Mikroorganizma Derişimi Analizi ve Kalibrasyonu

Besi ortamında çoğaltılan mikroorganizma derişimi, UV spektrofotometre cihazında absorbans ölçümüne dayalı olarak belirlenmiştir. UV Spektrofotometrede 580 nm dalga boyunda çalışılmıştır. Cihazda analiz yapılırken kör olarak ve numunelerin seyreltilmesi için sıvı besi ortamı kullanılmıştır. Kalibrasyon doğrusu çalışması için buzdolabında muhafaza edilen S. cerevisiae mikroorganizması steril kabinde, öze yardımı ile taze katı besi ortamına aktarılmış ve ardından 20 saat boyunca 32 °C sabit sıcaklıkta inkübatörde çoğaltılmıştır. Ön çoğaltma basamakları 1:10 ölçek büyütme oranı sağlanarak gerçekleştirilmiştir. İlk ölçek büyütme adımında 15 mL sıvı besi ortamı bulunan erlen biyoreaktöre öze yardımıyla mikroorganizma aktarımı yapılmış olup 12 saat boyunca 32

°C sıcaklık ve 150 rpm karıştırma hızına set edilmiş olan inkübatörde çoğaltma işlemi devam etmiştir. İkinci ölçek büyütme adımı olarak 150 mL sıvı besi ortamına, 15 mL besi ortamında çoğaltılmış olan mikroorganizma aktarımı yapılmıştır. Bu çoğaltma işlemi de 12 saat boyunca inkübatörde devam etmiştir. Son ölçek büyütme adımı olarak 1500 mL erlen biyoreaktördeki sıvı besi ortamına aktarım yapılmış ve mikroorganizma 8 saat boyunca inkübatörde çoğaltılmıştır. 8. saatin sonunda; erlen biyoreaktörden numuneler alınıp, 2-20 kat arası seyreltmeler yapılmıştır. Örneğin; 20 kat seyreltme için biyoreaktörden 1 mL’lik numune alınıp, 19 mL taze sıvı besi ortamı ile karıştırılmıştır.

Seyreltilmiş numuneler UV spektrofotometrede 580 nm dalga boyunda analizlenmiştir.

Absorbans değerleri okunan örnekler santrifüjlenerek besi ortamından ayrılmış olup mikroorganizmalar inkübatörde 60 °C’de 30 saat boyunca kurutulduktan sonra tartımları alınmıştır.

34 4.5 Beta Glukan Ekstraksiyonu

Deneysel çalışmalarda; Saccharomyces cerevisiae’dan beta glukan ekstraksiyonu için alkali-asidik yöntemi kullanılmıştır. Biyoreaktörden çoğalma sonunda alınan numuneler 50 mL’lik tüplere alınmıştır. +4 ^oC’de soğutmalı santrifüj cihazında 15 dakika santrifüjlenmiştir ve süpernatant kısmı ayrılmıştır. Dipte kalan maya hücreleri üzerine 2 mL 2 M NaOH çözeltisi eklenmiş, ardından ultrasonik banyoda 15 dakika boyunca tutularak hücre duvarlarının parçalanması sağlanmıştır. Daha sonra numuneler 90 ^oC’de 1 saat boyunca bekletilmiş ve bu şekilde çözünebilen mannoproteinlerin uzaklaştırılması sağlanmıştır. Kalan kısım saf su ile yıkanmış, %3’lük asetik asit çözeltisi ile muamele edilmiş ve 1 saat boyunca sıcak su banyosunda bekletilmiştir.

Numuneler tekrar santrifüjlendikten sonra, sırasıyla etanol ve aseton muamelesi yapılarak işlem sonlandırılmıştır. En son adımda ise santrifüj işlemlerinden sonra, kalan sıvı kısım da atılmıştır. Bütün bu işlemler sonucunda suda çözünemeyen 1,3-1,6 beta glukan elde edilmiştir. Elde edilen beta glukan miktarı hassas terazi ile tartılmıştır.

