. Kalibrasyon grafiği şekil 5.8’de verilmiş olup, kromatogramdaki pik alanına karşılık gelen O₂ mol sayısı değerleri şeklinde çizilmiştir.

y = 1,074x R² = 0,9947

0 0,5 1 1,5 2 2,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Absorbans, nm

Cs, Glikoz derişimi, g/L

57

Şekil 5.8 Oksijen kalibrasyon grafiği

5.3 Ön Çoğaltmada Aşılama Türünün Etkisi

Ön çoğaltmada aşılama türü (santrifüj) etkisinin incelenmesi için Bölüm 4.8’deki yöntem izlenmiştir. Deneysel çalışmada her biyoreaktördeki koşul iki tekrarlı olacak şekilde çalışılmıştır. 1.1 ve 1.2 numaralı biyoreaktörlerde santrifüj işlemi yapılmış ve yeni besi ortamına aktarım yapılmış, 2.1 ve 2.2 numaralı biyoreaktörlerde ise mikroorganizmaları içeren besi ortamı tümüyle taze sıvı besi ortamına aktarılmıştır. Ön çoğaltmada aşılama türü etkisi deneyleri üç tekrarlı şekilde gerçekleştirilmiştir. Aynı şartlarda farklı zamanlarda gerçekleştirilen deneysel çalışmalardaki elde edilen sonuçlar toplu olarak aşağıdaki çizelgelerde verilmiştir. Santrifüjlü numuneler 1.1’den 1.6’ya kadar numaralandırılmış, santrifüjsüz biyoreaktörler ise 2.1’den 2.6’ya kadar numaralandırılmıştır.

y = 6E-08x - 0,0022 R² = 0,9975

0,0000 0,0020 0,0040 0,0060 0,0080 0,0100 0,0120 0,0140 0,0160 0,0180

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000

Oksijen mol sayısı, mmol

Pik alanı

58

Mikroorganizma derişimleri (t=0 st ve t=8 st) çizelge 5.2’de verilmiştir. 1.1. ve 2.1.

nolu biyoreaktörlerden t=0 st anında ve çoğaltma süresi sonunda alınan numunelerden yapılan canlı mikroorganizma sayımları çizelge 5.3’te verilmiştir.

8. saatin sonunda besi ortamından alınan örneklerin DNS yöntemi ile glikoz analizi yapılmış ve çizelge 5.4’te sunulmuştur. Her bir biyoreaktördeki mikroorganizmanın beta glukan ekstraksiyonu Bölüm 4.5’te açıklandığı şekilde gerçekleştirilmiş ve beta glukan analiz sonuçları ise çizelge 5.5’te verilmiştir.

Çizelge 5.2 Ön çoğaltmada iki farklı aşılama türü kullanılarak çoğaltılan

59

Çizelge 5.3 Ön çoğaltmada iki farklı aşılama türü kullanılarak mikroorganizma çoğaltmada t=0 st ve t=8 st için canlı mikroorganizma sayıları

(Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

Çizelge 5.4 Ön çoğaltmada iki farklı aşılama türü kullanılarak mikroorganizma çoğaltmada t=8 st’te glikoz derişimleri

(Cs₀=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

60

Çizelge 5.5 Ön çoğaltmada iki farklı aşılama türü kullanılarak mikroorganizma çoğaltmada beta glukan verimleri

(Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

Deney sonuçları incelendiğinde; ön çoğaltmada santrifüjlenerek aşılamanın santrifüjlenmeden aşılamay yapılmasına göre beta glukan verimini önemli ölçüde etkilemediği değerlendirilmiştir. Mikroorganizma derişimi açısından sonuçlar değerlendirildiğinde ise önceki ölçek büyütme adımından santrifüjlenerek son ölçek büyütme basamağına aktarımı yapılan besi ortamlarında çoğaltılan mikroorganizmanın derişimi daha yüksektir. Bu çalışmayla, ön çoğaltma basamağında santrifüjlenerek elde edilen maya hücrelerinin son ölçek büyütme adımına aşılanması ile maya çoğaltılmasının gerçekleştirilmesi gerektiği değerlendirilmiştir. Bu sonuca bu türde aşılamayla hem yüksek derişimde maya elde edildiğinin belirlenmesi, hem de çoğalma sonunda oluşan ikincil metabolitlerin de yer aldığı besi ortamının son ölçek büyütme ortamında seyrelmeye yol açacağından, varılmıştır.

