Deneysel Tasarıma Dayalı Optimizasyon: Tam Faktöriyel Tasarım

Deney tasarımları deney birimlerinin maruz kalacağı kontrol altındaki farklı koşulların düzenlenmesi için uygulanan yöntemlerdir. Deney koşullarına faktör (X1,X2,…) adı verilir. Bu yöntemlerin amacı; deney sayısını azaltarak, faktörlerin çeşitli noktalarında deneyler gerçekleştirerek sistemi en iyi tanımlayabilecek deneysel faktör korelasyonu geliştirmektedir. Proses işletim parametrelerinin optimum değerlerini belirlemek üzere kullanılan birçok istatistiksel deneysel tasarıma dayalı optimizasyon yöntemi bulunmaktadır. Bunlara tam faktöriyel, kesirli faktöriyel, Box-Behnken, Central Composite, Taguchi tasarımı gibi örnekler verilebilir. Shu vd.’nin 2016 yılında yaptıkları çalışmada Bifidobacterium bifidum BB01 bakterisi için karbon kaynağı ve probiyotiklerin optimum oranını belirleyebilmek amacıyla Central Composite tasarım

27

yöntemini kullanmışlardır. Rajendran ve diğerleri (2015) Chlorella vulgaris’ten biyodizel üretimi çalışmalarında da Central Composite tasarım yöntemi ile sistem şartlarını optimize etmişlerdir. Nagarajan ve Natarajan (1999) Pisolithus tinctorius’ un tuz toleransını incelemek için çeşitli tuz oranlarını optimize etmek amacıyla Box-Behnken yöntemini kullanmışlardır.

Tam faktöriyel tasarım formülü aşağıda verilmiştir. Eşitlik 3.6’da N; deney sayısını, r;

tekrar sayısını ve a,b; faktöriyel düzey sayısını belirtmektedir.

N=r.a.b (3.6)

Mühendislik uygulamalarında kullanılan formül ise Eşitlik 3.7’de verilmiştir.

N=r.kⁿ (3.7)

k parametresi tüm faktörler için eşit olan düzey sayısını, n ise faktör sayısını belirtmektedir. İki seviyeli tam faktöriyel tasarımlarda faktörlerin minimum ve maksimum olmak üzere iki seviyesinde deney tasarımları yapılır.

28 4. MATERYAL VE YÖNTEM

4.1 Mikroorganizma Çoğaltılması

Tez çalışmasında beta glukan kaynağı olarak Saccharomyces cerevisiae mikroorganizması kullanılmıştır. Bütün bu çalışmalarda kullanılan maya türü Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-567 suşudur. Bu mikroorganizma “Agricultural Research Service Culture Collection, USA”den liyofilize halde temin edilmiştir.

Liyofilizasyon ile kurutulmuş olarak derin dondurucuda (-20 °C koşulunda) saklanan Saccharomyces cerevisiae mikroorganizması; canlandırma ortamında çoğaltılarak deneysel çalışmalara hazır hale getirilmiştir. Canlandırma ortamından alınan mikroorganizma 10-15 gün aralıklarla periyodik olarak uygun bileşimdeki katı besi ortamına aktarılmıştır. Mikroorganizmalar katı besi ortamına aktarıldıktan sonra +4

°C’de (buzdolabında) muhafaza edilmiştir. Deneyler gerçekleştirilirken 1:10 ölçek büyütme oranında mikroorganizmalar sıvı besi ortamlarına aktarılmıştır. Ölçek büyütme işlemlerinde iki tür aşılama yöntemi uygulanmıştır. Bu aşılama yöntemlerinden ilki;

mikroorganizma çoğaltılan sıvı besi ortamından belirli bir hacimde alınıp, 10 kat büyük hacimdeki taze besi ortamına direkt olarak aktarılmasıdır. Diğer yöntemde ise mikroorganizma çoğaltılan sıvı besi ortamından belirli bir hacimde alınıp, santrifüjlenerek mikroorganizmalar besi ortamından ayrılmış, daha sonra da 10 kat büyük hacimdeki taze besi ortamına aktarılmıştır.