Ekstraksiyon işleminin adımları detaylı olarak şekil 4.4’te gösterilmiştir.

35

Şekil 4.4 Beta glukan ekstraksiyon işlemi adımları

BETA GLUKAN

Çökelti kısmı 0,8 mL'lik aseton ile yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Çökelti kısmı 0,8 mL'lik etanol ile yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Numunelerdeki çökelti 2 kere 1 mL'lik saf suyla yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Çökelti üzerine 2 mL %’3’lük CH₃COOH çözeltisi ilave edilir. (Amaç: Hücre duvarı kalıntılarını

uzaklaştırmak)

(Sıcak su banyosu; 85 °C, 1 saat) (Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 15 dk) Çökelti tekrar 1 mL saf suyla yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Çökelti 1 mL saf suyla yıkanır.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 5 dk) Numuneler soğutulur.

(Vorteks; 15 sn) (Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 15 dk) Numunelere 2 mL 2 M NaOH eklenir. (Amaç: Hücre duvarlarını parçalamak)

(Vorteks; 15 sn) (Sonikasyon; 15 dk) (Sıcak su banyosu; 90 °C, 1 saat) Numuneler, biyoreaktörden 50 mL'lik falkon tüplerine alınır.

(Santrifüj; 4 °C, 5860 rpm, 15 dk)

36

4.6 DNS Yöntemi ile Glikoz Tayini ve Kalibrasyonu

Deneysel çalışmalarda; besi ortamındaki glikoz derişimi analizi DNS yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. 3,5-dinitrosalisilik asit (DNS) indirgen şekerler ile reaksiyona girmekte ve 3-amino-5- nitrosalisilik asite indirgenmektedir. Bu bileşik 515 nm dalga boyundaki ışığı absorbe etmektedir. Numune DNS çözeltisi eklendiğinde sarı renktedir.

Gerçekleştirilen reaksiyon sonunda indirgen şeker derişimine göre numuneler turuncu ya da kırmızı renge dönüşmektedir (Miller 1959).

100 mL’lik DNS çözeltisi hazırlamak için; 50 mL distile su üzerine 1.6 g NaOH eklenmiş ve manyetik karıştırıcıda karıştırılarak çözünmesi sağlanmıştır. NaOH çözündükten sonra, 0.9 g DNS eklenmiş ve çözünmesi beklenmiştir. DNS çözündükten sonra 28.22 g sodyum potasyum tartarat tartılıp, hazırlanan çözeltiye yavaş yavaş eklenmiştir. Daha sonra da hacim distile su ile 100 mL’ye tamamlanmıştır.

Numune hazırlığı için; besi ortamından 0.5 mL örnek alınıp üzerine 0.5 mL DNS çözeltisi eklenmiştir (Kör hazırlığı için 0.5 mL saf su üzerine 0.5 mL DNS çözeltisi eklenmiştir). Numuneler 90 °C sıcak su banyosunda 10 dk boyunca bekletilmiştir.

Hemen ardından numuneler buz banyosunda 3 dk soğutulmuştur. Buz banyosundan alındıktan sonra üzerine 5 mL saf su eklenip, vortekslenmiştir. Ardından hemen UV spektrofotometre cihazında 515 nm’de analizi yapılmıştır (Miller 1959).

4.7 Gaz Kromatografi Cihazı ile Oksijen Analizi ve Kalibrasyonu

Mikroorganizma çoğalması esnasında, oksijen tüketimini tayin edebilmek amacıyla oksijen analizleri Shimadzu marka, GC-2010 Plus model gaz kromatografi (GC) cihazında gerçekleştirilmiştir. Tez çalışması boyunca kullanılan gaz kromatografi cihazı şekil 4.5’te verilmiştir. Çalışılan dedektör ısıl iletkenlik dedektörü olan Pre TCD dedektörü, kolon ise “Supelco Analytical Carboxen1010Plot” (30 m x 0.32 mm) kolonudur. Taşıyıcı gaz azot gazıdır; çalışma basıncı 100 kPa ve make up akışı 6.0 mL/dk’dır. Enjektör sıcaklığı 200 °C, TCD sıcaklığı 250 °C, kolon sıcaklığı 40 °C’dir.

