Mayaların Endüstriyel Uygulamaları

3. KURAMSAL TEMELLER

3.2 Mayaların Endüstriyel Uygulamaları

Bölüm 3.1.’de de bahsedildiği üzere, insanoğlu milattan önceki dönemlerde de mayaları; alkol yapımı ve ekmek yapımında kullanmışlardır. Zamanla süt sığırcılığı yapılan bölgelerde de ekşitilmiş mamüller, peynircilik (küflü peynirler vb.) de gelişmiştir. 2003 yılında dünya üzerinde üretilen maya miktarı 2.5 milyon tonu geçmiştir (Borchani 2014). Maya biyoteknolojisi geliştikçe aşağıdaki endüstrilerde çalışmalar giderek hız kazanmaktadır (Walker 1999).

 Fermantasyon Endüstrileri (mayalama, biyoetanol üretimi, yeni geliştirilen fermantasyon ürünleri)

 Gıda/Kimyasal Endüstriler (lezzetlendiriciler, asitlik düzenleyiciler, iştah açıcılar, kimyasal indirgeyiciler)

 Çevresel Teknolojiler (biyoremediasyon, atıkları değerlendirme, bitki koruma, metallerin biyosorpsiyonu)

 Biyomedikal Araştırmalar (Kanser ve AIDS gibi hastalıklar, ilaç

metabolizmaları, genotoksisite görüntülenmesi, insan kalıtsal hastalıkları)

 Sağlık Hizmetleri Endüstrisi (İlaçlar, aşılar, probiyotikler, hormonlar, kan faktörleri)

 Temel Biyolojik Araştırmalar (hücre biyolojisi, genetik, biyokimya, moleküler biyoloji)

12 3.3 Beta Glukanın Yapısı ve Kaynakları

Beta glukan D-glikoz monomerlerinin beta glikozidik bağlarla birbirine bağlı olduğu doğal bir polisakkarittir. Genel formülü (C6H10O5)n olmakla beraber, beta glukanın OH -grubunun pozisyonu farklı beta glukan türlerini oluşturmaktadır. Doğada beta glukan doğrusal, zincirli ya da dallanmış yapılarda bulunmaktadır. Bazı beta glukan türleri;

β-(1,2) glukan, β-(1,3) glukan, β-(1,3)-(1,6) glukan, β-(1,2)-(1,3) glukan, β-(1,3)-(1,4) glukan vb. şekillerde bulunabilmektedir (Rahar vd. 2011).

Bu polisakkaritler; yulaf, arpa, buğday, çavdar gibi tahıllar ve deniz yosunu gibi çeşitli bitkiler tarafından üretilebildiği gibi mikroorganizmalar tarafından da üretilebilmektedir (Bacic vd. 2009). Beta glukan içeriği açısından mayalar diğer kaynaklara göre daha zengin olduğundan ticari beta glukan üretiminde tercih edilirler. Örneğin beta glukan içeriği yulaf ve arpada kuru ağırlık üzerinden % 2-7, diğer tahıllarda % 0.1-3.8 aralığında değişmektedir (Vatandoust 2012). Mayalar ise hücre kuru kütlesinin % 11-18’i kadar beta glukan içerebilmektedir (Manners 1975, Kim ve Yun 2006).

Beta glukanlar bazı patojenik bakterilerin (Pneumocystis carinii, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum, Candida albicans vb.) ve fungi alemi canlılarının (Saccharomyces cerevisiae vb.) hücre duvarı bileşenidir. Fungi hücre duvarının ana bileşenleri polisakkaritler ve glikoproteinlerdir. Örneğin;

Saccharomyces cerevisiae hücre duvarı üç tabakadan oluşmaktadır. İç tabakanın % 30-35’i suda çözünemeyen beta glukandan, orta tabakanın %20-22’si suda çözünebilen beta glukandan ve dış tabakasının %30’u ise glikoproteinden oluşmaktadır (Akramienê vd. 2007). Hücre duvarı dış katmanı, glikozile edilmiş mannoproteinlerden oluşmaktadır. Bu yapı; periplazmik proteinleri korur ve yabancı enzimlerin hücreye erişebilirliğini sınırlamaktadır. İç katman; beta glukan ve kitinden meydana gelmektedir. β-(1,3) glukan ve kitin plazma membranına bağlı olan enzim kompleksleri ile β-(1,6) glukan ise endoplazmik retikulumda sentezlenir ve hücre dışında işlenir.