4.2 Besi Ortamları

Besi ortamları; mikroorganizmaların yaşam döngülerini devam ettirebilmeleri (gelişme, üreme gibi yaşamsal faaliyetler) için gerekli besin ögelerini, mineralleri ve uygun koşulları içeren ortamlardır. Besi ortamları aynı zamanda kültür ortamı, besiyeri, kültür vasatı olarak da adlandırılır. Hazırlanan besi ortamlarında mikroorganizmalar için enerji kaynağı ve besin kaynağı olarak karbonlu ve azotlu organik maddeler kullanılır.

Bunların dışında; besi ortamında çeşitli oranlarda potasyum, sodyum, fosfor, kükürt, magnezyum, kalsiyum içeren elementlere de ihtiyaçları vardır.

29

Saccharomyces cerevisiae mikroorganizmasının çoğaldığı katı ve sıvı besi ortamlarının hazırlanışları ve optimum bileşimleri Bölüm 4.2.1 ve Bölüm 4.2.2’de anlatılmıştır.

4.2.1 Katı besi ortamı

Mikroorganizmanın canlılığını sürdürebilmesi için, periyodik olarak katı besi ortamına aktarım yapılır. Çizelge 4.1’de belirtilen miktarlarda ilgili maddelerin tartımları yapılıp;

öncelikle glikoz çözeltisi (glikoz ve saf su), daha sonra tuz çözeltisi (glikoz dışındaki diğer maddeler ve saf su) olmak üzere iki ayrı homojen çözelti hazırlanmıştır. Glikoz ve tuz çözeltilerinin ayrı ayrı hazırlanmasının amacı; otoklavda gerçekleşecek olan sterilizasyon işleminde glikoz ile tuzlar arasındaki etkileşimi ve bunun sonucu olarak da glikozun bozunmasını önlemektir. Hazırlanan çözeltiler daha sonra 20 dakika boyunca otoklavda 2 atm basınç ve 121 °C koşullarında doygun buhar ile muamele edilerek sterillenmiştir. Bu işlemden sonra iki çözeltide de kontaminasyon olmaması için içinde besi ortamı hazırlanan ve sterillenmiş olan erlenler laminer flow (steril) kabine alınmıştır. Steril kabinde, erlenlerin ağızları bek alevinden geçirilerek glikoz ve tuz çözeltileri karıştırılmıştır. Önceden ağızları mikrobiyolojik filtre ile kapatılmış ve sterillenmiş olan deney tüplerine 10’ar mL hacimlerde konularak eğik agar oluşturacak şekilde soğutulmuştur. Şekil 4.1’de mikroorganizmalı ve mikroorganizma aktarımı yapılmamış olan taze katı besi ortamları görülmektedir.

30

Şekil 4.1 Katı besi ortamı

Çizelge 4.1 Katı besi ortamı bileşimi Madde Derişim (g/L)

Glikoz 20

Maya Özütü 6

K2HPO4 3

(NH4)2SO4 3.35

NaH₂PO₄ 3.76

MgSO4.7H2O 0.52 CaCl2.4H2O 0.017

Agar 20

4.2.2 Sıvı besi ortamı

Sıvı besi ortamının katı besi ortamından tek farkı agar içermemesidir. Çizelge 4.1’de verilmiş olan bütün maddeler (agar hariç) teker teker tartılmış olup, daha sonra manyetik karıştırıcılarda homojenliği sağlanmıştır. Katı besi ortamında olduğu gibi

31

glikoz ve tuz çözeltileri ayrı ayrı hazırlanmıştır. 1.2 atm, 121°C koşullarında 20 dakika boyunca otoklavda sterillenmiştir.