37

Split modda çalışılmış olup, oranı 1.0’dır. 1 mL’lik gaz sızdırmaz (gas tight) enjektörle biyoreaktörden 0.5 mL alınmıştır. Cihaza enjeksiyon yapıldığı andan itibaren kolon sıcaklığı 40 °C’de başlayıp, 2 dk o sıcaklıkta tutup, daha sonra iki adımda 50 °C’ye çıkmaktadır. Çalışma programı (numune enjeksiyonu, analizi, tekrar soğutma işlemi) toplam 7 dk sürmektedir. Yukarıda anlatılan kolon tipi ve kullanılan metodda; ortamda bulunan N2 ve çoğalma boyunca ortamda oluşan CO2 analizi gerçekleştirilmemiş, sadece oksijen analizleri gerçekleştirilmiştir.

Şekil 4.5 Gaz kromatografi cihazı

4.8 Ön Çoğaltmada Aşılama Türünün Etkisi Deneyleri

Mikroorganizma aktarımı yapılırken besi ortamından mikroorganizmanın elde edilmesi amacıyla aşılama türünün etkisi incelenmiştir. Bu amaçla yapılan deney aşamaları bu bölümde ayrıntılı olarak anlatılmıştır. Deneysel çalışmada 4 adet 100 mL’lik steril erlen biyoreaktör kullanılmıştır. Her bir 100 mL’lik erlen biyoreaktörde; aktarım başında ve sonunda olmak üzere mikroorganizma sayımları yapılmış ve mikroorganizma derişimleri incelenmiştir. 8 saatlik çoğaltma işlemi sonunda da beta glukan miktarı ve substrat derişimi analizleri yapılmıştır.

38

İlk olarak Saccharomyces cerevisiae mikroorganizması taze katı besi ortamına aktarılıp, 20 saat boyunca inkübatörde 32 °C sıcaklıkta çoğaltılmıştır. Çoğalma işlemi devam ederken, diğer yandan sterillenmiş olan sıvı besi ortamlarının pH’ları 4.8’e ayarlanmıştır. 1. ölçek büyütme adımı için; 40 mL’lik sıvı besi ortamı bulunan erlen biyoreaktöre steril kabinde katı besi ortamından öze ile mikroorganizma aktarımı yapılmıştır. Aktarımı yapılan mikroorganizmalar inkübatörde 32°C sıcaklık ve 150 rpm karıştırma hızında, 12 saat boyunca çoğaltılmıştır. 12 saatin sonunda; çoğaltılan mikroorganizmalar 4 eşit hacme ayrılmıştır. 40 mL’lik mikroorganizma çoğaltılmış olan besi ortamı deneysel çalışmada mikroorganizma kaynağı olarak kullanılmıştır.

Diğer yandan 4 ayrı steril erlen biyoreaktöre 100’er mL taze sıvı besi ortamı eklenmiştir. 100 mL’lik biyoreaktörler 1.1, 1.2, 2.1 ve 2.2 olarak numaralandırılmıştır.

Kaynak besi ortamından 2 adet 10 mL’lik numune santrifüj tüplerine alındıktan sonra 10 dk (25°C, 3000 rpm) boyunca santrifüjlenmiş, besi ortamından mikroorganizmanın ayrılması sağlanmıştır. Santrifüj tüpünün dibinde kalan mikroorganizmalar alınıp 1.1 ve 1.2 numaralı biyoreaktörlere aktarılmıştır. 2.1 ve 2.2 numaralı biyoreaktörlere ise kaynaktan alınan 10 mL’lik S. cerevisiae içeren besi ortamı santrifüjlenmeden aktarılmıştır. Deneysel çalışma adımları şekil 4.6’da gösterilmiştir.