Durağan faza geçmiş bir mayanın beta glukan yapısı yaklaşık olarak 1500 glikoz monomerinden oluşmaktadır (Yiğit ve Benli 2005).

13 a.

Şekil 3.2 Çeşitli beta glukan yapıları

a. β-(1,3)-(1,6) glukan yapısı, b. Halkalı β-(1,3)-(1,6) glukan yapısı (13 tane glikoz molekülü ile), c.

Halkalı β-(1,2) glukan yapısı (noktalı çizgiler hidrojen bağlarını göstermektedir).

Şekil 3.3 S.cerevisiae hücre duvarı materyalleri, beta glukan çeşitleri ve dizilişleri (Zechner-Krpan vd. 2009)

S. cerevisiae’da bulunan glukanın yaklaşık olarak %85’i β-(1,3) glukan, %3’ü β-(1,6) glukandan oluşmaktadır (Kim ve Yun 2006). Beta glukanın yan dalları hücre duvarının ara katmanında bulunur (Şekil 3.3) ve hücrenin rijitliğini ve şeklini korumasını sağlar (François vd. 2003).

Beta glukanların çözünürlüğü polimerizasyon derecesi ile alakalıdır. Beta glukanın polimerizasyon derecesi 100 DP’den büyük olduğunda suda çözünmemektedir (Ali 2009).

Farklı kaynaklardan elde edilen beta glukanın fiziksel, kimyasal ve sağlık üzerine etkilerinin farklı olması, temelde beta glukanın bu kaynaklarda farklı molekül yapısı ve dallanma şekillerinde bulunmasındandır. Agrobacterium sp., Bacillus sp., Euglena gracilis gibi türlerin yapısında lineer β-(1,3) glukan; Saccharomyces cerevisae, Candida albicans gibi türlerde bulunan beta glukan dallanmış β-(1,3)-(1,6) glukan; Hordeum vulgare, Avena sativagibi türlerde lineer β-(1,3)-(1,4) glukan; Laminaria sp., Schizophyllum commune gibi türlerde de lineer β-(1,3)-(1,6) glikozil glukan

bulunmaktadır (Bacic vd. 2009, Zechner-Krpan vd. 2009). Saccharomyces cerevisiae kaynağından elde edilen β-(1,3)-(1,6) glukan; parazit oluşumunu engelleyici, bakteri oluşumunu önleyici, virüs çoğalmasını inhibe edici, antifungal, antimutajenik, tümör oluşumunu engelleyici, hematopoetik uyarıcı özelliklere sahiptir. Candida albicans kaynağından elde edilen β-(1,3)-(1,6) glukanın immün sistemi uyarıcı aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Poria cocus kaynağından elde edilen β-(1,3)-(1,6) glukanın antitümoral etkisi olduğu görülmüştür. Yulaftan ekstrakte edilen β-(1,3)-(1,4) glukanın antimikrobiyal, antiparazitik; arpadan elde edilenin ise antimutajenik olduğu görülmüştür (Mantovani 2008). Beta glukanların klinik araştırma çalışmaları günümüzde de yoğun şekilde devam etmektedir. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda dallanmış yapıda olan β-(1,3)-(1,6) glukanın insan sağlığı üzerine etkisinin çok kapsamlı olduğu görülmüştür. Bu bağlamda; sağlığa olan etkileri ve düşük üretim maliyetleri açısından Saccharomyces cerevisiae mayası bu yüksek lisans çalışmasında beta glukan kaynağı olarak seçilmiştir.

3.4 Beta Glukanın Kullanım Alanları

Beta glukanlar; sağlık, ilaç, gıda, kozmetik, kimyasal endüstrilerinde, hayvancılık, besicilik ve veterinerlik gibi sektörlerde çok ciddi bir potansiyele sahiptir (Zhu vd.