4.3 Canlı Mikroorganizma Sayımı

Besi ortamında çoğaltılmış olan mikroorganizma sayısının beta glukan verimi üzerine etkisinin incelenmesi amacıyla canlı hücre sayımı yapılmıştır. Yapılan literatür araştırmalarına göre mikroorganizma seyreltmelerinde kullanılan çeşitli steril çözeltiler;

fizyolojik tuzlu su, peptonlu su, tamponlanmış peptonlu su, peptonlu fizyolojik tuzlu su ve ¼ Ringer çözeltisidir (Gürgün ve Halkman 1990). Deneysel çalışmalarda hem maliyet hem de kolay bulunabilmesi açısından serum fizyolojik çözeltisi (% 0.09 sodyum klorür, izotonik solüsyonu) kullanılmıştır.

İlk olarak katı ortamda ve buzdolabında bekletilen Saccharomyces cerevisiae mikroorganizmasının taze katı besi ortamına aktarımı gerçekleştirilmiştir (Şekil 4.2).

Mikroorganizmalar 20 saat boyunca, inkübatörde 32 °C sıcaklıkta çoğaltılmıştır.

Önceden hazırlanmış olan 20 mL sıvı besi ortamına aktarımları gerçekleştirilmiştir.

Aktarım yapıldıktan sonra 12 saat boyunca, inkübatörde 150 rpm karıştırma hızında ve 32 °C sıcaklıkta çoğalma işlemi devam etmiştir. Diğer yandan steril koşullarda 1.5 mL’lik mikrosantrifüj tüplerine 0.9 mL serum fizyolojik çözeltisi eklenmiştir.

Mikroorganizma çoğaltılan 20 mL’lik besi ortamından mikropipetle 0.1 mL örnek alınıp mikrosantrifüj tüpünde toplam 1 mL örnek oluşturulmuştur. Son olarak da hazırlanan 1 mL’lik örnekler vortekslenmiş, içlerinden 0.1 mL numune alınıp petri kabında hazır olan katı besi ortamları yüzeyine drigalski spatülü (üçgen yayma aparatı) ile yayılmıştır.

Bu yöntem yayma yöntemi olarak adlandırılmaktadır (Harrigan ve McCance 1966).

Seyreltme oranları 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ ve 10⁸ olacak şekilde; numuneler serum fizyolojik çözeltisi ile seyreltilerek petri ortamlarına ekim yapılmıştır. Deneysel çalışma adımları şekil 4.3’te gösterilmiştir. Kaynak besi ortamında bulunan canlı mikroorganizma sayısı (CFU) eşitlik 4.1’de gösterildiği şekilde hesaplanır (Gürgün ve Halkman 1990).

32

Şekil 4.2 Taze katı besi ortamına aktarım işlemi

( ) ( )

0.1 mL Sıvı Besi Ort. + S.cerevisiae

20 mL Sıvı Besi Ort.+

S.cerevisiae

0.9 mL Serum Fizyolojik Çöz.

vorteks

0.1 mL örnek alınır, petriye aktarılır

Üçgen yayma aparatı ile yayılır

Şekil 4.3 Canlı mikroorganizma sayımı deney yöntemi

33

Deney hatalarını en az seviyeye indirmek amacıyla deneyler ikişerli olarak gerçekleştirilmiştir. Ekim yapılan petri kapları inkübatörde 32 °C sıcaklıkta 24 saat bekletilmiştir. 24 saatin sonunda mikroorganizmalar gözle görülür şekilde çoğalmış ve bütün petri kaplarında mikroorganizma sayımları yapılmıştır. Canlı sayımında; 30-300 koloni değerlendirmeye alınmıştır (Harrigan ve McCance 1966).