4 biyoreaktörde de şartların aynı olması için; çoğaltma işlemi eş zamanlı olarak

başlatılmıştır. 100 mL’lik biyoreaktörlere aktarımlar yapıldıktan hemen sonra (t=0 st anında) mikroorganizma derişimi ve canlı hücre sayımı için numuneler

alınmıştır. Canlı hücre sayımı için gerekli seyreltmeler yapılarak petrilere ekimleri yapılmıştır. 100 mL’lik erlen biyoreaktörlerde 8 saat boyunca; 34.7 °C sıcaklık, 150 rpm çalkalama hızında inkübasyon işlemi devam etmiştir. 8 saatlik çoğaltma işlemi sonunda bütün biyoreaktörlerden numuneler alınıp mikroorganizma derişimi analizleri yapılmıştır. Diğer yandan ise 1.1 ve 2.1. numaralı biyoreaktörlerden numuneler alınıp, canlı mikroorganizma sayımı yapılması için petri ortamlarına ekimleri yapılmıştır. En son olarak da; 8. saatin sonunda ortamdan alınan numuneler ile beta glukan ve glikoz analizleri yapılmıştır.

39

Şekil 4.7 Santrifüj sonrası numuneler

40 mL

Sıvı Besi Ort. + Mikroorganizma

100 mL Besi ortamı 10 mL

3000 rpm, 10dk Santifüjlenmiş

10 mL 3000 rpm, 10dk

Santifüjlenmiş

10 mL Santifüjlenmemiş

10 mL Santifüjlenmemiş

100 mL Besi ortamı 100 mL

Besi ortamı 100 mL

Besi ortamı

Katı-Katı Aktarım

1.1 1.2 2.1 2.2

Şekil 4.6 Deneysel çalışmanın şematik gösterimi

40

4.9 Havalandırmanın Beta Glukan Verimine Etkisinin İncelenmesi

S.cerevisiae mayasının farklı çoğalma koşullarında beta glukan içeriğinin değişkenlik gösterdiği bilinmektedir. Beta glukan içeriğine oksijen derişiminin etkisini incelemek amacıyla farklı havalandırma koşullarında, 4 ayrı biyoreaktörde mikroorganizma çoğaltma deneyi gerçekleştirilmiştir. Deneysel çalışmalar; aynı taze katı besi ortamından sırasıyla 5 mL, 50 mL ve 500 mL’lik sıvı besi ortamlarına mikroorganizma aktarımı ardından 34.7 ^oC ve 150 rpm karıştırma hızında inkübatörde çoğaltılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Hava beslemesiz (mikrobiyolojik filtreli), hava beslemeli (1 vvm hava akışlı), anaerobik (t=0’da azot geçirilerek ortamdaki oksijen uzaklaştırılmış ve izole edilmiş) ve 4. saatten itibaren 1 vvm hava akışlı erlen biyoreaktörlerde çeşitli havalandırma profilleri uygulanmış ve mikroorganizma çoğalması sürdürülmüştür (Şekil 4.8). Mikroorganizmaların çoğalma süresi olan 8 saatin sonunda biyoreaktörlerden alınan örnekler, Bölüm 4.4’teki adımlar izlenerek ekstrakte edilmiştir.

Farklı havalandırma koşulları ile mikroorganizmanın metabolik yol izlerinde farklılıklar yaratılarak beta glukan veriminin değiştirilebildiği gözlenmiştir ve bundan hareketle deneysel çalışmalara O2 ile devam edilmiştir.

41

Şekil 4.8 Farklı havalandırma profilleri deneyi

4.10 Oksijen Derişiminin Beta Glukan Verimine Etkisinin İncelendiği Deneyler

Tez çalışmasının bu bölümünde farklı oksijen derişimlerinin beta glukan verimine etkilerini incelemek için üç ayrı deneysel çalışma gerçekleştirilmiştir.

4.10.1 Kesikli oksijen beslemesi

Farklı oksijen derişimlerinin mikroorganizma ve beta glukan verimi üzerine etkisinin incelenmesi ve aynı zamanda biyoreaktöre beslenebilecek oksijen limitlerinin anlaşılabilmesi amacıyla üç ayrı oksijen derişiminde çalışılmıştır. Deneysel çalışmada ağzı kapalı, hava izolasyonu bulunan, ağzı tıpalı, steril 100 mL’lik biyoreaktörlerde çalışılmıştır.