61

5.4 Havalandırmanın Beta Glukan Verimine Etkisi

Bölüm 4.9’da anlatıldığı şekilde; çeşitli havalandırma profillerinin beta glukan verimine etkileri incelenmiştir. Deneysel çalışma sonuçları çizelge 5.6’da verilmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda beta glukan verimlerinin değiştiği gözlenmiştir. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar ışığında oksijen beslemeli deneyler planlanmış ve gerçekleştirilmiştir.

Çizelge 5.6 Çeşitli havalandırma profillerinde elde edilen beta glukan verimleri (Cs₀=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

Biyoreaktör No

η

(g yaş bg/g kmo)

Hava beslemesiz 1 0.470

Hava beslemeli (1 vvm) 2 0.415

Azot geçirilmiş (anaerobik) 3 0.478

4. saatte hava beslemeli (1 vvm) 4 0.367

5.5 Oksijen Derişiminin Beta Glukan Verimine Etkisi

5.5.1 Kesikli oksijen beslemesi (KB) sonuçları

Bölüm 4.10.1’de de anlatıldığı gibi; üç ayrı biyoreaktöre farklı hacimlerde (mol sayılarında) oksijen kesikli olarak beslenmiştir. KB-1 numaralı biyoreaktöre hiç oksijen beslenmemiş, KB-2 numaralı biyoreaktöre 25 mL (102.3 mmol) oksijen ve KB-3 numaralı biyoreaktöre 50 mL (204.6 mmol) oksijen kesikli olarak beslenmiştir.

Her iki saatte bir mikroorganizma derişimi analizi, canlı mikroorganizma sayımı ve DNS yöntemi ile glikoz analizi için numuneler alınmıştır. Şekil 5.9’da mikroorganizma derişimi ve kütlesinin zamanla değişimi grafiği, şekil 5.10’da ise canlı mikroorganizma sayısının zamanla değişimi grafiği bulunmaktadır. Mikroorganizma derişimleri ve kuru kütle değerleri EK-1’de verilmiştir. Elde edilen beta glukan verimi değerlerinin

62

grafiksel gösterimi şekil 5.11’de, sonuçlar ise çizelge 5.7’de verilmiştir. Şekil 5.12’de ise glikozun zamanla değişimi grafiği görülmektedir.

Şekil 5.9 Kesikli oksijen beslemesi durumunda mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

Şekil 5.10 Kesikli oksijen beslemesi durumunda canlı mikroorganizma sayısı değerleri (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

63

Çizelge 5.7 Kesikli oksijen beslemesi için beta glukan verimi (Cs₀=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

Şekil 5.11 Kesikli oksijen beslemesi için beta glukan verimi (g yaş bg/g kmo) (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 saat)

Şekil 5.12 Kesikli oksijen beslemesi için glikozun zamanla değişimi grafiği (Cs₀=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

64

Şekil 5.13 Kesikli oksijen beslemesi için O2 tüketiminin zamanla değişimi (Cs₀=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

Şekil 5.14 KB-2 numaralı biyoreaktör (25 mL O2 eklenen) için t=0 st’te gaz fazdan alınan örneğin GC kromatogramı

0 50 100 150 200

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Oksijen tüketimi, mmol O2

t, st

KB-2 KB-3

65

Şekil 5.15 KB-2 numaralı biyoreaktör (25 mL O2 eklenen) için t=8 st’te gaz fazdan alınan örneğin GC kromatogramı

Mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi grafiği incelendiğinde, 8. saatte de çoğalmanın devam ettiği görülmüştür. GC kromatogramları incelendiğinde (Şekil 5.14 ve Şekil 5.15) oksijenin çoğalma sonunda az da olsa ortamda kalması, aynı şekilde glikozun da tamamen tükenmemiş olması çoğalma işleminin devam ettiğinin de bir göstergesidir. Bu nedenle yapılan istatistiksel deneysel tasarım deneylerinde mikroorganizma çoğalmasının 12 saat sürdürülmesine karar verilmiştir.

5.5.2 Aralıklı oksijen beslemesi (AB) profilleri sonuçları

Deneysel çalışmanın başında ve sonunda her bir biyoreaktördeki kuru mikroorganizma derişim ve kütleleri EK-2’de verilmiştir. Çizelge 5.8’de profiller, çizelge 5.9’da beta glukan verimleri, çizelge 5.10’da ise glikoz analiz sonuçları verilmiştir. Şekil 5.16’daki grafikte ise canlı mikroorganizma sayıları verilmiştir.