4.4 Mikroorganizma Derişimi Analizi ve Kalibrasyonu

Besi ortamında çoğaltılan mikroorganizma derişimi, UV spektrofotometre cihazında absorbans ölçümüne dayalı olarak belirlenmiştir. UV Spektrofotometrede 580 nm dalga boyunda çalışılmıştır. Cihazda analiz yapılırken kör olarak ve numunelerin seyreltilmesi için sıvı besi ortamı kullanılmıştır. Kalibrasyon doğrusu çalışması için buzdolabında muhafaza edilen S. cerevisiae mikroorganizması steril kabinde, öze yardımı ile taze katı besi ortamına aktarılmış ve ardından 20 saat boyunca 32 °C sabit sıcaklıkta inkübatörde çoğaltılmıştır. Ön çoğaltma basamakları 1:10 ölçek büyütme oranı sağlanarak gerçekleştirilmiştir. İlk ölçek büyütme adımında 15 mL sıvı besi ortamı bulunan erlen biyoreaktöre öze yardımıyla mikroorganizma aktarımı yapılmış olup 12 saat boyunca 32

°C sıcaklık ve 150 rpm karıştırma hızına set edilmiş olan inkübatörde çoğaltma işlemi devam etmiştir. İkinci ölçek büyütme adımı olarak 150 mL sıvı besi ortamına, 15 mL besi ortamında çoğaltılmış olan mikroorganizma aktarımı yapılmıştır. Bu çoğaltma işlemi de 12 saat boyunca inkübatörde devam etmiştir. Son ölçek büyütme adımı olarak 1500 mL erlen biyoreaktördeki sıvı besi ortamına aktarım yapılmış ve mikroorganizma 8 saat boyunca inkübatörde çoğaltılmıştır. 8. saatin sonunda; erlen biyoreaktörden numuneler alınıp, 2-20 kat arası seyreltmeler yapılmıştır. Örneğin; 20 kat seyreltme için biyoreaktörden 1 mL’lik numune alınıp, 19 mL taze sıvı besi ortamı ile karıştırılmıştır.

Seyreltilmiş numuneler UV spektrofotometrede 580 nm dalga boyunda analizlenmiştir.

Absorbans değerleri okunan örnekler santrifüjlenerek besi ortamından ayrılmış olup mikroorganizmalar inkübatörde 60 °C’de 30 saat boyunca kurutulduktan sonra tartımları alınmıştır.

34 4.5 Beta Glukan Ekstraksiyonu

Deneysel çalışmalarda; Saccharomyces cerevisiae’dan beta glukan ekstraksiyonu için alkali-asidik yöntemi kullanılmıştır. Biyoreaktörden çoğalma sonunda alınan numuneler 50 mL’lik tüplere alınmıştır. +4 ^oC’de soğutmalı santrifüj cihazında 15 dakika santrifüjlenmiştir ve süpernatant kısmı ayrılmıştır. Dipte kalan maya hücreleri üzerine 2 mL 2 M NaOH çözeltisi eklenmiş, ardından ultrasonik banyoda 15 dakika boyunca tutularak hücre duvarlarının parçalanması sağlanmıştır. Daha sonra numuneler 90 ^oC’de 1 saat boyunca bekletilmiş ve bu şekilde çözünebilen mannoproteinlerin uzaklaştırılması sağlanmıştır. Kalan kısım saf su ile yıkanmış, %3’lük asetik asit çözeltisi ile muamele edilmiş ve 1 saat boyunca sıcak su banyosunda bekletilmiştir.

Numuneler tekrar santrifüjlendikten sonra, sırasıyla etanol ve aseton muamelesi yapılarak işlem sonlandırılmıştır. En son adımda ise santrifüj işlemlerinden sonra, kalan sıvı kısım da atılmıştır. Bütün bu işlemler sonucunda suda çözünemeyen 1,3-1,6 beta glukan elde edilmiştir. Elde edilen beta glukan miktarı hassas terazi ile tartılmıştır.

Ekstraksiyon işleminin adımları detaylı olarak şekil 4.4’te gösterilmiştir.