2016).

Sağlık sektöründe her alanda beta glukanla ilgili çalışmalar sürmektedir. Beta glukan;

bağışıklık arttırıcı, antikarsinojenik, antimikrobiyal, antienfektif, yara iyileştirici, kan şekeri düzenleyici, kolesterol ve trigliserit düşürücü, radyoaktif koruyucu, sindirimi düzenleyici, kalp hastalıkları riskini azaltıcı, alerjik rinit standart tedavisine ek olarak destekleyici, tüberküloz enfeksiyonunu tedavi edici, menopoz semptomlarının azaltıcı ve osteoporoz önleyici bir gıda takviyesidir (Coşkun 2005, Kırmaz vd. 2005, Akramienê vd. 2007, Mantovani vd. 2008). Çin ve Japonya’daki kliniklerde immün sistem için beta glukan aktif olarak kullanılmaktadır (Ali 2009). Amerika Birleşik Devletleri’nde FDA tarafından hiperkolesterol tedavisi amacıyla yapılan beta glukan patentleri desteklenmektedir.

Gıda sektöründe de sağlıkla paralel olarak dünyadaki obezite problemleri için çeşitli otoriteler ve kurumlardan insanları beta glukana teşvik edici açıklamalar yapılmıştır.

FDA, EFSA, IDF gibi kuruluşlar; lif desteği olarak, yüksek kolesterolü düşürdüğü, sindirim sistemini düzenlediği, kan şekerini dengelediği dolayısıyla da kardiyovasküler hastalık riskini azalttığı için beta glukan tüketimini desteklemektedir. Sağlık açısından faydalı olması için; EFSA tarafından önerilen günlük tüketilmesi gereken minimum beta glukan miktarı 3 g’dır (Cloetens vd. 2012). Ayrıca; bisküvilerde, kurabiyelerde, süt ve süt ürünlerinde, mayonezlerde, sirkelerde kullanılmaktadır (Zechner-Krpan vd.

2009).

Kozmetik sektöründe özellikle hücre yenileyici özelliğinden dolayı beta glukan içerikli kremler bulunmaktadır. Yapılan çalışmalarda; epidermis hücrelerini yenilediği, yaşlılık etkilerini geciktirdiği, cilde esneklik kattığı görülmüştür (Yılmaz 2010). Birçok marka beta glukan içerikli serumlar, saç kremleri, vücut losyonları, cilt maskeleri gibi ürünleri piyasaya sürmüşlerdir.

Antibiyotiklerin hayvanlar ve dolayısıyla insanlar üzerindeki kötü etkileri sebebiyle hayvancılık sektöründe de beta glukan kullanılmaya başlanmıştır. Yapılan çalışmalarda hayvanlarda bağışıklık sistemi ve performans iyileştirmede etkili olduğu düşünülmektedir (Keser ve Bilal 2008).

3.5 Mayadan Beta Glukan Üretim Prosesi

Beta glukanın maya hücre duvarında kitin ve manoproteinlerle kovalent bağlarla bağlı olmasından dolayı izolasyonu için birtakım işlemler uygulanması ve analizlenmesi gerekmektedir. Bu aşama ile ilgili yapılan literatür çalışmalarında çeşitli ekstraksiyon yöntemleri kullanıldığı görülmüştür. Ekstraksiyon yöntemleri, sıcak alkali/asit veya her ikisinin birlikte uygulamalarını içermektedir (Fleet and Manners 1976, Jamas vd. 1986, Liu vd. 2006). Bu yüksek lisans çalışmasında, mikroorganizma hücre duvarından suda çözünemeyen beta glukan izolasyonu; Donsis’in 1993 yılına ait patenti uygulanarak gerçekleştirilmiştir.

Mayadan beta glukan üretim proses adımları; Saccharomyces cerevisiae mayası üretimi, maya hücre duvarının parçalanması, ekstraksiyon işlemleri, çeşitli yöntemlerle ayırma ve saflaştırma işlemleri ve en son olarak da kurutma işlemidir.