66 Çizelge 5.8 Aralıklı oksijen besleme (AB) profilleri

(Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 saat)

Şekil 5.16 Aralıklı oksijen besleme profilleri için canlı mikroorganizma sayısı grafiği (Cs₀=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

Çizelge 5.9 Aralıklı oksijen besleme profilleri için beta glukan verimleri (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 saat)

AB-25-I 0,0581 0,210736 0,275591

AB-25-II ^{0,0523 0,204908 0,255274}

AB-50-I 0,0825 0,206135 0,400223

AB-50-II ^{0,0621 0,203988 0,304505}

Çizelge 5.10 Aralıklı oksijen besleme profilleri için t=8 st için besi ortamındaki glikoz derişimleri (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

Profil No Cs (g/L) ΔCs (g/L) AB-25-I 0,12291 19,87709 AB-25-II 0,07076 19,92924 AB-50-I 0,10428 19,89572 AB-50-II 0,11732 19,88268

0

67

Şekil 5.17’de AB-25-I ve AB-25-II profilinde (toplam 25 mL, 102.3 mmol oksijen) hem oksijen eklenmeden önce, hem de oksijen tüketildikten sonra kalan oksijen miktarları verilmiştir. Şekil 5.18’de ise AB-50-I ve AB-50-II profilinde (50 mL, 204.6 mmol oksijen) gerçekleştirilen deneysel çalışmanın zamanla oksijen mol sayısı grafiği verilmiştir.

Şekil 5.17 AB-25-I ve AB-25-II profilleri için (toplam 25 mL oksijen beslenen) biyoreaktörlerdeki oksijen değişimleri

*Grafikteki koyu renkler oksijen beslemesi yapılan anları göstermektedir.

Şekil 5.18 AB-50-I ve AB-50-II profilleri için (toplamda 50 mL oksijen beslenen) biyoreaktörlerindeki oksijen değişimleri

*Grafikteki koyu renkler oksijen beslemesi yapılan anları göstermektedir.

0

68

Biyoreaktörlere t=0 st anında kesikli olarak beslenen (KB-2, KB-3) farklı O2 mol sayıları ile gerçekleştirilen deneysel çalışma sonuçları ile farklı profillerde aralıklı beslenen (AB-25-I,II ve AB-50-I,II) O2 deneyi sonuçları karşılaştırılmıştır.

Başlangıçta 25 mL kesikli oksijen beslenen (KB-2) ve aralıklı oksijen beslemesiyle toplamda 25 mL oksijen beslenen (AB-25-I ve AB-25-II) biyoreaktörlerde elde edilen tüm analiz sonuçları karşılaştırılmıştır. Aynı şekilde başlangıçta 50 mL kesikli oksijen beslenen (KB-3) ve aralıklı oksijen beslemesiyle toplamda 50 mL oksijen beslenen (AB-50-I ve AB-50-II) biyoreaktörlerde elde edilen tüm sonuçlar karşılaştırılmıştır.

Değerlendirmeler alt başlıklar halinde detaylı olarak sunulmuştur.

5.5.2.1 Kesikli ve aralıklı oksijen beslemesi (25 mL) sonuçlarının değerlendirilmesi

Aralıklı oksijen besleme profilleri (AB-25-I ve AB-25-II) ile başlangıçta kesikli olarak 25 mL oksijen beslenen (KB-2) biyoreaktörlerdeki çeşitli analiz sonuçları karşılaştırılmıştır. Beta glukan verimi açısından incelenecek olursa; oksijeni biyoreaktöre profil halinde beslemenin gerekli olmadığı değerlendirilmiştir. Bu nedenle deneysel tasarım matrisinde aralıklı oksijen besleme profili sağlanmayarak maya çoğaltılması t=0 st’te belirlenen oksijen miktarı eklenerek deneyler gerçekleştirilmiştir.

Çizelge 5.11’de karşılaştırılan deneylerin numaralandırılışı, şekil 5.19’da canlı hücre sayılarının, şekil 5.20’de mikroorganizma kütlelerinin, şekil 5.21’de beta glukan verimlerinin ve şekil 5.22’de ise oksijen miktarlarının karşılaştırıldığı grafikler verilmiştir.