35

Şekil 4.4 Beta glukan ekstraksiyon işlemi adımları

BETA GLUKAN

Çökelti kısmı 0,8 mL'lik aseton ile yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Çökelti kısmı 0,8 mL'lik etanol ile yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Numunelerdeki çökelti 2 kere 1 mL'lik saf suyla yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Çökelti üzerine 2 mL %’3’lük CH₃COOH çözeltisi ilave edilir. (Amaç: Hücre duvarı kalıntılarını

uzaklaştırmak)

(Sıcak su banyosu; 85 °C, 1 saat) (Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 15 dk) Çökelti tekrar 1 mL saf suyla yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Çökelti 1 mL saf suyla yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Numuneler soğutulur.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 15 dk) Numunelere 2 mL 2 M NaOH eklenir. (Amaç: Hücre duvarlarını parçalamak)

(Vorteks; 15 sn) (Sonikasyon; 15 dk) (Sıcak su banyosu; 90 °C, 1 saat) Numuneler, biyoreaktörden 50 mL'lik falkon tüplerine alınır.

(Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 15 dk)

36

4.6 DNS Yöntemi ile Glikoz Tayini ve Kalibrasyonu

Deneysel çalışmalarda; besi ortamındaki glikoz derişimi analizi DNS yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. 3,5-dinitrosalisilik asit (DNS) indirgen şekerler ile reaksiyona girmekte ve 3-amino-5- nitrosalisilik asite indirgenmektedir. Bu bileşik 515 nm dalga boyundaki ışığı absorbe etmektedir. Numune DNS çözeltisi eklendiğinde sarı renktedir.

Gerçekleştirilen reaksiyon sonunda indirgen şeker derişimine göre numuneler turuncu ya da kırmızı renge dönüşmektedir (Miller 1959).

100 mL’lik DNS çözeltisi hazırlamak için; 50 mL distile su üzerine 1.6 g NaOH eklenmiş ve manyetik karıştırıcıda karıştırılarak çözünmesi sağlanmıştır. NaOH çözündükten sonra, 0.9 g DNS eklenmiş ve çözünmesi beklenmiştir. DNS çözündükten sonra 28.22 g sodyum potasyum tartarat tartılıp, hazırlanan çözeltiye yavaş yavaş eklenmiştir. Daha sonra da hacim distile su ile 100 mL’ye tamamlanmıştır.

Numune hazırlığı için; besi ortamından 0.5 mL örnek alınıp üzerine 0.5 mL DNS çözeltisi eklenmiştir (Kör hazırlığı için 0.5 mL saf su üzerine 0.5 mL DNS çözeltisi eklenmiştir). Numuneler 90 °C sıcak su banyosunda 10 dk boyunca bekletilmiştir.

Hemen ardından numuneler buz banyosunda 3 dk soğutulmuştur. Buz banyosundan alındıktan sonra üzerine 5 mL saf su eklenip, vortekslenmiştir. Ardından hemen UV spektrofotometre cihazında 515 nm’de analizi yapılmıştır (Miller 1959).

4.7 Gaz Kromatografi Cihazı ile Oksijen Analizi ve Kalibrasyonu

Mikroorganizma çoğalması esnasında, oksijen tüketimini tayin edebilmek amacıyla oksijen analizleri Shimadzu marka, GC-2010 Plus model gaz kromatografi (GC) cihazında gerçekleştirilmiştir. Tez çalışması boyunca kullanılan gaz kromatografi cihazı şekil 4.5’te verilmiştir. Çalışılan dedektör ısıl iletkenlik dedektörü olan Pre TCD dedektörü, kolon ise “Supelco Analytical Carboxen1010Plot” (30 m x 0.32 mm) kolonudur. Taşıyıcı gaz azot gazıdır; çalışma basıncı 100 kPa ve make up akışı 6.0 mL/dk’dır. Enjektör sıcaklığı 200 °C, TCD sıcaklığı 250 °C, kolon sıcaklığı 40 °C’dir.

