Maya çoğalmasını etkileyen faktörler

Çoğalma koşulları aşağıda verilen parametrelere bağlı olarak maya gelişimini ve beta glukan yapısını (dallanma derecesi, bağlı olan glikoz monomer sayısı vb.) etkilemektedir.

 Sıcaklık Etkisi: Mikroorganizma büyümesini en çok etkileyen, en önemli fiziksel parametrelerden biri sıcaklıktır. Hücre gelişimini, çoğalmalarını, çeşitli metabolik aktivite yol izlerini belirleyen önemli bir etkendir (Walker 1999). Mikroorganizma çoğaltılacak olan bir biyoreaktörde uygun bir sıcaklık söz konusu değilse;

mikroorganizmalar normal büyüme, gelişme ve çoğalma gibi yaşamsal faaliyetlerini gerçekleştiremeyebilirler. Laboratuvar şartlarında üretilen ya da endüstriyel olarak üretilen mayaların genel olarak optimum çoğalma sıcaklıkları 20-30 °C aralığında değişmektedir. Her mikroorganizmanın kendine özgü bir Tmin, Tmax ve Toptimum

sıcaklık değerleri vardır. Tmax değerleri maya türlerinde 20-50 °C arasında değişiklik göstermektedir. Örneğin; Saccharomyces cerevisiae mayasının Tmax değerleri 35-43

°C aralığındadır. Tmax değerleri türlere göre değişiklik gösterdiği gibi mayanın çoğalma ortamı faktörlerine (karbon kaynağı, oksijen derişimi, su ve etanol derişimleri) göre de değişiklik gösterebilmektedir. Yüksek sıcaklıklar mayalarda çeşitli enzimlerin salgılanmasına engel olabilir, hatta enzim yapılarının bozulmasına sebep olabilir. Yüksek sıcaklıklar mayaların hücre gelişimi olmadan çoğalmalarına sebep olmaktadır. Ayrıca besi ortamında ise çoğalma esnasında yüksek oranlarda alkol oluşmaktadır ve besi ortamında yüksek derişimlerde bulunan alkol miktarının maya çoğalmasını inhibe edici bir etkisi vardır (Uscanga ve François 2003).

 pH: Mayaların çoğaldığı besi ortamı pH’ı hücre büyümesi ve hayatlarını sürdürebilmeleri için önemli bir faktördür. Mayalar genel olarak en iyi büyüme evrelerini 4.5-6.5 pH’ta göstermektedir (Lopez vd. 2009). Bazı maya türleri 3-8

21

pH’ta da çoğalabilmektedir (Walker 1999). Çoğalma esnasında ortamda oluşan karbondioksit ve ikincil metabolitler ortam pH’ını düşürmektedir. Besi ortamındaki pH düşüşünden mikroorganizmalar negatif yönde etkilenir ve çeşitli ürünlerin verimini etkiler (Morata ve Loira 2017). Besi ortamını asidik hale getirmek için organik asitler (asetik asit, laktik asit gibi) yerine asitler (hidroklorik asit, fosforik asit gibi) tercih edilmelidir. Çünkü organik asitlerin mikroorganizma büyümesini inhibe edici özellikleri, inorganik asitlere göre daha yüksektir (Walker 1999).

 O2 derişimi: Mayalar fakültatif olarak adlandırılan; hem oksijenli hem de oksijensiz solunum yaparak çoğalan mikroorganizmalardır. Besi ortamında yeterli miktarda oksijen varsa, uygun havalandırma koşulları söz konusu ise; mikroorganizma çoğalması sonucu ortamda su ve karbondioksit oluşur. Besi ortamında oksijen bulunmadığı takdirde ise etil alkol ve karbondioksit artışı olmaktadır.

Havalı ortamda (mikroorganizma oksijenli solunum yapıyorsa);

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6 H2O + 688 kcal (3.2)

Havasız ortamda (mikroorganizma oksijensiz solunum yapıyorsa);

C₆H₁₂O₆ 2C₂H₅OH+6CO₂ + 6 H₂O + 56 kcal (3.3)

Maya çoğaltılan biyoreaktöre beslenen hava ile ortama verilen oksijen, sıvı besi ortamında çözünerek mikroorganizmalar tarafından enerji üretmek için kullanılır.

Maya üretimi yapılırken uygun amaca yönelik bir yöntem seçilmelidir. Örneğin bira üretiminde oksijensiz solunum şartları sağlanmalı, maya üretiminde ise oksijenli solunum koşulları sağlanmalıdır (Yılmazer 2009).

Çözünmüş oksijen; aerobik fermantasyonlarda mikroorganizmaların besinleri kullanabilmeleri ve metabolik faaliyetlerini devam ettirebilmeleri için gerekli olan temel ve önemli bir substrattır. Oksijen suda kısmen çözündüğünden (oksijenin sudaki çözünürlüğü: 30 °C’ de 8 mg/L) sınırlayıcı substrat olabilir (Shuler ve Kargi

22

1992). Yüksek hücre derişimlerinde; oksijen tüketim hızı, oksijen sağlama hızından büyük olduğunda oksijen kısıtlaması ortaya çıkmaktadır.