 Biyoreaktörde Saccharomyces cerevisiae üretimi

Tüm canlı organizmalar gibi mikroorganizmalar da yaşantılarını devam ettirebilmek için besin ve dolayısıyla enerjiye ihtiyaç duymaktadır. Besi ortamında bulunan karbon kaynağı, azotlu bileşikler ve çeşitli mineraller mikroorganizmaların yaşam döngülerini sürdürebilmeleri için gerekli olan faktörlerdir. Mayaların solunum yapabilmeleri için oksijene de ihtiyaçları vardır. Eğer çoğalma ortamında yeterli oksijen yoksa maya etanol üreterek çoğalmaya devam eder. Ortamdaki etanol derişimi % 5’ in üzerine çıkarsa, etanol oluşumu maya gelişimi açısından toksik etki yaratır.

Maya çoğaltılacak olan biyoreaktöre beslenen oksijen miktarı, besi ortamındaki bileşenler (derişimleri, pH’ı vb.) önem arz etmektedir. Üretilecek mikrooganizmanın uygun şartlarda çoğaltılması, beta glukan üretim verimi açısından da önemli olduğu için yukarıda bahsedilen parametreler dikkatle belirlenip, o şartlarda çoğaltma işlemi gerçekleştirilmelidir.

 Hücre duvarı parçalanması ve ekstraksiyon işlemi

Üretimi sağlanan maya hücrelerinin hücre duvarından beta glukan elde edilebilmesi için ekstraksiyon işlemi gereklidir. Ekstraksiyon işlemine başlamadan önce, ekstraksiyon işleminde kullanılacak olan kimyasalların hücreye nüfuz edebilmesi için mayaların hücre duvarlarının parçalanması gerekmektedir. Bu amaçla; ultrasonikasyon, katalitik otoliz (katalitik enzimlerle parçalama) ve homojenizasyon teknikleri kullanılmaktadır.

Ultrasonikasyonda şiddet ve süre önemlidir, homojenizasyon işleminde ise uygulama basıncı ve darbe sayısı önemlidir. Bu işlemler bittikten sonra hücreler artık mekanik olarak parçalanmış olup ekstraksiyon işlemine hazır hale getirilmiştir. Ekstraksiyon aşaması yapılan literatür araştırmaları sonucunda; ekstraksiyon amaçlı kimyasal, fiziksel

ve enzimatik metodlar yer aldığı görülmüştür. Yapılan çalışmalarda kullanılan ekstraksiyon yöntemleri aşağıda sıralanmıştır (Zhu vd. 2016).

 Sıcak su ekstraksiyonu

 Kızgın buhar ektraksiyonu

 Sıcak alkali (NaOH, KOH) ekstraksiyonu

 Sıcak asidik (HCl, HCOOH, H3PO4, CH3COOH) ekstraksiyonu

 Sıcak alkali ve asidik ekstraksiyon

 Enzim ekstraksiyonu

 Reflüks ekstraksiyonu

 Mikrodalga destekli ekstraksiyon (MAE)

 Ultrasonik destekli ekstraksiyon (UAE)

 Hızlandırılmış çözücü ekstraksiyonu (ASE)

Du ve arkadaşlarının 2014 yılında yapmış olduğu çalışmalarda MAE, UAE, ASE ve geri-akımlı ekstraksiyon yöntemleri karşılaştırılmıştır. Beta glukan ekstraksiyon veriminin en yüksek olduğu yöntem ASE yöntemi olarak görülmüştür.

Kimyasal uygulamaların çoğu yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilmektedir. Asidik ekstraksiyonda yapılan çalışmalarda önceden HCl çözeltisi kullanılmıştır. Ancak toksik etkisinden dolayı tıbbi uygulamalarda yararlanılan beta glukanın ekstraksiyonunda kullanılmasının sakıncalı olduğu görülmüştür.

Fiziksel izolasyonda; katalitik otoliz, plazmoliz, homojenizasyon gibi yöntemler kullanılmaktadır. Enzimatik olarak ise, doğal enzimler yoluyla yüksek verim ve saflıkta beta glukan elde edilebildiği görülmüştür (Freimund vd. 2006, Tangüler ve Erten 2006).