37

Split modda çalışılmış olup, oranı 1.0’dır. 1 mL’lik gaz sızdırmaz (gas tight) enjektörle biyoreaktörden 0.5 mL alınmıştır. Cihaza enjeksiyon yapıldığı andan itibaren kolon sıcaklığı 40 °C’de başlayıp, 2 dk o sıcaklıkta tutup, daha sonra iki adımda 50 °C’ye çıkmaktadır. Çalışma programı (numune enjeksiyonu, analizi, tekrar soğutma işlemi) toplam 7 dk sürmektedir. Yukarıda anlatılan kolon tipi ve kullanılan metodda; ortamda bulunan N2 ve çoğalma boyunca ortamda oluşan CO2 analizi gerçekleştirilmemiş, sadece oksijen analizleri gerçekleştirilmiştir.

Şekil 4.5 Gaz kromatografi cihazı

4.8 Ön Çoğaltmada Aşılama Türünün Etkisi Deneyleri

Mikroorganizma aktarımı yapılırken besi ortamından mikroorganizmanın elde edilmesi amacıyla aşılama türünün etkisi incelenmiştir. Bu amaçla yapılan deney aşamaları bu bölümde ayrıntılı olarak anlatılmıştır. Deneysel çalışmada 4 adet 100 mL’lik steril erlen biyoreaktör kullanılmıştır. Her bir 100 mL’lik erlen biyoreaktörde; aktarım başında ve sonunda olmak üzere mikroorganizma sayımları yapılmış ve mikroorganizma derişimleri incelenmiştir. 8 saatlik çoğaltma işlemi sonunda da beta glukan miktarı ve substrat derişimi analizleri yapılmıştır.

38

İlk olarak Saccharomyces cerevisiae mikroorganizması taze katı besi ortamına aktarılıp, 20 saat boyunca inkübatörde 32 °C sıcaklıkta çoğaltılmıştır. Çoğalma işlemi devam ederken, diğer yandan sterillenmiş olan sıvı besi ortamlarının pH’ları 4.8’e ayarlanmıştır. 1. ölçek büyütme adımı için; 40 mL’lik sıvı besi ortamı bulunan erlen biyoreaktöre steril kabinde katı besi ortamından öze ile mikroorganizma aktarımı yapılmıştır. Aktarımı yapılan mikroorganizmalar inkübatörde 32°C sıcaklık ve 150 rpm karıştırma hızında, 12 saat boyunca çoğaltılmıştır. 12 saatin sonunda; çoğaltılan mikroorganizmalar 4 eşit hacme ayrılmıştır. 40 mL’lik mikroorganizma çoğaltılmış olan besi ortamı deneysel çalışmada mikroorganizma kaynağı olarak kullanılmıştır.

Diğer yandan 4 ayrı steril erlen biyoreaktöre 100’er mL taze sıvı besi ortamı eklenmiştir. 100 mL’lik biyoreaktörler 1.1, 1.2, 2.1 ve 2.2 olarak numaralandırılmıştır.

Kaynak besi ortamından 2 adet 10 mL’lik numune santrifüj tüplerine alındıktan sonra 10 dk (25°C, 3000 rpm) boyunca santrifüjlenmiş, besi ortamından mikroorganizmanın ayrılması sağlanmıştır. Santrifüj tüpünün dibinde kalan mikroorganizmalar alınıp 1.1 ve 1.2 numaralı biyoreaktörlere aktarılmıştır. 2.1 ve 2.2 numaralı biyoreaktörlere ise kaynaktan alınan 10 mL’lik S. cerevisiae içeren besi ortamı santrifüjlenmeden aktarılmıştır. Deneysel çalışma adımları şekil 4.6’da gösterilmiştir.