42

İlk olarak mikroorganizma katı besi ortamından, 15 mL’lik sıvı besi ortamına aktarılmıştır. Bölüm 4.4’te anlatıldığı şekilde 1:10 ölçek büyütme oranı ile çalışılmıştır.

Daha sonra kaynak biyoreaktörden 5’er mL ayrılmış ve santrifüjlenerek 50 mL’lik, pH’ı 4.8 olarak ayarlanmış olan taze sıvı besi ortamları bulunduran üç adet biyoreaktöre laminer akışlı kabinde aktarılmıştır. Mikroorganizma aktarımı yapıldığında (t=0 st anında) mikroorganizma derişimi ve canlı hücre sayımı için numuneler alınmıştır.

Mikroorganizma aktarımı yapıldıktan hemen sonra biyoreaktörlerin ağzı tıpa ile kapatılmıştır. Kapatılan biyoreaktörlerden iki dakika boyunca azot geçirilmiş, içerideki tüm oksijen süpürülmüştür. Tüm izolasyonları sağlandıktan sonra KB-1 numaralı biyoreaktöre hiç oksijen beslenmemiş, KB-2 numaralı biyoreaktöre sadece başlangıçta 25 mL (102.3 mmol) oksijen beslenmiş, KB-3 numaralı biyoreaktöre ise sadece başlangıçta 50 mL (204.6 mmol) oksijen beslenmiştir. Deneysel çalışma boyunca t=0 st anından itibaren her saat başı biyoreaktörlerin tepe boşluğundan oksijen numunesi alınıp, gaz kromatografi cihazında analizi yapılmıştır. Mikroorganizma çoğalması boyunca ortamda sadece O₂ değil, başlangıçta oksijenin süpürülmesi için kullanılan N₂ gazı ve fermentasyon sonucu oluşan CO2’de bulunmaktadır. Fakat kullanılan kolon ve metod şartları göz önünde bulundurulduğunda gaz kromatografi cihazında sadece oksijen analizi gerçekleştirilmiştir. 34.7 °C sıcaklık ve 150 rpm karıştırma hızına set edilmiş olan inkübatörde 8 saat boyunca mikroorganizma çoğaltma işlemi sürdürülmüştür. Deneysel çalışmanın şematik gösterimi şekil 4.9’da, inkübatörde çoğaltma esnasındaki görüntüleri ise şekil 4.10’da verilmiştir.

43

Şeki l 4.10 İnkübatörde çoğaltma işlemi devam ederken biyoreaktörler

5 mL m.o.

25 mL Oksijen 15mL

Sıvı Besi Ort.+ Mikroorganizma

5 mL m.o.

Oksijensiz

5 mL m.o.

50 mL Oksijen

50 mL Besi ortamı 50 mL

Besi ortamı 50 mL

Besi ortamı

Katı-Katı Aktarım

KB-1 KB-2 KB-3

Şekil 4.9 Deneysel çalışmanın şematik gösterimi

44 4.10.2 Oksijen besleme profilleri

Tez çalışmasının bu bölümünde biyoreaktörlere beslenen oksijen miktarının değişik aralıklarla (2 saatte bir), değişik oranlarda beslenmesiyle oluşturulan profillerin beta glukan verimine etkisi incelenmiştir. Bunun için dört ayrı biyoreaktörde farklı oksijen profillerinde çalışılmıştır. Deneysel çalışmaya başlamadan önce biyoreaktörlerin hepsinden 2 dakika boyunca azot geçirilmiş, içeride kalan tüm oksijen süpürülmüştür.