Enzimatik hidroliz işleminde %99 saflık oranına ulaşılabildiği de eklenmiştir (Zhu vd.

2016).

Günümüzde; hücre içi materyali uzaklaştırmak ve ekstraksiyonu sağlamak amacıyla süperkritik ekstraksiyon yönteminin yanında yaygın olarak PEF (Pulsed Electric Fields) yöntemi kullanılmaktadır.

 Ayırma ve saflaştırma

Hücre duvarında yer alan protein, kitin ve yağın uzaklaştırılarak, beta glukanın daha saf eldesi amaçlanmaktadır. Bu amaçla süzme, santrifüj, diyaliz, ultrafiltrasyon, izoelektrikle çöktürme, enzim uygulamaları ve kromatografik yöntemler uygulanmaktadır. Literatürdeki çalışmalarda uygulanmış olan bazı kromatografik yöntemler; afinite, iyon değiştirme, kolon (Sephadex kolonu), jel filtrasyon kromatografisidir (Zhu vd. 2016).

 Kurutma aşaması

Beta glukanların kullanılabilir forma gelebilmeleri, taşınabilmeleri ve depolanabilmeleri için kurutulmaları gerekmektedir. Bu amaçla uygulanan kurutma yöntemleri; açık havada kurutma, liyofilizasyon (dondurarak kurutma) ve püskürtmeli kurutmadır (Zechner-Krpan vd. 2009). Liyofilizasyon yönteminde ilk olarak numunenin içerisinde bulunan su dondurulur. Daha sonra buz haline gelmiş su, düşük basınçlı bir ortamda, sıcaklık artışı oldukça yüksek enerjide oldukları için doğrudan buharlaşır. Püskürtmeli kurutmada ise kurutulacak numune çok küçük damlacıklar halinde sıcak hava akımı içerisine gönderilerek çözeltinin buharlaşması sağlanır.

3.6 Beta Glukan Üretim Verimini Etkileyen Faktörler

Mikroorganizmanın aktif bir şekilde çoğalmasının sağlanması ve ekstraksiyon işlemlerinin belirli şartlarda uygulanması sonucunda en saf beta glukan elde edilebilir.

Literatürdeki çalışmalarda beta glukan verimleri elde ediliş yöntemlerine göre farklı şekillerde ifade edilmektedir. Bunlar; g beta glukan/g hücre, µg/mg, µg/mL, % (w/w) olarak verilebilir. Bu tez çalışması kapsamında beta glukan verimi; g kuru maya kütlesi başına, g yaş beta glukan kütlesi olarak hesaplanmış ve Eşitlik 3.1’de verilmiştir.

( )

( ) (3.1)

Beta glukan üretim verimi aşağıda detaylı olarak açıklanan maya çoğalması ve beta glukan ekstraksiyonunu etkileyen faktörlere bağlıdır.

3.6.1 Maya çoğalmasını etkileyen faktörler

Çoğalma koşulları aşağıda verilen parametrelere bağlı olarak maya gelişimini ve beta glukan yapısını (dallanma derecesi, bağlı olan glikoz monomer sayısı vb.) etkilemektedir.

 Sıcaklık Etkisi: Mikroorganizma büyümesini en çok etkileyen, en önemli fiziksel parametrelerden biri sıcaklıktır. Hücre gelişimini, çoğalmalarını, çeşitli metabolik aktivite yol izlerini belirleyen önemli bir etkendir (Walker 1999). Mikroorganizma çoğaltılacak olan bir biyoreaktörde uygun bir sıcaklık söz konusu değilse;

mikroorganizmalar normal büyüme, gelişme ve çoğalma gibi yaşamsal faaliyetlerini gerçekleştiremeyebilirler. Laboratuvar şartlarında üretilen ya da endüstriyel olarak üretilen mayaların genel olarak optimum çoğalma sıcaklıkları 20-30 °C aralığında değişmektedir. Her mikroorganizmanın kendine özgü bir Tmin, Tmax ve Toptimum

sıcaklık değerleri vardır. Tmax değerleri maya türlerinde 20-50 °C arasında değişiklik göstermektedir. Örneğin; Saccharomyces cerevisiae mayasının Tmax değerleri 35-43