4 biyoreaktörde de şartların aynı olması için; çoğaltma işlemi eş zamanlı olarak

başlatılmıştır. 100 mL’lik biyoreaktörlere aktarımlar yapıldıktan hemen sonra (t=0 st anında) mikroorganizma derişimi ve canlı hücre sayımı için numuneler

alınmıştır. Canlı hücre sayımı için gerekli seyreltmeler yapılarak petrilere ekimleri yapılmıştır. 100 mL’lik erlen biyoreaktörlerde 8 saat boyunca; 34.7 °C sıcaklık, 150 rpm çalkalama hızında inkübasyon işlemi devam etmiştir. 8 saatlik çoğaltma işlemi sonunda bütün biyoreaktörlerden numuneler alınıp mikroorganizma derişimi analizleri yapılmıştır. Diğer yandan ise 1.1 ve 2.1. numaralı biyoreaktörlerden numuneler alınıp, canlı mikroorganizma sayımı yapılması için petri ortamlarına ekimleri yapılmıştır. En son olarak da; 8. saatin sonunda ortamdan alınan numuneler ile beta glukan ve glikoz analizleri yapılmıştır.

39

Şekil 4.7 Santrifüj sonrası numuneler

40 mL

Sıvı Besi Ort. + Mikroorganizma

100 mL Besi ortamı 10 mL

3000 rpm, 10dk Santifüjlenmiş

10 mL 3000 rpm, 10dk

Santifüjlenmiş

10 mL Santifüjlenmemiş

10 mL Santifüjlenmemiş

100 mL Besi ortamı 100 mL

Besi ortamı 100 mL

Besi ortamı

Katı-Katı Aktarım

1.1 1.2 2.1 2.2

Şekil 4.6 Deneysel çalışmanın şematik gösterimi

40

4.9 Havalandırmanın Beta Glukan Verimine Etkisinin İncelenmesi

S.cerevisiae mayasının farklı çoğalma koşullarında beta glukan içeriğinin değişkenlik gösterdiği bilinmektedir. Beta glukan içeriğine oksijen derişiminin etkisini incelemek amacıyla farklı havalandırma koşullarında, 4 ayrı biyoreaktörde mikroorganizma çoğaltma deneyi gerçekleştirilmiştir. Deneysel çalışmalar; aynı taze katı besi ortamından sırasıyla 5 mL, 50 mL ve 500 mL’lik sıvı besi ortamlarına mikroorganizma aktarımı ardından 34.7 ^oC ve 150 rpm karıştırma hızında inkübatörde çoğaltılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Hava beslemesiz (mikrobiyolojik filtreli), hava beslemeli (1 vvm hava akışlı), anaerobik (t=0’da azot geçirilerek ortamdaki oksijen uzaklaştırılmış ve izole edilmiş) ve 4. saatten itibaren 1 vvm hava akışlı erlen biyoreaktörlerde çeşitli havalandırma profilleri uygulanmış ve mikroorganizma çoğalması sürdürülmüştür (Şekil 4.8). Mikroorganizmaların çoğalma süresi olan 8 saatin sonunda biyoreaktörlerden alınan örnekler, Bölüm 4.4’teki adımlar izlenerek ekstrakte edilmiştir.

Farklı havalandırma koşulları ile mikroorganizmanın metabolik yol izlerinde farklılıklar yaratılarak beta glukan veriminin değiştirilebildiği gözlenmiştir ve bundan hareketle deneysel çalışmalara O2 ile devam edilmiştir.

41

Şekil 4.8 Farklı havalandırma profilleri deneyi

4.10 Oksijen Derişiminin Beta Glukan Verimine Etkisinin İncelendiği Deneyler

Tez çalışmasının bu bölümünde farklı oksijen derişimlerinin beta glukan verimine etkilerini incelemek için üç ayrı deneysel çalışma gerçekleştirilmiştir.

4.10.1 Kesikli oksijen beslemesi

Farklı oksijen derişimlerinin mikroorganizma ve beta glukan verimi üzerine etkisinin incelenmesi ve aynı zamanda biyoreaktöre beslenebilecek oksijen limitlerinin anlaşılabilmesi amacıyla üç ayrı oksijen derişiminde çalışılmıştır. Deneysel çalışmada ağzı kapalı, hava izolasyonu bulunan, ağzı tıpalı, steril 100 mL’lik biyoreaktörlerde çalışılmıştır.