Daha sonra AB-25-I ve II numaralı biyoreaktörlere toplam 25 mL (102.3 mmol) oksijen beslenmiş, AB-50-I ve II numaralı biyoreaktörlere ise toplam 50 mL (204.6 mmol) oksijen beslenmiştir. Bu oksijen miktarlarının biyoreaktörlere besleme profilleri çizelge 4.2’de, inkübatörde çoğalmanın devam ettiği biyoreaktörler de şekil 4.11’de verilmiştir.

Çizelge 4.2 Oksijen besleme profilleri tablosu

Profil No

t=0 st’te beslenen O2

hacmi, mL

t=2 st’te beslenen O2 hacmi, mL

t=4 st’te beslenen O2 hacmi, mL

Eklenen toplam O2

hacmi, mL

AB-25-I 5 10 10 25

AB-25-II 10 10 5 25

AB-50-I 10 20 20 50

AB-50-II 20 20 10 50

Şekil 4.11 Oksijen besleme profil deneyi esnasında biyoreaktörler

45

Sekiz saat boyunca; her iki saatte bir, biyoreaktöre oksijen eklenmeden önce ve eklendikten sonra GC cihazında oksijen analizi yapılmıştır. Deneyin başlatıldığı ve 8.

saatin sonunda canlı mikroorganizma sayımı ve mikroorganizma derişimi için numuneler alınmıştır. Ayrıca deneysel çalışmanın sonunda beta glukan ekstraksiyonu yapılmış ve glikoz analizleri de gerçekleştirilmiştir.

4.10.3 Çoğaltma süresinin etkisi

Bölüm 5.5.3’te anlatılacağı üzere mikroorganizma çoğalması için 8 saatin yetersiz olduğu değerlendirilerek çoğaltma işleminin 12 saat boyunca sürdürülmesine karar verilmiştir. Farklı oksijen derişimlerinin denendiği çalışma tekrarlanmıştır. Tıpalı biyoreaktörlere ek olarak bir mikrobiyolojik filtreli biyoreaktör de deney setine eklenmiştir. Böylece farklı koşulları temsil eden biyoreaktörler; MF (mikrobiyolojik filtreli), KB-1 (oksijensiz), KB-2 (25 mL, 101.3 mmol oksijen) ve KB-3 (50 mL, 203.7 mmol oksijen) olarak kodlanmıştır. Deney başlatıldığı anda (t=0 st); oksijen analizi, mikroorganizma derişimi analizi, canlı mikroorganizma sayımı yapılmıştır.

Deneysel çalışma boyunca her iki saatte bir mikroorganizma derişimi analizi yapılmıştır. 12. saatin sonunda tekrar canlı mikroorganizma sayımı yapılmış olup, glikoz analizi ve beta glukan ekstraksiyonu işlemleri de gerçekleştirilmiştir.

4.11 İstatistiksel Deneysel Tasarım Çalışmaları

Deneysel çalışmada, 100 mL’lik steril, hava izolasyonu sağlanmış biyoreaktörler kullanılmıştır. S.cerevisiae’den ekstrakte edilen beta glukan verimini (g beta glukan/g kmo) maksimum yapan optimum oksijen ve glikoz derişim değerlerinin bulunması amacıyla tam faktöriyel tasarım uygulanmıştır. Deneysel çalışmada 50 mL’lik çalışma hacminde, 34.7 °C ve 4.8 pH koşullarında çalışılmıştır. Şekil 4.12’de biyoreaktörlerin sterillenmiş ve laminer flow kabinindeki hali görülmektedir.

46

Şekil 4.12 İstatistiksel deneysel tasarım çalışmasında kullanılan biyoreaktörler

Bu yüksek lisans çalışması kapsamında beta glukan verimini arttırmak amacıyla iki seviyeli tam faktöriyel deney tasarımı uygulanmıştır. Öncelikle küçük biyoreaktörlerde ön çalışmalar yapılarak, sistemin sınırları belirlenmiştir. Daha sonra 3 merkez nokta seçilerek, biyoreaktöre beslenen toplam oksijen mol miktarı ve substrat derişimi değiştirilerek eş zamanlı olarak, 11 setlik deney gerçekleştirilmiştir. Deneysel çalışmalar bittikten sonra Design Expert programı çıktısı olan grafikler, ANOVA tablosu ve regresyon modeli incelenmiş ve en yüksek beta glukan verimi elde edilen koşullara karar verilmiştir.