°C aralığındadır. Tmax değerleri türlere göre değişiklik gösterdiği gibi mayanın çoğalma ortamı faktörlerine (karbon kaynağı, oksijen derişimi, su ve etanol derişimleri) göre de değişiklik gösterebilmektedir. Yüksek sıcaklıklar mayalarda çeşitli enzimlerin salgılanmasına engel olabilir, hatta enzim yapılarının bozulmasına sebep olabilir. Yüksek sıcaklıklar mayaların hücre gelişimi olmadan çoğalmalarına sebep olmaktadır. Ayrıca besi ortamında ise çoğalma esnasında yüksek oranlarda alkol oluşmaktadır ve besi ortamında yüksek derişimlerde bulunan alkol miktarının maya çoğalmasını inhibe edici bir etkisi vardır (Uscanga ve François 2003).

 pH: Mayaların çoğaldığı besi ortamı pH’ı hücre büyümesi ve hayatlarını sürdürebilmeleri için önemli bir faktördür. Mayalar genel olarak en iyi büyüme evrelerini 4.5-6.5 pH’ta göstermektedir (Lopez vd. 2009). Bazı maya türleri 3-8

pH’ta da çoğalabilmektedir (Walker 1999). Çoğalma esnasında ortamda oluşan karbondioksit ve ikincil metabolitler ortam pH’ını düşürmektedir. Besi ortamındaki pH düşüşünden mikroorganizmalar negatif yönde etkilenir ve çeşitli ürünlerin verimini etkiler (Morata ve Loira 2017). Besi ortamını asidik hale getirmek için organik asitler (asetik asit, laktik asit gibi) yerine asitler (hidroklorik asit, fosforik asit gibi) tercih edilmelidir. Çünkü organik asitlerin mikroorganizma büyümesini inhibe edici özellikleri, inorganik asitlere göre daha yüksektir (Walker 1999).

 O2 derişimi: Mayalar fakültatif olarak adlandırılan; hem oksijenli hem de oksijensiz solunum yaparak çoğalan mikroorganizmalardır. Besi ortamında yeterli miktarda oksijen varsa, uygun havalandırma koşulları söz konusu ise; mikroorganizma çoğalması sonucu ortamda su ve karbondioksit oluşur. Besi ortamında oksijen bulunmadığı takdirde ise etil alkol ve karbondioksit artışı olmaktadır.

Havalı ortamda (mikroorganizma oksijenli solunum yapıyorsa);

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6 H2O + 688 kcal (3.2)

Havasız ortamda (mikroorganizma oksijensiz solunum yapıyorsa);

C₆H₁₂O₆ 2C₂H₅OH+6CO₂ + 6 H₂O + 56 kcal (3.3)

Maya çoğaltılan biyoreaktöre beslenen hava ile ortama verilen oksijen, sıvı besi ortamında çözünerek mikroorganizmalar tarafından enerji üretmek için kullanılır.

Maya üretimi yapılırken uygun amaca yönelik bir yöntem seçilmelidir. Örneğin bira üretiminde oksijensiz solunum şartları sağlanmalı, maya üretiminde ise oksijenli solunum koşulları sağlanmalıdır (Yılmazer 2009).

Çözünmüş oksijen; aerobik fermantasyonlarda mikroorganizmaların besinleri kullanabilmeleri ve metabolik faaliyetlerini devam ettirebilmeleri için gerekli olan temel ve önemli bir substrattır. Oksijen suda kısmen çözündüğünden (oksijenin sudaki çözünürlüğü: 30 °C’ de 8 mg/L) sınırlayıcı substrat olabilir (Shuler ve Kargi

1992). Yüksek hücre derişimlerinde; oksijen tüketim hızı, oksijen sağlama hızından büyük olduğunda oksijen kısıtlaması ortaya çıkmaktadır.