42

İlk olarak mikroorganizma katı besi ortamından, 15 mL’lik sıvı besi ortamına aktarılmıştır. Bölüm 4.4’te anlatıldığı şekilde 1:10 ölçek büyütme oranı ile çalışılmıştır.

Daha sonra kaynak biyoreaktörden 5’er mL ayrılmış ve santrifüjlenerek 50 mL’lik, pH’ı 4.8 olarak ayarlanmış olan taze sıvı besi ortamları bulunduran üç adet biyoreaktöre laminer akışlı kabinde aktarılmıştır. Mikroorganizma aktarımı yapıldığında (t=0 st anında) mikroorganizma derişimi ve canlı hücre sayımı için numuneler alınmıştır.

Mikroorganizma aktarımı yapıldıktan hemen sonra biyoreaktörlerin ağzı tıpa ile kapatılmıştır. Kapatılan biyoreaktörlerden iki dakika boyunca azot geçirilmiş, içerideki tüm oksijen süpürülmüştür. Tüm izolasyonları sağlandıktan sonra KB-1 numaralı biyoreaktöre hiç oksijen beslenmemiş, KB-2 numaralı biyoreaktöre sadece başlangıçta 25 mL (102.3 mmol) oksijen beslenmiş, KB-3 numaralı biyoreaktöre ise sadece başlangıçta 50 mL (204.6 mmol) oksijen beslenmiştir. Deneysel çalışma boyunca t=0 st anından itibaren her saat başı biyoreaktörlerin tepe boşluğundan oksijen numunesi alınıp, gaz kromatografi cihazında analizi yapılmıştır. Mikroorganizma çoğalması boyunca ortamda sadece O₂ değil, başlangıçta oksijenin süpürülmesi için kullanılan N₂ gazı ve fermentasyon sonucu oluşan CO2’de bulunmaktadır. Fakat kullanılan kolon ve metod şartları göz önünde bulundurulduğunda gaz kromatografi cihazında sadece oksijen analizi gerçekleştirilmiştir. 34.7 °C sıcaklık ve 150 rpm karıştırma hızına set edilmiş olan inkübatörde 8 saat boyunca mikroorganizma çoğaltma işlemi sürdürülmüştür. Deneysel çalışmanın şematik gösterimi şekil 4.9’da, inkübatörde çoğaltma esnasındaki görüntüleri ise şekil 4.10’da verilmiştir.

43

Şeki l 4.10 İnkübatörde çoğaltma işlemi devam ederken biyoreaktörler

5 mL m.o.

25 mL Oksijen 15mL

Sıvı Besi Ort.+ Mikroorganizma

5 mL m.o.

Oksijensiz

5 mL m.o.

50 mL Oksijen

50 mL Besi ortamı 50 mL

Besi ortamı 50 mL

Besi ortamı

Katı-Katı Aktarım

KB-1 KB-2 KB-3

Şekil 4.9 Deneysel çalışmanın şematik gösterimi

44 4.10.2 Oksijen besleme profilleri

Tez çalışmasının bu bölümünde biyoreaktörlere beslenen oksijen miktarının değişik aralıklarla (2 saatte bir), değişik oranlarda beslenmesiyle oluşturulan profillerin beta glukan verimine etkisi incelenmiştir. Bunun için dört ayrı biyoreaktörde farklı oksijen profillerinde çalışılmıştır. Deneysel çalışmaya başlamadan önce biyoreaktörlerin hepsinden 2 dakika boyunca azot geçirilmiş, içeride kalan tüm oksijen süpürülmüştür.

Daha sonra AB-25-I ve II numaralı biyoreaktörlere toplam 25 mL (102.3 mmol) oksijen

Daha sonra AB-25-I ve II numaralı biyoreaktörlere toplam 25 mL (102.3 mmol) oksijen

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ (sayfa 40-0)