Deneysel çalışmada glikoz derişimleri ve oksijen hacimleri (mol miktarları) değiştirilerek, çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Deneysel çalışmanın başında ve sonunda, mikroorganizma derişimi analizleri, glikoz analizleri, beta glukan ekstraksiyonları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca GC’de de oksijen analizleri yapılmıştır. Çoğaltma işlemleri 12 saat boyunca sürdürülmüştür. Çizelge 4.3’te deneysel tasarım için faktör seviyeleri verilmiştir.

47 Çizelge 4.3 Deney tasarımı-I için faktör düzeyleri

Deney No (#)

Faktör Düzeyleri Gerçek Değişkenler

A B Glikoz derişimi, g/L Oksijen hacmi, mL

1 -1 -1 20 0

2 -1 -1 20 0

3 1 -1 60 0

4 1 -1 60 0

5 0 0 40 25

6 0 0 40 25

7 0 0 40 25

8 1 1 20 50

9 1 1 20 50

10 1 1 60 50

11 1 1 60 50

Şekil 4.13 Deneysel çalışma esnasında biyoreaktörler

İlk yapılan tasarım deneyinden sonra, deney sonuçları irdelenmiş ve ikinci bir deneysel tasarım yapılarak daha yüksek glikoz derişiminde çalışılması kararı alınmıştır. Çizelge 4.4’te çalışılan faktör düzeyleri kodlanmış ve gerçek değerleri olarak verilmiştir.

48 Çizelge 4.4 Deney tasarımı-II için faktör düzeyleri

Deney No (#)

Faktör Düzeyleri Gerçek Değişkenler

A B Glikoz derişimi, g/L Oksijen hacmi, mL

1 -1 -1 60 0

4.12 Pilot Ölçekli Biyoreaktör Deneyi

İkinci olarak gerçekleştirilen istatistiksel deneysel tasarım deneyinin merkez noktası olan 25 mL oksijen ve 130 g/L glikoz derişiminde biyoreaktör deneyi gerçekleştirilmiştir. Deneysel çalışma şekil 4.14’teki deney düzeneğinde, şekil 4.15’te görülen 5 L’lik çelik biyoreaktörde gerçekleştirilmiştir. 1500 mL çalışma hacminde çalışılmıştır. Biyoreaktörün 3500 mL’ lik boşluk hacmindeki havadaki oksijen miktarı teorik olarak hesaplandığında, deneysel tasarım sonuçlarına göre orta nokta olarak belirlenen oksijen hacmini içerdiği belirlenmiştir. Böylece çelik biyoreaktöre maya çoğaltılması boyunca hava ya da oksijen beslemeden küçük ölçekteki deneysel çalışma koşulları bire bir olarak büyük ölçekte gerçekleştirilmiştir. Ayrıca deneysel çalışma gerçekleştirilirken steril koşullarda taze besi ortamı ve mikroorganizma aktarımından sonra biyoreaktör giriş ve çıkışları tamamen kapatılmış olup, içeri olası bir hava girişi engellenmiştir. Deney başında ve sonunda mikroorganizma derişimleri analizlenmiş olup, aynı şekilde 12 saatlik çoğaltma işlemi sonunda da mikroorganizma derişimi analizi, beta glukan analizi ve DNS yöntemi ile glikoz analizleri gerçekleştirilmiştir.

49

Şekil 4.14 Deney düzeneği

50

Şekil 4.15 5 L’lik çelik biyoreaktör sistemi

51 5. ARAŞTIRMA BULGULARI

5.1 Canlı Mikroorganizma Sayımı

Canlı mikroorganizma sayımının yapılışı Bölüm 4.3’te detaylı olarak anlatılmıştır.

Deneyler 2 tekrarlı olup, mikroorganizma sayıları Çizelge 5.1’de verilmiştir.