Çizelge 5.11 25 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde besleme koşulları

# Açıklama

KB-2 t=0’da 25 mL oksijen beslenen AB-25-I Profil 1 (5 mL+10 mL+10 mL) AB-25-II Profil 2 (10 mL+10 mL+5 mL)

69

70

Şekil 5.21 25 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde beta glukan verimlerinin karşılaştırılması (g yaş bg/g kmo)

(Cs₀=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

71

5.5.2.2 Kesikli ve aralıklı oksijen beslemesi (50 mL) sonuçlarının değerlendirilmesi

Aralıklı oksijen besleme profilleri (AB-50-I ve AB-50-II) ile başlangıçta kesikli olarak 50 mL oksijen beslenen (KB-3) biyoreaktörlerde gerçekleştirilen maya çoğaltılması sonucunda elde edilen tüm sonuçlar aşağıda toplu olarak değerlendirilmiştir. Beta glukan açısından bakılacak olursa; kesikli beslemeli ve aralıklı beslemeli oksijenin beta glukan verimi üzerinde çok büyük bir etkisi bulunmadığı görülmüştür. Bu nedenle istatistiksel deney tasarımında aralıklı oksijen besleme profili uygulanmasına gerek olmadığı değerlendirilmiş olup, t=0 st anında karar verilen oksijen miktarının kesikli beslenmesiyle deneyler gerçekleştirilmiştir.

Çizelge 5.12 50 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde besleme koşulları

# Açıklama

KB-3 t=0 st’te 50 mL oksijen beslenen AB-50-1 Profil 3 (10 mL+20 mL+20 mL)

72

73

Şekil 5.26 50 mL’lik kesikli ve aralıklı oksijen beslenen biyoreaktörlerde beta glukan verimlerinin karşılaştırılması (g yaş bg/g kmo)

(Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=8 st)

5.5.3 Çoğaltma süresinin etkisi

Oksijenin kesikli olarak beslendiği çalışmaların sonuçları incelendiğinde maya çoğalmasının 8 saat yerine 12 saat boyunca sürdürülmesi gerektiği sonucuna ulaşılmıştır. Bu sonuca çalışılan koşullardaki glikoz ve oksijen derişiminin çoğalmanın devamını sağlayacak düzeyde olduğundan varılmıştır. Yeniden tasarlanan bu çalışmada MF adlı biyoreaktör mikrobiyolojik filtreli, KB-1 numaralı oksijensiz, KB-2 numaralı biyoreaktöre 25 mL (101.3 mmol) oksijen ve KB-3 numaralı biyoreaktöre ise 50 mL (203.7 mmol) oksijen t=0 st anında, kesikli olarak, tek seferde beslenmiştir.

Mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi şekil 5.27’de ve canlı mikroorganizma sayısı şekil 5.28’de verilmiştir. Çizelge 5.13’te glikoz analizi sonuçları, çizelge 5.14’te ise beta glukan verim sonuçları verilmiştir.

0,267612

0,400223 0,304505

74

Şekil 5.27 12 st’lik çoğaltmada mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi grafiği (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=12 st)

Şekil 5.28 Canlı mikroorganizma sayısının t=0 ve t=12 st’teki değerleri (Cs₀=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=12 st)

75

Çizelge 5.13 12 st’lik çoğaltmada t=12 st’te glikoz analizi sonuçları (Cs₀=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=12 st)

# Cs (g/L) ΔCs (g/L)

MF 0,10521 19,89479

KB-1 0,08659 19,91341

KB-2 0,07728 19,92272

KB-3 0,07914 19,92086

Çizelge 5.14 12 st’lik çoğaltmada beta glukan verimi değerleri (Cs0=20 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=12 st)

# Yaş Beta Glukan, g

Kuru Mikroorganizma, g kmo

Beta glukan verimi, g yaş bg/g kmo

MF 0,0688 0,230675 0,298455

KB-1 0,0415 0,182515 0,227589

KB-2 0,0544 0,215337 0,252734

KB-3 0,0440 0,206748 0,213005

Mikroorganizma derişimleri incelendiğinde; mikroorganizma çoğalma eğrisinin (S eğrisi) tamamlandığı görülmüştür. Bu nedenle diğer deneylerde 12 saat boyunca çoğaltma yapılmasının gerektiği değerlendirilmiştir. İstatistiksel deneysel tasarım çalışmalarında (I ve II) mikroorganizma çoğaltılması 12 st gerçekleştirlmiştir.