Besi ortamındaki çözünmüş oksijen derişimi (DO), kritik değerin altına (doygunluk değerinin %5-10’u) düştüğünde, S. cerevisiae mikroorganizması

oksijensiz solunum yapmaya yani etanol üretmeye başlar. Ortamdaki etanol konsantrasyonu eğer % 5’in üzerindeyse, etanol mayalar için inhibe edici özelliktedir (Shuler ve Kargi 1992). Hacimsel olarak % 25 etanol içeren ortamda yaşayabilen bazı maya türleri de mevcuttur (Soyuduru 2007).

Çözünmüş oksijen derişimi ya da oksijen kısmi basıncı glikoliz (glikoz yıkılması) hızını düzenleyici bir etkiye sahiptir. Mikroorganizmanın anaerobik solunumdaki glikoz tüketim hızı, aerobik solunumdaki glikoz tüketim hızından daha fazladır.

Fermantatif şeker metabolizmasının, oksijen tarafından inhibe edilmesine “Pasteur Etkisi” adı verilmektedir. Çözünmüş oksijen derişiminin düşük olduğu durumlarda substrat tüketimi ve karbondioksit oluşum hızı azalır. Düşen glikoz tüketim hızı enzim yarışması teorisi ile açıklanmaktadır. Fermantasyon prosesinde glikoz eğer çok fazla ise Pasteur etkisi S. cerevisiae’de geçerliliğini yitirir (Walker 1999).

Ayrıca oksijenin mikroorganizma hücre duvarı ve hücre zarı oluşumunda önemli bir etkisi bulunmaktadır. Oksijen derişim farklılıkları mikroorganizma üzerinde strese sebep olmakta ve hücrelerde bu stres unsuruna karşı çeşitli adaptasyonlar görülmektedir (Gibson 2007). Oksijen stresine karşı göstermiş olduğu cevap yöntemleri hücre duvarı bileşenlerinin üretiminde de etkilidir. Örneğin; bira mayasında hücre zarı biyosentezini sağlamak için fermantasyondan önce oksijen gereksinimi vardır. Yeterli moleküler oksijenin sağlanamaması, hücre zarlarını etanol toksisitesine daha duyarlı hale getirecek ve bu da maya büyümesini ve mayanın fermantasyon kabiliyetini kısıtlayacaktır (Walker 1999).

Bu tez çalışması kapsamında istatistiksel deneysel tasarım deneylerinde yanıt olarak oksijen tüketimine bağlı beta glukan verimi de tanımlanmış, Eşitlik 3.4’te verilmiştir.

( )

(3.4)

 Karbon kaynağı ve derişimi: Besi ortamında mikroorganizma gelişimine en büyük etkide bulunan, enerji kaynağı olarak da kabul edilen karbon kaynaklarıdır.

Genellikle maya üretiminde glikoz karbon kaynağı olarak kullanılmaktadır.

Mayaların kullanabildiği karbon kaynaklarının bazıları; fruktoz, galaktoz, maltodekstrinler, nişasta, metanol, etanol, gliserol, asetat, sitrat, oleatlar, fenoller, ürik asit, pentilamindir (Walker 1999). Mayadan hangi ürün elde edilmek isteniyorsa, substrat seçimi de o yönde olmalıdır. Örneğin; Saccharomyces cerevisiae mayasını verimli bir şekilde çoğaltmak ve iyi bir fermantasyon sağlamak amacıyla; glikoz, fruktoz, mannoz, galaktoz, sükroz ve maltoz şekerleri kullanılmalıdır. Eğer mayanın solunum yapması amaçlanıyorsa; etanol, asetat gibi karbon kaynakları kullanılmalıdır. Çeşitli çalışmalarda karbon kaynağı türünün maya çoğalmasına ve çeşitli hücre materyallerine etkisinin çok ciddi boyutlarda olduğu belirtilmiştir (Uscanga ve François 2003).