Besi ortamındaki çözünmüş oksijen derişimi (DO), kritik değerin altına (doygunluk değerinin %5-10’u) düştüğünde, S. cerevisiae mikroorganizması

oksijensiz solunum yapmaya yani etanol üretmeye başlar. Ortamdaki etanol konsantrasyonu eğer % 5’in üzerindeyse, etanol mayalar için inhibe edici özelliktedir (Shuler ve Kargi 1992). Hacimsel olarak % 25 etanol içeren ortamda yaşayabilen bazı maya türleri de mevcuttur (Soyuduru 2007).

Çözünmüş oksijen derişimi ya da oksijen kısmi basıncı glikoliz (glikoz yıkılması) hızını düzenleyici bir etkiye sahiptir. Mikroorganizmanın anaerobik solunumdaki glikoz tüketim hızı, aerobik solunumdaki glikoz tüketim hızından daha fazladır.

Fermantatif şeker metabolizmasının, oksijen tarafından inhibe edilmesine “Pasteur Etkisi” adı verilmektedir. Çözünmüş oksijen derişiminin düşük olduğu durumlarda substrat tüketimi ve karbondioksit oluşum hızı azalır. Düşen glikoz tüketim hızı enzim yarışması teorisi ile açıklanmaktadır. Fermantasyon prosesinde glikoz eğer çok fazla ise Pasteur etkisi S. cerevisiae’de geçerliliğini yitirir (Walker 1999).

Ayrıca oksijenin mikroorganizma hücre duvarı ve hücre zarı oluşumunda önemli bir etkisi bulunmaktadır. Oksijen derişim farklılıkları mikroorganizma üzerinde strese sebep olmakta ve hücrelerde bu stres unsuruna karşı çeşitli adaptasyonlar görülmektedir (Gibson 2007). Oksijen stresine karşı göstermiş olduğu cevap yöntemleri hücre duvarı bileşenlerinin üretiminde de etkilidir. Örneğin; bira mayasında hücre zarı biyosentezini sağlamak için fermantasyondan önce oksijen gereksinimi vardır. Yeterli moleküler oksijenin sağlanamaması, hücre zarlarını etanol toksisitesine daha duyarlı hale getirecek ve bu da maya büyümesini ve mayanın fermantasyon kabiliyetini kısıtlayacaktır (Walker 1999).

23

Bu tez çalışması kapsamında istatistiksel deneysel tasarım deneylerinde yanıt olarak oksijen tüketimine bağlı beta glukan verimi de tanımlanmış, Eşitlik 3.4’te verilmiştir.

( )

(3.4)

 Karbon kaynağı ve derişimi: Besi ortamında mikroorganizma gelişimine en büyük etkide bulunan, enerji kaynağı olarak da kabul edilen karbon kaynaklarıdır.

Genellikle maya üretiminde glikoz karbon kaynağı olarak kullanılmaktadır.

Mayaların kullanabildiği karbon kaynaklarının bazıları; fruktoz, galaktoz, maltodekstrinler, nişasta, metanol, etanol, gliserol, asetat, sitrat, oleatlar, fenoller, ürik asit, pentilamindir (Walker 1999). Mayadan hangi ürün elde edilmek isteniyorsa, substrat seçimi de o yönde olmalıdır. Örneğin; Saccharomyces cerevisiae mayasını verimli bir şekilde çoğaltmak ve iyi bir fermantasyon sağlamak amacıyla; glikoz, fruktoz, mannoz, galaktoz, sükroz ve maltoz şekerleri kullanılmalıdır. Eğer mayanın solunum yapması amaçlanıyorsa; etanol, asetat gibi karbon kaynakları kullanılmalıdır. Çeşitli çalışmalarda karbon kaynağı türünün maya çoğalmasına ve çeşitli hücre materyallerine etkisinin çok ciddi boyutlarda olduğu belirtilmiştir (Uscanga ve François 2003).

Karbon kaynağı derişiminin fazla olması mikroorganizmalarda inhibisyona sebep olmaktadır. Mikroorganizma çoğaltılan bir biyoreaktörde substrat derişiminin fazla olması, diğer bir deyişle mayaların aşırı şekere maruz kalması; ortamda oksijen olsa dahi mayaların oksijensiz solunum yapmasına ve etanol üretilmesine sebep olur. Bu etkiye “Crabtree Etkisi” adı verilmiştir (Walker 1999). Mikroorganizma üretmek amacıyla çalışılıyorsa, bu duruma dikkat edilmelidir. Bu etki Pasteur Etkisi’nin tersi olarak da adlandırılmaktadır. İnhibisyon sınırları maya türünden, substrat türüne değişiklik göstermektedir. Maya üretiminde, havalı koşullarda glikoz derişimi üst sınırının 200 g/L olduğu belirtilmektedir (Shuler and Kargi 1992).

24

Bu tez çalışması kapsamında istatistiksel deneysel tasarım deneylerinde de diğer bir yanıt olarak da substrat tüketimine bağlı beta glukan verimi de tanımlanmış, Eşitlik 3.5’te verilmiştir.