5.6 İstatistiksel Deneysel Çalışma Sonuçları

5.6.1 Deney tasarımı-I sonuçları

Deney Tasarımı-I kapsamında gerçekleştirilen deneylere ait faktör seviyeleri ve elde edilen yanıtlar çizelge 5.15’te verilmiştir.

76

Çizelge 5.15 Deney Tasarımı-I koşulları ve sonuçları

Faktör düzeyleri Yanıtlar

Sonuçlar incelendiğinde; beta glukan verimine mikroorganizma derişiminin, substrat ve oksijen derişimlerinin etkisi veri analizi çıktılarında görülmektedir. Fakat canlı mikroorganizma sayısı ile beta glukan verimi arasında herhangi bir korelasyon görülmemiş olup, canlı mikroorganizma sayımı ile ilgili veri analizi gerçekleştirilememiştir.

77

Şekil 5.29 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin beta glukan verimine etkisi

Şekil 5.30 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin beta glukan verimine etkisinin yanıt yüzey grafiği

78

Şekil 5.31 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin substrat verimine etkisi

Şekil 5.32 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin substrat verimine etkisinin yanıt yüzey grafiği

79

Şekil 5.33 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin oksijen verimine etkisi

Şekil 5.34 Deney Tasarımı-I için oksijen ve substrat derişiminin oksijen verimine etkisinin yanıt yüzey grafiği

80

Çizilen iki ve üç boyutlu yanıt grafikleri incelendiğinde; beta glukan veriminin artması için glikoz derişiminin ve oksijen miktarının arttırılması gerektiği görülmüştür.

Deney Tasarımı-I için Design Expert 12.0 paket programından elde edilen ANOVA sonuçları incelendiğinde; beta glukan veriminin, substrat ve oksijen derişimine bağlılığını ifade eden regresyon modelinde, faktörlerin ana (A, B) ve ikili etkileşim terimleri (AB) yer almakta, modelin p<0.05 olduğundan anlamlı olduğu yani deneysel verileri açıkladığı görülmektedir. Ayrıca her bir terimin A, B, AB) p değerleri incelendiğinde bu faktör aralığında gerçekleştirilen deneylerden elde edilen beta glukan verimlerine sadece oksijen derişiminin etkisi olduğu p<0.05 olduğundan değerlendirilmiştir. Diğer bir ifade ile bu deney tasarımında çalışılan substrat derişimi değerlerinde elde edilen beta glukan verim değerleri arasında anlamlı bir fark olmadığı diğer bir deyişle farklı seviyelerde substrat derişimlerinde çalışılması gerektiği sonucu ortaya çıkmıştır. Diğer taraftan model önemli (significant) iken model uygunsuzluk değerinin de (significant) önemli çıkması modelin büyük ölçüde deneysel hatayı içerdiğini göstermekte olup, istenmeyen bir durumdur. Bu sebeple glikoz derişimi arttırılarak yeni bir deney tasarım matrisi (Deney Tasarımı-II) hazırlanarak çalışmalara devam edilmiştir.

Çizelge 5.16 Deney Tasarımı-I’in beta glukan verimi için ANOVA sonuçları Kareler

81 5.6.2 Deney tasarımı-II sonuçları

Deney tasarımı-II kapsamında gerçekleştirilen deneylere ait faktör seviyeleri ve elde edilen yanıtlar çizelge 5.17’de verilmiştir.

Çizelge 5.17 Deney Tasarımı-II koşulları ve sonuçları

Faktör düzeyleri Yanıtlar

82

Şekil 5.35 Deney Tasarımı-II için oksijen ve substrat derişiminin beta glukan verimine etkisi

Şekil 5.36 Deney Tasarımı-II için oksijen ve substrat derişiminin beta glukan verimine etkisinin yanıt yüzey grafiği

83

Çizelge 5.18 Deney Tasarımı-II’in beta glukan verimi için ANOVA sonuçları Kareler sonuçları incelendiğinde; hesaplanan korelasyon katsayısının R² değeri 0.95 olarak bulunmuştur. R² değerinin 1’e yakın olması, bulunan modelin deneysel veriyi iyi ifade ettiğinin bir göstergesidir. Çizelge 5.18’de verilmiş olan p değerleri modelde yer alan tüm terimler ve model için 0.05’ten küçük olduğundan modeldeki terimlerin ve tüm modelin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermektedir. Ayrıca bu tasarım için model uygunsuzluğu da önemsiz (insignificant) olarak elde edildiğinden regresyon modeli deneysel veriyi iyi ifade etmektedir ve en yüksek beta glukan verimine ulaşmak üzere faktör seviyelerini belirlemek üzere kullanılabilir.