Karbon kaynağı derişiminin fazla olması mikroorganizmalarda inhibisyona sebep olmaktadır. Mikroorganizma çoğaltılan bir biyoreaktörde substrat derişiminin fazla olması, diğer bir deyişle mayaların aşırı şekere maruz kalması; ortamda oksijen olsa dahi mayaların oksijensiz solunum yapmasına ve etanol üretilmesine sebep olur. Bu etkiye “Crabtree Etkisi” adı verilmiştir (Walker 1999). Mikroorganizma üretmek amacıyla çalışılıyorsa, bu duruma dikkat edilmelidir. Bu etki Pasteur Etkisi’nin tersi olarak da adlandırılmaktadır. İnhibisyon sınırları maya türünden, substrat türüne değişiklik göstermektedir. Maya üretiminde, havalı koşullarda glikoz derişimi üst sınırının 200 g/L olduğu belirtilmektedir (Shuler and Kargi 1992).

Bu tez çalışması kapsamında istatistiksel deneysel tasarım deneylerinde de diğer bir yanıt olarak da substrat tüketimine bağlı beta glukan verimi de tanımlanmış, Eşitlik 3.5’te verilmiştir.

( )

(3.5)

 Besi ortamı bileşimi: Besi ortamında bulunan bileşikler ve bileşimleri Bölüm 4.2’ de detaylı olarak verilmiştir.

 Karıştırma hızı: Mikroorganizmanın çoğaltılacağı biyoreaktörde bir karıştırıcı varsa onun hızı ve tipi önemlidir. Karıştırma hızının çok yüksek olması durumunda hem biyoreaktörde vorteks oluşumu gerçekleşebilir hem de mikroorganizma hücreleri zarar görebilir. Mikroorganizma üzerinde stres yaratabilir ve bu negatif etkiler çeşitli şekillerde (mikroorganizma çoğalmasının azalması, canlı hücre sayısının azalması vb.) gözlemlenebilir.

 Biyoreaktör işletim türü: Biyoreaktör işletim türleri kesikli, yarı-kesikli, sürekli ve immobilize işletim olmak üzere dörde ayrılmaktadır.

Kesikli işletim genel olarak endüstriyel üretimlerde kullanılmaktadır.

Mikroorganizma aktivitesini kaybedene kadar çoğalma işlemi sürdürülür, daha sonra biyoreaktörde istenilen mikroorganizma yoğunluğuna ya da istenilen ürün derişimine ulaşıldığı anda reaktör tamamen boşaltılır ve tekrar sterillenir.

Mikroorganizma ve besi ortamı biyoreaktöre t=0 st anında beslenir ve fermantasyon işlemi boyunca biyoreaktöre herhangi bir besleme yapılmaz. Mayanın oksijenli solunum yapılması isteniyorsa biyoreaktöre sadece hava beslemesi yapılır.

Geleneksel bira mayalama işlemi bu işletim türünde gerçekleştirilir.

Yarı-kesikli işletimde fermantasyon boyunca karbon kaynağı (substrat) beslemesi yapılmaktadır. Biyoreaktörde çoğalma devam ettikçe toplam hacim zamanla

artmaktadır. Endüstride ekmek mayası üretiminde kullanılmaktadır (Yılmazer 2009).

Sürekli işletimde; biyoreaktöre substrat beslemesi yapılır, ürün de biyoreaktörden uzaklaştırılır. Genellikle fabrikaların arıtma tesislerinde kullanılan bir işletim türüdür (Walker 1999, Kim ve Yun 2006).

İmmobilize işletim; mikroorganizmalar fiziksel olarak biyoreaktör içinde alıkonularak uygulanır. Kesikli işletim türünün ekonomik olmaması üzerine yeni yöntem arayışları sonucu immobilize hücre teknolojisi geliştirilmiştir. Reaktördeki hücre yoğunluğu arttıkça, reaktör verimliliği de artmaktadır. Biyoreaktörde; hücreler biyoreaktör dışına süpürülmeden yüksek substrat akış oranlarının uygulanmasına olanak sağlanmaktadır. Kontaminasyon riski daha düşüktür. İhtiyaç duyulan reaktör hacmi, kesikli işletim türüne göre daha küçük olduğu için, yatırım maliyeti de düşük olacaktır. İyon değiştirici reçine, jelatin ve glutaraldehit, odun yongası, kalsiyum aljinat, pektin vb. gibi taşıyıcılara bağlanarak immobilize edilmiş hücreler ile

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ (sayfa 25-0)