( )

(3.5)

 Besi ortamı bileşimi: Besi ortamında bulunan bileşikler ve bileşimleri Bölüm 4.2’ de detaylı olarak verilmiştir.

 Karıştırma hızı: Mikroorganizmanın çoğaltılacağı biyoreaktörde bir karıştırıcı varsa onun hızı ve tipi önemlidir. Karıştırma hızının çok yüksek olması durumunda hem biyoreaktörde vorteks oluşumu gerçekleşebilir hem de mikroorganizma hücreleri zarar görebilir. Mikroorganizma üzerinde stres yaratabilir ve bu negatif etkiler çeşitli şekillerde (mikroorganizma çoğalmasının azalması, canlı hücre sayısının azalması vb.) gözlemlenebilir.

 Biyoreaktör işletim türü: Biyoreaktör işletim türleri kesikli, yarı-kesikli, sürekli ve immobilize işletim olmak üzere dörde ayrılmaktadır.

Kesikli işletim genel olarak endüstriyel üretimlerde kullanılmaktadır.

Mikroorganizma aktivitesini kaybedene kadar çoğalma işlemi sürdürülür, daha sonra biyoreaktörde istenilen mikroorganizma yoğunluğuna ya da istenilen ürün derişimine ulaşıldığı anda reaktör tamamen boşaltılır ve tekrar sterillenir.

Mikroorganizma ve besi ortamı biyoreaktöre t=0 st anında beslenir ve fermantasyon işlemi boyunca biyoreaktöre herhangi bir besleme yapılmaz. Mayanın oksijenli solunum yapılması isteniyorsa biyoreaktöre sadece hava beslemesi yapılır.

Geleneksel bira mayalama işlemi bu işletim türünde gerçekleştirilir.

Yarı-kesikli işletimde fermantasyon boyunca karbon kaynağı (substrat) beslemesi yapılmaktadır. Biyoreaktörde çoğalma devam ettikçe toplam hacim zamanla

25

artmaktadır. Endüstride ekmek mayası üretiminde kullanılmaktadır (Yılmazer 2009).

Sürekli işletimde; biyoreaktöre substrat beslemesi yapılır, ürün de biyoreaktörden uzaklaştırılır. Genellikle fabrikaların arıtma tesislerinde kullanılan bir işletim türüdür (Walker 1999, Kim ve Yun 2006).

İmmobilize işletim; mikroorganizmalar fiziksel olarak biyoreaktör içinde alıkonularak uygulanır. Kesikli işletim türünün ekonomik olmaması üzerine yeni yöntem arayışları sonucu immobilize hücre teknolojisi geliştirilmiştir. Reaktördeki hücre yoğunluğu arttıkça, reaktör verimliliği de artmaktadır. Biyoreaktörde; hücreler biyoreaktör dışına süpürülmeden yüksek substrat akış oranlarının uygulanmasına olanak sağlanmaktadır. Kontaminasyon riski daha düşüktür. İhtiyaç duyulan reaktör hacmi, kesikli işletim türüne göre daha küçük olduğu için, yatırım maliyeti de düşük olacaktır. İyon değiştirici reçine, jelatin ve glutaraldehit, odun yongası, kalsiyum aljinat, pektin vb. gibi taşıyıcılara bağlanarak immobilize edilmiş hücreler ile biyoreaktörler işletilmektedir (Özçelik ve Dönmez 1988).

 Mikroorganizma aktarım oranı: Mikroorganizma çoğaltma işlemlerinde aktarım oranı verimlilik açısından önemli bir parametredir. Çok küçük hacimlerde çoğaltılan mikroorganizma, büyük hacimlerdeki besi ortamına direkt olarak aktarıldığında mikroorganizma büyümesi başarısız olmaktadır. Bu durum, düşük hücre yoğunluğunda hücrelerarası etkileşimlerin olamaması sonucu çoğalamadıklarından kaynaklıdır. Çeşitli çalışmalarda hacimce % 1-25 oranı aralığında aktarımlar yapıldığı görülmüştür. Mikroorganizma türüne göre optimum aktarım oranı % 1-10 aralığında olduğu görülmüştür (Walker 1999). Örneğin; alkol fermantasyonunda uygulanan aktarım oranı %1’dir. Bursalı vd. (2001)’nin yapmış oldukları çalışmada 1:10’luk aktarım oranı uygulanmıştır. Bu yüksek lisans çalışmasında da aynı maya suşu kullanıldığı için 1:10 oranında çalışmalar gerçekleştirilmiştir.

26

 Ön çoğaltmada santrifüj etkisi: Mikroorganizmalar çoğaldıkları ortamda sekonder metabolitler (etanol, CO2 vb.) oluşturmaktadır. Mikroorganizma üretimi için negatif etkisi olabilecek olan bu yan ürünlerin, yeni bir besi ortamına mikrooganizma ile birlikte aktarılmamalıdır. Literatürdeki çalışmalarda ve endüstriyel üretim proseslerinde mikroorganizma besi ortamından santrifüjlenerek ayrıştırılmaktadır.

Ayrıca mikroorganizma aktarım oranlarının tam olarak uygulanabilmesi de bu yöntemle sağlanabilmektedir (Walker 1999).