Çizelge 5.1 Çeşitli seyreltme oranları için mikroorganizma ekiminden 24 st sonraki koloni sayıları

Yukarıdaki tabloda mikroorganizma sayımının rahatça yapılabilmesi için gerekli olan seyreltme oranının 10⁵ olduğu görülmüştür. Kaynak olan 20 mL’lik ortamda bulunan canlı mikroorganizma sayısı (CFU) eşitlik 4.1’ten aşağıdaki şekilde hesaplanmıştır.

Örnek hesaplama; içinde görülmektedir. Aynı şekilde şekil 5.2, 5.3, 5.4 ve 5.5’te ise sırasıyla 10⁴, 10⁵, 10⁶ ve 10⁷ oranlarında seyreltmeler yapılan petri kapları görülmektedir. 10⁵ seyreltme

52

oranının 8 saatlik çoğalma boyunca canlı mikroorganizma sayımı için en uygun seyreltme oranı olduğu gözlenmiş ve tüm deneylerde canlı mikroorganizma sayımına 10⁵ seyreltme oranı ile devam edilmiştir.

Şekil 5.1 Ekim yapıldıktan 24 st sonra petri kapları

Şekil 5.2 10⁴ seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü

53

Şekil 5.3 10⁵ seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü

Şekil 5.4 10⁶ seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü

54

Şekil 5.5 10⁷ seyreltme oranlı aktarımın 24 st sonraki görüntüsü

5.2 Kalibrasyon Çalışmaları

5.2.1 Mikroorganizma derişimi kalibrasyonu

Kalibrasyon çalışmasının yöntemi Bölüm 4.4’te anlatılmıştır. Mikroorganizma içeren örneklerin absorbanslarına karşılık gelen kuru mikroorganizma derişimleri grafiğe geçirilmiştir. Kuru mikroorganizma derişimi-absorbans kalibrasyon grafiği şekil 5.6’da, verilmiştir. Absorbans değerlerine karşı kuru hücre derişiminin verildiği grafikte doğru denklemi y=1.304x ve belirtme katsayısı R²=0.983 olarak bulunmuştur. Bu yüksek lisans tez çalışması boyunca yapılan tüm deneylerde mikroorganizma derişimin belirlenmesi amacıyla hazırlanan bu kalibrasyon doğrusu kullanılmıştır.

55

Şekil 5.6 Kuru mikroorganizma derişimi kalibrasyon grafiği

5.2.2 Glikoz derişimi kalibrasyonu

Mikroorganizma çoğalma ortamındaki glikoz derişiminin belirlenmesi amacıyla kullanılan glikoz kalibrasyonu için farklı glikoz derişimlerinde çözeltiler hazırlanıp, Bölüm 4.6’da açıklandığı şekilde analizleri yapılmıştır. Numunelerin tek tek absorbans değerleri okunmuş ve oluşturulan kalibrasyon grafiği şekil 5.7’de verilmiştir.

y = 1,304x R² = 0,9832

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Absorbans , nm

Kuru Mikroorganizma Derişimi, g kmo/L

56

Şekil 5.7 DNS yöntemi ile glikoz analizi kalibrasyon grafiği

5.2.3 Oksijen derişimi kalibrasyonu

Gaz kromatografi cihazında yapılan analizlerde, gaz tight enjektörle saf O₂ kaynağından farklı hacimlerde (farklı mol sayılarında) O₂ çekilip, gaz kromatografi cihazına enjekte edilmiştir. Kalibrasyon grafiği şekil 5.8’de verilmiş olup, kromatogramdaki pik alanına

Gaz kromatografi cihazında yapılan analizlerde, gaz tight enjektörle saf O₂ kaynağından farklı hacimlerde (farklı mol sayılarında) O₂ çekilip, gaz kromatografi cihazına enjekte edilmiştir. Kalibrasyon grafiği şekil 5.8’de verilmiş olup, kromatogramdaki pik alanına

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ (sayfa 47-0)