Substrat derişimi (A) ve oksijen hacminin (B) kodlanmış değerler cinsinden regresyon model denklemi Eşitlik 5.1’de verilmiştir.

η = 0.56 + 0.054*A + 0.13*B + 0.06*A*B (5.1)

Regresyon modeli incelendiğinde; en yüksek beta glukan verimi değeri olan 0.811 g yaş bg/g kmo için 200 g /L glikoz ve 50 mL oksijenin kesikli beslendiği reaktörde maya çoğaltılması gerektiği sonucuna ulaşılmıştır.

5.7 Pilot Ölçekli Biyoreaktör Deneyi

84

5 L’lik biyoreaktörde 1500 mL çalışma hacminde deney gerçekleştirilmiştir. Deneysel çalışma boyunca sisteme oksijen ya da hava beslenmemiştir. Deney başlatılırken mikroorganizma ve oksijen derişimini belirlemek amacıyla örnekler alınıp analizlenmiştir. Çoğalma işlemi devam ederken hata payının azaltılması maksadıyla 6.

ve 8. saatte mikroorganizma derişimi, beta glukan analiz numuneleri ikişer adet ve 12.

saatte ise üçer adet numune alınmıştır.

Şekil 5.37 Pilot ölçekli biyoreaktörde mikroorganizma kütlesinin zamanla değişimi (Cs0=130 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=12 st)

Şekil 5.38 Pilot ölçekli biyoreaktörde çoğalma boyunca glikoz tüketimi değerleri (Cs0=130 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=12 st)

85

Şekil 5.39 Pilot ölçekli biyoreaktörde oksijen mol miktarının zamanla değişimi (Cs₀=130 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=12 st)

Şekil 5.40 Pilot ölçekli biyoreaktörde beta glukan verimleri (g yaş bg/g kmo) (Cs0=130 g/L, T=34.7 °C, pH=4.8, N=150 rpm, t=12 st)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 12

Oksijen mol miktarı, mol

t, st

[DEĞER]

[DEĞER]

[DEĞER]

6. saat 8. saat 12. saat

86

5.8 Deneysel çalışmalar sonucu elde edilen beta glukanın FTIR Analizi

Saflık açısından değerlendirme yapabilmek için deneysel çalışmalarda alkali-asidik ekstraksiyon yöntemi ile elde edilen beta glukan ve standart olarak kullanılan Sigma marka beta glukanın yapısal karşılaştırması amacıyla FTIR analizi yapılmıştır.

Numunelerin spektrumları şekil 5.41’de verilmiştir.

Sigma’dan alınan saf beta glukan örneği ve deneysel olarak üretilen beta glukanın tartımları alınmıştır. Örnek tartımları alındıktan sonra, numunelere kütlelerinin 1:100 oranında KBr eklenmiştir. Numune ve KBr’ün homojen bir şekilde karışmaları için numuneler ezilmiş ve toz haline getirilmiştir. Vakum ile örnekler içinde kalan hava çekilmiştir ve yüksek basınçla sıkıştırma işlemi sonucu numuneler pellet haline getirilmiştir. Numunelerin FTIR analizi Shimadzu marka, FTIR-8400 S model spektrofotometre cihazında gerçekleştirilmiştir. Bilgisayarda IR-Solution yazılımı kullanılmıştır.

Spektrumlar incelendiğinde; 3750-3000 cm^-1 arasında görünen pikin hidroksil piki olduğu, 2750-3000 cm^-1 arası CH zincir yapısından kaynaklanan pik olduğu, 1712 cm^-1’ deki pikin aldehit yapısından kaynaklandığı düşünülmektedir. 1628 cm^-1’deki pikin aromatik yapıları gösterdiği, 1250-1000 cm^-1 arası C-O, C-H tek bağ yapıları olduğu görünmektedir.

Laboratuvar koşullarında elde edilen (1-3),(1-6) beta glukan ile Sigma marka ticari beta

Laboratuvar koşullarında elde edilen (1-3),(1-6) beta glukan ile Sigma marka ticari beta

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ (sayfa 62-0)